저자는 실험 지원에 대해 Takahito Wada와 Saiko Yoshida (일본 도쿄 도쿄 대학)에게 감사의 말을 전합니다. 이 연구는 Y.H.에 대한 다음과 같은 보조금으로 자금을 지원받았습니다: 도쿄 대학 우수 젊은 연구원 프로그램의 연구 보조금; 일본 과학 진흥회 (JSPS) KAKENHI 초기 경력 과학자 보조금, 보조금 번호 19K17976; 일본 응용 효소학 재단의 미래 당뇨병 연구(FFDR)의 선두주자에 대한 보조금, 보조금 번호 17F005; 약리학 연구 재단의 보조금; 의학 및 제약 연구를 위한 모치다 기념 재단의 보조금; MSD 생명 과학 재단의 보조금; 다이와 증권 건강 재단의 보조금; 도쿄 생화학 연구 재단의 보조금; 다케다 과학 재단 (Takeda Science Foundation)의 생명 과학 연구 보조금; SENSHIN Medical Research Foundation의 보조금.

이 프로토콜에 설명된 모든 동물 실험은 도쿄 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았으며 도쿄 대학의 기관 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 효소액 및 배지의 제조
<ol><li>7-8주령 마우스의 사타구니 백색 지방 조직 양쪽(좌우, 약 150mg)과 효소 용액 2.5mL를 해리기의 튜브 C에 넣습니다.</li>
	<li>소 태아 혈청(FBS) 또는 항생제가 없는 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)/F12 3mL, FBS 또는 항생제가 없는 DMEM/F12 2.7mL의 효소 R, 완충액 A 1mL로 효소 A를 재구성합니다.</li>
	<li>효소 D 100μL, 효소 R 50μL, 효소 A 12.5μL, FBS 또는 항생제가 없는 DMEM/F12 2.35mL를 튜브 C에 넣어 효소액 2.5mL를 준비합니다.</li>
</ol>2. 지방 조직의 분리
<ol><li>7-8주령의 수컷 C57BL/6J 마우스(약 20g)를 자궁경부 탈구로 안락사시킵니다.</li>
	<li>깨끗한 벤치에서 사타구니 백색 지방 조직을 분리하기 위해 복부와 하지를 향해 뭉툭하고 날카로운 가위로 피부를 자릅니다. 날카롭고 날카로운 가위를 사용하여 허벅지 안쪽에서 지방 조직을 분리합니다. 사타구니 지방 조직의 한쪽은 ~75mg을 사용합니다.</li>
	<li>분리된 지방 조직을 얼음 위의 효소 용액과 함께 튜브 C에 넣고 튜브를 깨끗한 벤치 내에 보관하여 무균 상태를 유지합니다.</li>
</ol>3. 지방 조직의 다듬기 및 소화
<ol><li>클린 벤치에서 효소 용액 2.5mL를 튜브 C에 추가합니다.</li>
	<li>날카롭고 날카로운 가위로 50회 절단하여 지방 조직을 작은 조각으로 다집니다. 지방 조직을 ~2mm2 개로 자릅니다.</li>
	<li>튜브 C의 캡을 단단히 닫고 튜브를 거꾸로 뒤집어 캡을 씌운 상태에서 조직 해리기의 슬리브에 부착합니다. 그런 다음 37°C에서 ~40분 동안 샘플을 분해합니다. 참고: 이 연구에서는 히터가 있는 gentleMACS Octo Dissociator(Miltenyi Biotec 130-096-427)를 사용했으며 사전 설치된 프로그램 "37C_mr_ATDK_1"를 따랐습니다.</li>
</ol>4. 세포 현탁액의 여과
<ol><li>10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 DMEM/F12를 37°C로 예열합니다.</li>
	<li>조직 해리기에서 튜브 C를 분리하고 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM/F12 5mL를 추가하고 부드럽게 4회 피펫팅하여 분해를 중지합니다.</li>
	<li>20°C에서 10분 동안 700 x g 로 원심분리합니다.</li>
	<li>세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 흡인합니다.</li>
	<li>10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 DMEM/F12 10mL를 넣고 부드럽게 5회 피펫팅하여 펠릿을 재현탁합니다.</li>
	<li>새로운 50mL 튜브에 놓인 직경 70μm 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 여과합니다.</li>
	<li>250 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 펠릿을 10mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁합니다.</li>
</ol>5. 셀 도금
<ol><li>500 x g 에서 5분 동안 원심분리기.</li>
	<li>상층액을 제거하고 10% FBS와 12% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 DMEM/F10mL를 첨가하고 10회 피펫팅하여 펠렛을 다시 현탁합니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 10 cm 콜라겐 코팅된 접시에 접시에 담고 접시를 세포 배양 배양기(37°C, 5%CO2)에 1-2시간 동안 넣습니다. 참고: 콜라겐 코팅 접시가 반드시 필요한 것은 아닙니다. 그러나 경험에 비추어 볼 때 콜라겐 코팅 접시는 지방전구세포의 부착을 도와 세포의 생존을 증가시킵니다.</li>
	<li>배지를 흡인하고 세척 당 3mL의 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.</li>
	<li>10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 DMEM/F12 10mL를 넣고 접시를 세포 배양 배양기(37°C, 5%CO2)로 되돌립니다.</li>
</ol>6. 지방전구세포의 패시징
<ol><li>다음날, 배지를 흡인하고(세포가 부착되어 배지를 흡인할 수 있음), 세척당 3mL의 PBS로 세포를 두 번 세척하고, 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 10mL의 DMEM/F12를 추가합니다.</li>
	<li>세포가 80% 합류에 도달하면(보통 SVF 분리 후 4일) 세포를 4개의 10cm 콜라겐 코팅 접시로 나눕니다.<ol><li>구체적으로, 배지를 흡인하고, 세포를 PBS(실온[RT])로 세척하고, 예열된 0.05% 트립신 1mL를 첨가하고, 세포배양 배양기에서 5분 동안 배양한다.</li>
