Financiamento fornecido pelo NIH (1 K08 DK080221-01) e fundos de desenvolvimento institucional Vanderbilt.

Parte 1: Lesão Modelo de Colite <ol><li> Peso inicial deve ser obtido para cada rato antes do início do tratamento DSS. </li><li> Fazer uma de 3% (w / v) Sulfato de Dextran solução de sal de sódio em água e filtrar com um filtro de 0,45 mM de acetato de celulose. </li><li> Substituir a água potável na gaiola do rato com a solução DSS 3% por quatro dias. Os ratos não devem ter acesso a qualquer outra fonte de água (ou seja, a exclusão dicas colocados em sistemas de rega automática). </li><li> No dia quatro, substitua a solução DSS com água por mais três dias, permitindo alguma recuperação do cólon epiteliais. Os ratos devem ser pesados ​​no dia quatro, a fim de quantificar conseqüências sistêmicas da colite. Perda de peso é comum com ferimentos graves. </li><li> No dia 7, pesar e sacrifício dos ratos. Ratos podem ser sacrificados por overdose inalatória de isoflurano, ou outros institucionalmente, IACUC métodos aprovados. </li></ol> Parte 2: Necropsia e Colheita de Colon <ol><li> Expor o lado ventral do rato e pernas seguro para garantir o acesso livre para o abdômen. Molhar o abdômen completamente com álcool 70%. </li><li> Segure a linha média do abdómen com uma pinça e estender para cima, assim tenting a pele. Use uma tesoura de ponta fina para o abdômen inciso expondo o conteúdo abdominal. Estender a incisão para a ponta do apêndice xifóide na linha média e depois estender ao longo do aspecto inferior das margens costal, bilateralmente. </li><li> Identificar o intestino delgado, ceco e cólon. Dissecar cuidadosamente / provocação do cólon a partir do mesentério circundante. Transecto do cólon profundamente na pelve, para libertar o cólon distal e reto. Transecto os dois pontos na margem colonocecal para libertar o cólon proximal. Cuidados devem ser tomados durante este processo para não danificar o colon como a limpeza do cólon será problemático se ocorrer perfuração. </li><li> Utilizando uma agulha 20G alimentação e seringa de 10 ml, entubar e lave o cólon com gelado PBS até que o eluido está completamente limpa de fezes. </li><li> Neste ponto, se a análise macroscópica com um microscópio de dissecação é desejado, os dois pontos podem ser fixados como &quot;lingüiça&quot;. Se a análise histológica é apenas desejável do que prosseguir para a Parte 4 &quot;Fazendo Rolls Suíça para a análise histológica de colite aguda&quot;. </li></ol> Parte 3: Processamento como &quot;Lingüiça&quot; para análise macroscópica de todo o cólon <ol><li> É importante manter a correta orientação do cólon, portanto, manter a extremidade distal do cólon mais próximo do operador. Corte dois pedaços de sutura não absorvível (SP116 1,5 seda trançada métricas), uma polegada de aproximadamente 1 em comprimento, os outros 2 polegadas. </li><li> Use a peça 2 polegada de sutura para amarrar a extremidade distal mais próximo à margem quanto possível, mantendo uma boa vedação. </li><li> Coloque uma agulha 20G alimentação contendo 5 ml de tampão fosfato 10% de formol na extremidade proximal do cólon. Vagamente empate a parte restante da sutura imediatamente proximal ao bulbo da agulha de alimentação. Segure firmemente os dois pontos no bulbo da agulha de alimentação e infundir formalina até o cólon é expandido. Apertar o nó na sutura que você retire a agulha de alimentação, deixando a infusão de cólon, expandiu como um &quot;salsicha&quot;. </li><li> Encha um tubo de 15 ml com 10% de fosfato tamponada de formalina e coloque os dois pontos no tubo. Correção para 24 horas. </li><li> Deitar fora formalina e substituir com EtOH 70% para um 24 horas adicionais. (Colons podem ser armazenados em EtOH 70% indefinidamente à temperatura ambiente.) </li><li> Remova os dois pontos do tubo cônico e cortou as cordas em cada extremidade com um bisturi, tomando cuidado para não danificar o colon. Lembre-se que a extremidade distal tem o maior pedaço de corda. Corte longitudinal do distal para extremidade proximal do cólon para que forme uma longa folha. Neste ponto, o cólon pode ser visto sob um microscópio de dissecação. </li></ol> Parte 4: Making Rolls Suíça para a análise histológica de colite aguda <ol><li> É importante manter a correta orientação do cólon, portanto, manter a extremidade distal do cólon mais próximo do operador. </li><li> Meça o comprimento do cólon. Esta métrica é um indicador da gravidade da lesão. Colite aumenta edema e encurta o comprimento do cólon em geral. </li><li> Usando uma tesoura de ponta fina, inciso longitudinalmente de distal para proximal final do cólon. Use uma pinça bem cotado para agarrar a borda da incisão e aberto lateralmente trabalhando o seu caminho distalmente-&gt; proximalmente, assim, mostrando o cólon como uma folha plana. </li><li> Rolando o cólon exige um par de fórceps e uma técnica de duas mãos. Segure a borda da margem distal com uma pinça. Proceder à seqüencialmente rolo do cólon através da rotação e liberando a pinça de prosseguir para a margem proximal. Gerando assim uma espiral com uma terceira dimensão ou &quot;Swiss roll&quot;.Para manter a forma rolada, segure o rolo com firmeza com uma pinça e transectos com uma agulha 27G1 / 2. Segura a agulha, dobrando a agulha que sai do rolo. </li><li> Coloque o rolo em uma fita de tecido devidamente rotulados e coloque em um frasco de 10% de fosfato tamponada de formol em temperatura ambiente por 24 horas para garantir a fixação do tecido. </li><li> Deitar fora formalina e substituir com EtOH 70% para um 24 horas adicionais. (Colons podem ser armazenados em EtOH 70% indefinidamente à temperatura ambiente.) </li><li> Uma vez que a amostra foi corrigido, ele pode ser incluído em parafina, seccionado e montado em lâminas para análise histológica. </li></ol> Parte 5: Resultados Representante O modelo DSS para a colite aguda permite ao pesquisador obter, corrigir e analisar dois pontos que a colite aguda modelos. Quando o rolo suíço é cortado e montado, ele deve formar uma fatia representativa de todo o cólon, se rolou corretamente (Figura 1). O rolo montado podem ser marcadas com H &amp; E, a fim de determinar a extensão dos danos para o cólon, desde o final (para dentro) distal até o final (fora) proximal (Figura 2). Imunohistoquímica também pode ser realizada no rolo suíço para identificar e quantificar infiltrados inflamatórios. Se o método de lingüiça foi realizado corretamente, os dois pontos fixos será dilatada e toda a superfície da mucosa pode ser facilmente manipulado e visto sob o microscópio de dissecação (Figura 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1652/1652fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1652/1652fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" /></a> Figura 1. Corretamente executados &quot;Swiss roll&quot;. (A) Os dois pontos são rolados do distal para proximal final, seccionado com uma agulha e garantidos por dobrar a ponta da agulha. Em seguida, é colocada em um cassete de tecido para fixação. (B) H &amp; E manchada seção 5 mM de um rocambole feito a partir do cólon de um rato tratados com DSS (d = cólon distal p = cólon proximal). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1652/1652fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1652/1652fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" border="0" /></a> Figura 2. Colons DSS tratados mostrar sinais de colite aguda. Inflamação e danos cripta são aparentes no cólon DSS-tratados em comparação com um controle de água tratada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1652/1652fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1652/1652fig3tmb.jpg" alt="Figura 3" border="0" /></a> Figura 3. Um exemplo de uma &quot;salsicha&quot;. A salsicha infundido com formalina e completamente expandidas. Um leve ângulo estará presente secundária à curvatura natural do cólon. A salsicha aberta deve estar nivelado.

