Comece colocando um rato macho eutanasiado de sete a oito semanas em uma superfície de bancada limpa. Corte a pele abdominal do rato com uma tesoura em direção ao abdómen inferior. Excisar o tecido adiposo da parte interna das coxas.
Coloque o tecido excisado no tubo C sobre gelo contendo 2,5 mililitros de uma mistura enzimática das enzimas D, R, A e 2,35 mililitros de DMEM/F12 sem SFB ou antibióticos. Com tesoura, corte o tecido adiposo em pedaços de aproximadamente dois milímetros quadrados. Feche bem a tampa do tubo C e inverta o tubo.
Fixe o tubo à manga de um dissociador de tecido e digerir as amostras a 37 graus Celsius durante 40 minutos. Em seguida, pré-aqueça o meio DMEM/F12 contendo FBS e antibióticos a 37 graus Celsius. Após a incubação, remova o tubo C do dissociador de tecido e interrompa a digestão adicionando cinco mililitros de DMEM/F12 com FBS e antibióticos.
Pipetar suavemente quatro vezes. Centrifugar a suspensão a 700 g durante 10 minutos a 20 graus Celsius. Sem perturbar a paleta celular, aspirar cuidadosamente o sobrenadante.
Ressuspender o pellet em 10 mililitros de DMEM/F12 contendo FBS e antibióticos, e pipetar suavemente cinco vezes. Filtre a suspensão celular através de um filtro de células de 70 mícrons de diâmetro colocado em um tubo de 50 mililitros. Centrifugar o filtrado a 250 g durante cinco minutos.
Ressuspenda o pellet em 10 mililitros de PBS. Antes de chapear, centrifugar a suspensão celular a 500 g durante cinco minutos. Descarte o sobrenadante.
Ressuspender o pellet em 10 mililitros de DMEM/F12 contendo FBS e antibióticos. Misture pipetando a suspensão suavemente, 10 vezes. Prato de 10 mililitros da suspensão em um prato revestido de colágeno de 10 centímetros.
Coloque o prato em uma incubadora de cultura de células. Aspirar o meio e lavar as células três vezes com três mililitros de PBS por lavagem. Adicione 10 mililitros de DMEM/F12 contendo FBS e antibióticos e incube.
A coloração Oil Red O mostrou adipócitos carregados de lipídios sete dias após a indução da diferenciação dos adipócitos. O grau de diferenciação completa foi confirmado pela análise da expressão de RNAm dos reguladores da adipogênese. A rosiglitazona induziu um efeito dose-dependente nos níveis de expressão de genes específicos da gordura marrom, como Ucp1 e Ppargc1a.
No entanto, para Fabp4, o efeito saturado na concentração de rosiglitazona de 0,1 micromole. Os adipócitos diferenciados podem ser usados para várias análises funcionais e mecanísticas, como análise da taxa de consumo de oxigênio e imunoprecipitação da cromatina.