		<li>10% FBS와 10% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 DMEM/F12 10mL를 추가하여 트립신 활성을 소멸시킵니다. 피펫팅 후 440 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>상층액을 흡인하고 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 DMEM/F12 40mL를 추가하여 세포를 재현탁하고 10cm 콜라겐 코팅 접시 4개에 세포를 플레이트합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포가 80% 합류에 도달하면 다시 계대합니다.</li>
</ol>7. 지방전구세포의 불멸화를 위한 SV40 거대 T 항원을 발현하는 레트로바이러스의 제조(선택사항)
<ol><li>불멸화 최소 3일 전에 플레이트 백금-E(Plat-E) 패키징 셀 29를 항생제 없이 10% FBS가 포함된 DMEM2mL 에 3.0 x 105 cells/mL의 밀도로 패키징합니다. 혈구계를 사용하여 세포 수를 세십시오.</li>
	<li>다음날, 제조사의 지시에 따라 리포펙타민 2000을 사용하여 pBABE-neo largeTcDNA(유전자 플라스미드 #1780 추가) 4μg을 형질감염시킨다.</li>
	<li>24시간 후, 배지를 흡인하고 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM 2mL를 추가합니다.</li>
	<li>다음날, 레트로 바이러스 상청액을 수확하십시오. 레트로바이러스는 즉시 불멸화에 사용하거나 -80°C에서 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>8. SV40 큰 T 항원을 이용한 지방전구세포의 불멸화(선택 사항)
<ol><li>SVF 분리 후 지방전구세포를 2회 계대 및 확장시킨다.</li>
	<li>10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신과 함께 2mL의 DMEM/F12에 0.5-1.0 x 104 cells/mL의 밀도로 6웰 플레이트에 세포를 플레이트합니다. 혈구계를 사용하여 세포 수를 세십시오.</li>
	<li>다음날, 6-웰 플레이트의 웰 당 SV40 거대 T 항원을 발현하는 신선하거나 해동된 레트로바이러스 250μL를 준비한다. 440 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 새 튜브에 넣습니다.</li>
	<li>레트로바이러스 상층액 250μL당 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 750μL의 DMEM/F12와 1μL의 폴리브렌을 추가하여 작동하는 바이러스를 만듭니다.</li>
	<li>배지를 흡인하고 1,000 μL의 작업 레트로 바이러스를 지방 전구 세포가 들어있는 각 웰에 첨가하십시오.</li>
	<li>4시간 후에 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM/F12 1mL를 추가합니다.</li>
	<li>다음날 감염된 지방전구세포를 10cm 접시에 담아 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 500μg/mL 네오마이신이 함유된 DMEM/F12로 감염된 세포를 선별한다. 항생제 선택을 모니터링하려면 네오 마이신으로 감염되지 않은 세포 접시를 준비하십시오.</li>
	<li>모니터 접시에 있는 모든 감염되지 않은 세포가 죽을 때까지 감염된 세포를 네오마이신으로 계속 계대배양합니다.</li>
</ol>9. 지방세포 분화
<ol><li>세포를 플레이트하십시오. 12웰 플레이트의 경우, 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 DMEM/F12 1mL에 4.0 x 104 cells/mL의 밀도로 세포를 플레이트합니다.</li>
	<li>지방전구세포가 합류하게 되면(도금 후 48-72시간), 배지를 흡인하고 분화 배지로 교체합니다(조성은 표 1 참조).</li>
	<li>분화 2일째(즉, 분화 유도 후 48시간)에 배지를 유지 배지로 교체합니다(조성에 대해서는 표 1 참조). 그 후 2일마다 유지 보수 매체를 교체하십시오. 말단 분화는 분화 7일째에 달성됩니다.</li>
	<li>오일 레드 오 염색<ol><li>오일 레드 오 염색의 경우, 배지를 흡인하고 웰당 1mL의 PBS로 세포를 헹굽니다. 웰 당 4% 포름알데히드 1mL를 첨가하여 세포를 고정하고, RT에서 15분 동안 세포를 배양한다.</li>
		<li>인큐베이션 동안,ddH2O를 사용하여 0.5% 오일 레드 O 원액(이소프로필 알코올 중)을 0.3%로 희석하고, 여과지를 사용하여 작업 용액을 여과한다.</li>
		<li>15 분의 배양 후, 포름 알데히드를 제거하고, 60 % 이소 프로필 알코올로 세포를 헹구고, 여과 된 오일 레드 오 작업 용액 1 mL를 첨가하고, RT에서 1 시간 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>배양 후 흐르는 물로 세포를 씻으십시오. 그런 다음 도립 현미경(배율: 20x 대물렌즈 및 10x 접안렌즈)으로 지질이 함유된 지방 세포를 관찰합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>mRNA 발현 분석 참고: 이 연구에 사용된 프라이머 목록은 표 2 를 참조하십시오.<ol><li>배지를 흡인하고 1mL/웰의 트리졸을 웰에 추가합니다.</li>
		<li>RT에서 15분 동안 배양하고, 피펫팅으로 세포를 분리하고, 1.5mL 튜브에 샘플을 수집합니다. 샘플은 RNA 추출까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>냉동 샘플을 RT로 해동하고 200 μL의 클로로포름을 샘플에 첨가하고 15 초 동안 격렬하게 흔든다.</li>
		<li>샘플을 RT에서 3분 동안 인큐베이션한 다음, 4°C에서 15분 동안 20,000 x g 로 회전시킨다.</li>
		<li>수성 상 (상단, 무색)을 조심스럽게 제거하고 새 튜브로 옮깁니다. 단백질 상(중간, 흰색) 또는 페놀/클로로포름 상(하단, 분홍색)을 옮기지 마십시오.</li>