<ol>
	<li>Okayasu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+in+the+induction+of+reliable+experimental+acute+and+chronic+ulcerative+colitis+in+mice.">A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.</a> Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).</li><li>Martinez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+Mtgr1+sensitizes+the+colonic+epithelium+to+dextran+sodium+sulfate-induced+colitis.">Deletion of Mtgr1 sensitizes the colonic epithelium to dextran sodium sulfate-induced colitis.</a> Gastroenterology. 131 (2), 579-588 (2006).</li><li>Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+"Swiss+roll":+a+simple+technique+for+histological+studies+of+the+rodent+intestine.">The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine.</a> Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).</li><li>Mahler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+susceptibility+of+inbred+mouse+strains+to+dextran+sulfate+sodium-induced+colitis.">Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis.</a> Am J Physiol. 274, G544-551 (1998).</li><li>Aharoni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+therapeutic+effect+of+glatiramer+acetate+on+several+murine+models+of+inflammatory+bowel+disease.">Immunomodulatory therapeutic effect of glatiramer acetate on several murine models of inflammatory bowel disease.</a> J Pharmacol Exp Ther. 318 (1), 68-78 (2006).</li><li>Hahm, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+transforming+growth+factor+beta+signalling+in+the+intestine+contributes+to+tissue+injury+in+inflammatory+bowel+disease.">Loss of transforming growth factor beta signalling in the intestine contributes to tissue injury in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 49 (2), 190-198 (2001).</li><li>Green, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenergic+modulation+of+Escherichia+coli+O157:H7+adherence+to+the+colonic+mucosa.">Adrenergic modulation of Escherichia coli O157:H7 adherence to the colonic mucosa.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 287 (6), G1238-1246 (2004).</li><li>Dieleman, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+experimental+colitis+induced+by+dextran+sulphate+sodium+(DSS)+is+characterized+by+Th1+and+Th2+cytokines.">Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines.</a> Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).</li></ol>

Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Vanderbilt IACUC.

Este protocolo pode ser modificado para modelo de lesão aguda, lesão de reparação, ou crônica processos de lesão do cólon. Modificação lesão aguda: DSS ad lib tratamento para 4-6 dias, seguido pelo sacrifício imediato Lesão-Modificação: Lesões com 4-6 dias de tratamento DSS seguido por período de recuperação de 3-4 dias e sacrifício (como descrito no protocolo acima). ...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dextran Sulfate Sodium Salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB Corp</td>
<td>9011-18-1</td>
<td>mol wt 40,000-50,000</td>
</tr>
<tr>
<td>10% Buffered Formalin Phosphate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>SF100-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane, USP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Phoenix Pharmaceuticals</td>
<td>NDC 57319-474-06</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TISSUE PATH Macrosette Cassettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Healthcare</td>
<td>15182706</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD 10 ml Syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>B-D</td>
<td>309604</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethyl Alcohol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pharmco-Aaper</td>
<td>E190</td>
<td>Dilute to 70% with distilled water</td>
</tr>
<tr>
<td>20G Straight Feeding Needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>20068-612</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>27G1/2 PrecisionGlide Needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>B-D</td>
<td>305109</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting Scissors Sharp/Blunt Tip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>82027-588</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Waugh Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>82027-428</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-absorbable Suture </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>LOOK Surgical Specialties</td>
<td>SP116</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Whatman Blotting Paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>28298-020</td>
<td>Cut as needed</td>
</tr>
<tr>
<td>Nalgene Surfactant-Free Cellulose Acetate (SFCA) Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cole-Parmer</td>
<td>EW-06731-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Carbon fiber composites digital caliper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>15-007-958</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

murine colitis modeling using dextran sulfate sodium (dss)

Colite pode ocorrer por infecções virais ou bacterianas, insulto isquêmico, ou doenças auto-imunes; Colite Ulcerativa e mais notadamente a variante do cólon da doença de Crohn - Colite de Crohn. Colite aguda podem apresentar dor abdominal e distensão, má absorção, diarréia, hematoquezia e muco nas fezes. Estamos começando a entender as complexas interações entre o meio ambiente, genética e disfunção da barreira epitelial em modelos de doença inflamatória intestinal e animal de colite têm sido essenciais para fazer avançar a nossa compreensão da doença. Um modelo popular envolve completando a água potável de camundongos com sulfato de baixo peso molecular de sódio Dextran (DSS), resultando em danos epiteliais e uma resposta robusta inflamatória no cólon de vários dias<sup&gt; 1</sup&gt;. Variações dessa abordagem pode ser usada para modelo de lesão aguda, lesão aguda seguida de reparo, e ciclos repetidos de DSS intercaladas com recuperação de modelagem doenças inflamatórias crônicas<sup&gt; 2</sup&gt;. Após um tratamento de quatro dias de DSS 3% em água potável, os camundongos mostram sinais de colite aguda, incluindo a perda de peso, sangue nas fezes e diarréia. Os ratos são sacrificados na conclusão do curso de tratamento e em dois pontos necropsia dissecados são processados ​​e pode ser &quot;enrolado suíço&quot;<sup&gt; 3</sup&gt; Para permitir a análise microscópica de todo o cólon ou infundido com formol como &quot;lingüiça&quot; para permitir a análise macroscópica. Tecido é então embebidos em parafina, seccionados e corados para análise histológica.

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Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium DSS

Dextran sulfato de sódio (DSS), administrada na água de beber é um modelo de lesão inflamatória estabelecida murino de colite aguda. Este protocolo descreve o método para o tratamento DSS ea preparação dos tecidos.

Modelagem Colite murino utilizando Dextran Sulfato de Sódio (DSS)

Colitis can occur from viral or bacterial infections, ischemic insult, or autoimmune disorders; most notably Ulcerative Colitis and the colonic variant of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS)

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