		<li>같은 양의 70% EtOH를 천천히 첨가하고 부드럽게 혼합합니다. 소용돌이치지 마십시오.</li>
		<li>샘플(최대 700 μL)을 수집 튜브에 장착된 RNA 스핀 컬럼에 로드합니다. 형성되었을 수 있는 침전물을 포함해야 합니다.</li>
		<li>4°C에서 30초 동안 9,000 x g 로 회전한 다음 플로우 스루를 버립니다.</li>
		<li>700μL의 버퍼 RW1을 추가하고 4°C에서 30초 동안 9,000 x g 로 회전한 다음 플로우 스루를 버립니다.</li>
		<li>컬럼을 새 수집 튜브로 옮기고 500μL의 버퍼 RPE를 추가합니다.</li>
		<li>4°C에서 30초 동안 9,000 x g 로 회전한 다음 플로우 스루를 버립니다.</li>
		<li>500μL의 버퍼 RPE를 추가하고 4°C에서 2분 동안 9,000 x g 로 회전한 다음 플로우 스루를 버립니다.</li>
		<li>컬럼을 새로운 수집 튜브로 옮기고, 4°C에서 1-2분 동안 9,000 x g 로 스핀(완충액이 없는 컬럼)한다.</li>
		<li>컬럼을 새로운 1.5mL 수집 튜브로 옮기고 30μL의 RNase가 없는 물을 컬럼 멤브레인에 직접 추가합니다.</li>
		<li>샘플을 RT에서 1-2분 동안 배양합니다. 그런 다음 4°C에서 1분 동안 9,000 x g 로 회전시켜 RNA를 용출시킵니다.</li>
		<li>형광 분광계를 사용하여 RNA 농도를 확인합니다. 알림: 여기에 농도를 맞추는 것이 좋습니다.</li>
		<li>~200ng의 RNA 템플릿을 사용하여 역전사를 수행합니다. 상용 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(qPCR-RT) 키트를 사용하고 제조업체의 프로토콜을 따르십시오. 반응 후 cDNA를 200 μL로 20배 희석한다.</li>
		<li>384웰 플레이트의 각 웰에 cDNA 2.0μL, Power Sybr Green Master Mix 3.0μL, 100μM qPCR 정방향 프라이머 0.018μL, 100μM qPCR 역방향 프라이머 0.018μL, ddH2O 0.96μL를 추가합니다.</li>
		<li>qPCR 실행(유지 단계: 50°C에서 2분, 95°C에서 2분; PCR 단계: 95°C에서 15초 동안 및 60°C에서 1분 동안 40주기; 용융 곡선 단계: 95°C에서 15초, 60°C에서 1분, 95°C에서 15초). 정량화를 위해 표준 곡선 방법을 사용합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

murine white 지방 조직의 반자동 분리

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+expression+of+tumor+necrosis+factor-alpha:+direct+role+in+obesity-linked+insulin+resistance.">Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance.</a> Science. 259 (5091), 87-91 (1993).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+cloning+of+the+mouse+obese+gene+and+its+human+homologue.">Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue.</a> Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).</li><li>Kajimura, S., Saito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+era+in+brown+adipose+tissue+biology:+Molecular+control+of+brown+fat+development+and+energy+homeostasis.">A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis.</a> Annual Review of Physiology. 76, 225-249 (2014).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human.">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150 (2), 366-376 (2012).</li><li>Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+obesity:+from+discovery+to+biology.">The genetics of obesity: from discovery to biology.</a> Nature Reviews Genetics. 23 (2), 120-133 (2022).</li><li>Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bigger+picture+of+FTO-the+first+GWAS-identified+obesity+gene.">The bigger picture of FTO-the first GWAS-identified obesity gene.</a> Nature Reviews Endocrinology. 10 (1), 51-61 (2014).</li><li>Hiraike, Y., Yang, C. T., Liu, W. J., Yamada, T., Lee, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FTO+obesity+variant-exercise+interaction+on+changes+in+body+weight+and+BMI:+The+Taiwan+biobank+study.">FTO obesity variant-exercise interaction on changes in body weight and BMI: The Taiwan biobank study.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (9), e3673-e3681 (2021).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+activity+attenuates+the+genetic+predisposition+to+obesity+in+20,000+men+and+women+from+EPIC-Norfolk+prospective+population+study.">Physical activity attenuates the genetic predisposition to obesity in 20,000 men and women from EPIC-Norfolk prospective population study.</a> PLoS Medicine. 7 (8), e1000332 (2010).</li><li>Claussnitzer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FTO+obesity+variant+circuitry+and+adipocyte+browning+in+humans.">FTO obesity variant circuitry and adipocyte browning in humans.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (10), 895-907 (2015).</li><li>Tontonoz, P., Hu, E., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+adipogenesis+in+fibroblasts+by+PPAR+gamma+2,+a+lipid-activated+transcription+factor.">Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor.</a> Cell. 79 (7), 1147-1156 (1994).</li><li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+brown+fat+determination+by+PRDM16.">Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16.</a> Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).</li><li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRDM16+controls+a+brown+fat/skeletal+muscle+switch.">PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch.</a> Nature. 454 (7207), 961-967 (2008).</li><li>Rajakumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EBF2+determines+and+maintains+brown+adipocyte+identity.">EBF2 determines and maintains brown adipocyte identity.</a> Cell Metabolism. 17 (4), 562-574 (2013).</li><li>Shapira, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EBF2+transcriptionally+regulates+brown+adipogenesis+via+the+histone+reader+DPF3+and+the+BAF+chromatin+remodeling+complex.">EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex.</a> Genes and Development. 31 (7), 660-673 (2017).</li><li>Hiraike, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NFIA+co-localizes+with+PPAR&#947;+and+transcriptionally+controls+the+brown+fat+gene+program.">NFIA co-localizes with PPAR&#947; and transcriptionally controls the brown fat gene program.</a> Nature Cell Biology. 19 (9), 1081-1092 (2017).</li><li>Hiraike, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NFIA+differentially+controls+adipogenic+and+myogenic+gene+program+through+distinct+pathways+to+ensure+brown+and+beige+adipocyte+differentiation.">NFIA differentially controls adipogenic and myogenic gene program through distinct pathways to ensure brown and beige adipocyte differentiation.</a> PLoS Genetics. 16 (9), e1009044 (2020).</li><li>Hiraike, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NFIA+determines+the+cis-effect+of+genetic+variation+on+Ucp1+expression+in+murine+thermogenic+adipocytes.">NFIA determines the cis-effect of genetic variation on Ucp1 expression in murine thermogenic adipocytes.</a> iScience. 25 (8), 104729 (2022).</li><li>Villanueva, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+subtype-selective+recruitment+of+TLE3+or+Prdm16+by+PPAR&#947;+specifies+lipid+storage+versus+thermogenic+gene+programs.">Adipose subtype-selective recruitment of TLE3 or Prdm16 by PPAR&#947; specifies lipid storage versus thermogenic gene programs.</a> Cell Metabolism. 17 (3), 423-435 (2013).</li><li>Pearson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+TLE3+promotes+the+mitochondrial+program+in+beige+adipocytes+and+improves+glucose+metabolism.">Loss of TLE3 promotes the mitochondrial program in beige adipocytes and improves glucose metabolism.</a> Genes and Development. 33 (13-14), 747-762 (2019).</li><li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zfp423+maintains+white+adipocyte+identity+through+suppression+of+the+beige+cell+thermogenic+gene+program.">Zfp423 maintains white adipocyte identity through suppression of the beige cell thermogenic gene program.</a> Cell Metabolism. 23 (6), 1167-1184 (2016).</li><li>Green, H., Kehinde, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sublines+of+mouse+3T3+cells+that+accumulate+lipid.">Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid.</a> Cell. 1 (3), 113-116 (1974).</li><li>Green, H., Kehinde, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+established+preadipose+cell+line+and+its+differentiation+in+culture+II.+Factors+affecting+the+adipose+conversion.">An established preadipose cell line and its differentiation in culture II. Factors affecting the adipose conversion.</a> Cell. 5 (1), 19-27 (1975).</li><li>Green, H., Kehinde, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+heritable+changes+leading+to+increased+adipose+conversion+in+3T3+cells.">Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells.</a> Cell. 7 (1), 105-113 (1976).</li><li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige/brite+cells.">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).</li><li>Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+primary+white+and+brown+preadipocytes+from+newborn+mice.">Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e62005 (2021).</li><li>Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture:+a+simple,+reproducible,+efficient+and+economic+technique+for+isolation+of+mesenchymal+stromal+cells+from+human+adipose+tissue+and+lipoaspirate.">Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).</li><li>Lockhart, R. A., Aronowitz, J. A., Dos-Anjos Vilaboa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+freshly+isolated+human+adipose+stromal+cells+for+clinical+applications.">Use of freshly isolated human adipose stromal cells for clinical applications.</a> Aesthetic Surgery Journal. 37, S4-S8 (2017).</li><li>Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plat-E:+an+efficient+and+stable+system+for+transient+packaging+of+retroviruses.">Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses.</a> Gene Therapy. 7 (12), 1063-1066 (2000).</li><li>Li, Y., Fromme, T., Klingenspor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meaningful+respirometric+measurements+of+UCP1-mediated+thermogenesis.">Meaningful respirometric measurements of UCP1-mediated thermogenesis.</a> Biochimie. 134, 56-61 (2017).</li><li>Hiraike, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+with+mouse+adipocytes+using+hypotonic+buffer+to+enrich+nuclear+fraction+before+fixation.">Chromatin immunoprecipitation with mouse adipocytes using hypotonic buffer to enrich nuclear fraction before fixation.</a> STAR Protocols. 4 (1), 102093 (2023).</li><li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li></ol>

저자 중 누구도 이 작업과 관련하여 경쟁적인 재정적 이해관계를 가지고 있지 않습니다.

여기에서 우리는 지방전구세포를 얻고 시험관 내에서 지방세포 분화를 수행하기 위해 쥐 지방 조직으로부터 SVF를 분리하기 위한 프로토콜을 설명했습니다. 콜라게나제 분해를 위한 조직 해리제의 사용은 실험 변형을 감소시키고 오염 위험을 줄이며 재현성을 증가시켰습니다. 이 절차는 제시된 프로토콜 내에서 중요한 단계이지만 프로세스는 고도로 자동화되어 있으며 최적화가 필요하지...

지방 조직 생물학은 전 세계적으로 비만과 제2형 당뇨병의 유병률이 증가함에 따라 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다1. 지방 세포는 기아 시 방출되는 지질 방울의 형태로 과도한 에너지를 저장합니다. 또한, 지방 조직은 내분비 기관으로 작용하고 다른 조직과 소통함으로써 전신 에너지 항상성을 유지한다 2,3. 흥미롭게도, 과도한 지방 조직(비만)과 지방 손실(지방이영양증)은 모두 인슐린 저항성 및 당뇨병과 관련이 있습니다1. 지방세포는 흰색, 갈색, 베이지색의 세 가지 유형으로 나뉩니다1. 백색 지방세포는 주로 과잉 에너지를 지질로 저장하는 반면, 갈색 및 베이지색 지방세포는 미토콘드리아 분리 단백질-1(Ucp1)을 통해 열의 형태로 에너지를 발산합니다.1,4. 특히, 베이지색 지방세포("유도성" 갈색 지방세포라고도 함)는 차가운 자극 또는 교감신경 자극에 반응하여 백색 지방세포에 나타나며, "고전적인" 갈색 지방세포와 겹치지만 구별되는 유전자 발현 패턴을 보인다5. 최근, 갈색 및 베이지색 지방세포는 "에너지 섭취 억제"보다는 "에너지 소산 향상"을 목표로 하는 항비만 및 항당뇨병 치료의 잠재적 표적으로 예상되었습니다4. 이를 뒷받침하는 바로는, 인간에서 FTO 비만 변이체 rs1421085의 위험 대립유전자는 일반적인 변이체 6,7 중에서 더 높은 체질량 지수(BMI)와 가장 강한 연관성을 나타내고 다양한 유전자-환경 상호작용8,9을 나타내며, 베이지색 지방세포 분화 및 기능을 음성적으로 조절하는 것으로 보고되었다10. 과산화소체 증식제 활성화 수용체 γ(PPARγ)은 지방생성의 마스터 전사 조절인자로 알려져 있으며, 지방세포 분화에 필요하고 충분하다11. 전사 조절인자, 예컨대 PRD1-BF1-RIZ1 상동 도메인 16 (PRDM16), 초기 b 세포 인자 2 (EBF2) 및 핵 인자 I-A (NFIA)는 갈색 및 베이지색 지방세포 분화 및 기능에 결정적이다 12,13,14,15,16,17,18. 반면에, 백색 지방 세포 유전자 프로그래밍은 트랜스듀신 유사 인핸서 단백질 3 (TLE3) 및 징크 핑거 단백질 423 (ZFP423) 19,20,21과 같은 전사 조절자를 필요로합니다.
체외 모델 시스템을 통해 지방 세포의 기능과 기능 장애의 기초가 되는 메커니즘에 대한 이해를 향상시키는 것을 목표로 하는 분자 연구를 수행할 수 있습니다. 3T3-L1 및 3T3-F442A와 같은 공개적으로 이용 가능하고 불멸화된 지방전구세포 세포주 가 존재하지만22,23,24, 1차 지방전구세포의 배양 및 지방세포로의 분화는 생체내 지방생성을 연구하는 데 더 적합한 모델이 될 것이다. 쥐 지방 조직으로부터 기질 혈관 분획 (SVF)을 분리하는 것은 1 차 지방 전구 세포를 얻는 잘 알려진 방법이다25,26. 그러나 일반적으로 튜브 랙이 있는 박테리아 셰이커를 사용하여 수행되는 지방 조직의 콜라게나제 분해는 실험적 변형을 초래할 수 있으며 오염되기 쉽습니다27,28. 여기에서는 SVF를 더 쉽게 분리하기 위해 콜라게나제 소화를 위해 부드러운 MACS(Magnetic-Activated Cell Sorting) 조직 해리기를 사용하는 대체 프로토콜을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3010-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-105-808</td>
			<td>contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 &#181;m</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>#352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen coated dishes, 100 mm</td>
			<td>BD</td>
			<td>#356450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen coated dishes, 60 mm</td>
			<td>BD</td>
			<td>#354401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I Coat Microplate 6 well</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>4810-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Wako</td>
			<td>041-18861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, blunt/sharp</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, sharp/sharp</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Milteny Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACSOcto Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humulin R Injection U-100</td>
			<td>Eli Lilly</td>
			<td>872492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isobutylmethylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>17018-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin Sulfate</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>146-08871&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBABE-neo largeTcDNA (SV40)</td>
			<td>Add gene</td>
			<td>#1780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line</td>
			<td>cell biolab</td>
			<td>RV-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>12996-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Sybr Green Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT Master Mix</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>#FSQ-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Wako</td>
			<td>180-02653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2877-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated isolation of the stromal vascular fraction from murine white adipose tissue using a tissue dissociator

흰색, 갈색 및 베이지색 지방세포 분화에 대한 시험관 내 연구를 통해 지방세포의 세포 자율 기능과 그 메커니즘을 조사할 수 있습니다. 불멸화 된 백색 지방 전구 세포 세포주는 공개적으로 이용 가능하며 널리 사용됩니다. 그러나 외부 신호에 대한 반응으로 백색 지방 조직에서 베이지색 지방세포의 출현은 공개적으로 이용 가능한 백색 지방세포 세포주를 사용하여 완전히 재현하기 어렵습니다. 쥐 지방 조직으로부터 기질 혈관 분획 (SVF)의 분리는 일반적으로 1 차 지방 전구 세포를 얻고 지방 세포 분화를 수행하기 위해 실행됩니다. 그러나 손으로 지방 조직을 다듬고 콜라게나제를 분해하면 실험적 변형이 발생할 수 있으며 오염되기 쉽습니다. 여기에서 우리는 실험 변형을 줄이고 오염을 줄이며 재현성을 높이기 위해 SVF를 더 쉽게 분리하기 위해 콜라게나제 소화를 위한 조직 해리기를 활용하는 수정된 반자동 프로토콜을 제시합니다. 얻어진 지방전구세포와 분화된 지방세포는 기능적 및 기계론적 분석에 사용할 수 있습니다.

Adipose tissue biology has been attracting ever-increasing attention because of the growing prevalence of obesity and type 2 diabetes globally1. Adipocytes store excess energy in the form of lipid droplets, which are released upon starvation. Moreover, adipose tissue maintains systemic energy homeostasis by serving as an endocrine organ and communicating with other tissues2,3. Intriguingly, both excess adipose tissue (obesity) and adipose loss (lipodystrophy) are linked to insulin resistance and diabetes1. Adipocytes are divided into three types: white, brown, and beige1. White adipocytes mainly store excess energy as lipids, whereas brown and beige adipocytes dissipate energy in the form of heat via mitochondrial uncoupling protein-1 (Ucp1)1,4. Notably, beige adipocytes (also called &#34;inducible&#34; brown adipocytes) appear in white adipose tissue in response to cold or sympathetic stimulation and exhibit gene expression patterns that overlap with but are distinct from those of &#34;classical&#34; brown adipocytes5. Recently, brown and beige adipocytes have been anticipated as potential targets of anti-obesity and anti-diabetes treatments aimed at &#34;enhancing energy dissipation&#34; rather than &#34;suppressing energy intake&#34;4. Supportively, the risk allele of the FTO obesity variant rs1421085 in humans, which exhibits the strongest association with higher body mass index (BMI) among common variants6,7 and exhibits various gene-environment interactions8,9, is reported to negatively regulate beige adipocyte differentiation and function10. Peroxisome proliferator-activated receptor &#947; (PPAR&#947;) is known as a master transcriptional regulator of adipogenesis and is necessary and sufficient for adipocyte differentiation11. Transcriptional regulators, such as PRD1-BF1-RIZ1 homologous domain containing 16 (PRDM16), early b cell factor 2 (EBF2), and nuclear factor I-A (NFIA), are crucial for brown and beige adipocyte differentiation and function12,13,14,15,16,17,18. On the other hand, white adipocyte gene programming requires transcriptional regulators, such as transducin-like enhancer protein 3 (TLE3) and zinc finger protein 423 (ZFP423)19,20,21.
In vitro model systems enable molecular studies to be performed that aim to improve the understanding of the mechanism(s) underlying the functions and dysfunctions of adipocytes. Although publicly available and immortalized preadipocyte cell lines such as 3T3-L1 and 3T3-F442A exist22,23,24, the culture of primary preadipocytes and differentiation into adipocytes would be a more suitable model for studying in vivo adipogenesis. Isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue is a well-known method for obtaining primary preadipocytes25,26. However, collagenase digestion of adipose tissue, which is commonly performed using a bacterial shaker with a tube rack, can result in experimental variation and is prone to contamination27,28. Here, we describe an alternative protocol that uses a gentle magnetic-activated cell sorting (MACS) tissue dissociator for collagenase digestion to achieve easier isolation of the SVF.

저자 스포트라이트: 조직 해리제를 사용하여 Murine White 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리  

조직 해리기를 사용하여 쥐 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리

We are interested in brown and beige subtypes of adipocyte which dissipate energy in the form of heat, while white adipocyte generally store energy as Our goal is to develop a new treatment for obesity and diabetes based on promotion of energy expenditure, rather than suppression of energy intake. We have identified a transcription factor, NFI, as a critical regulator of brown adipocyte differentiation by a genome-wide open chromatin analysis. NFI and the master transcriptional regulator of adipogenesis, PPAR-gamma, co-localize as the brown-fat-specific enhancers.In the process of isolating stromal vascular fraction from mouse adipose tissue, manual mincing and collagenase digestion of adipose tissue can lead to experimental variability and contamination. Our method uses a tissue dissociator for collagenase digestion, which facilitates SVF isolation, reduce experimental variability and contamination, and improves reproducibility. Experiment using individually-differentiated adipocyte are indispensable for research in our field.Our protocol would offer easy and reproducible SVF isolation for subsequent adipocyte differentiation and would accelerate research in our community. Currently, we are investigating the role of NFI of all-body metabolism, such as body weight and glucose, using gain and loss of function mouse models. We will also explore other pharmacological activation of NFI for each downstream pathway in near future.

이 프로토콜은 지방 세포 분화를 유도한 후 7일 후에 완전히 분화된 지질이 함유된 지방 세포를 생성합니다. 지방세포 분화 정도는 트리글리세리드 및 지질의 오일 레드 오 염색(도 1A) 또는 지방세포 생성의 마스터 조절인자인 Pparg 및 이의 표적 Fabp4와 같은 지방세포 유전자의 qPCR-RT를 이용한 mRNA 발현 분석에 의해 평가될 수 있다(도 1B). <em...

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이 프로토콜은 지방전구세포를 얻고 시험관 내에서 지방세포 분화를 달성하기 위해 쥐 지방 조직에서 기질 혈관 분획(SVF)의 반자동 분리를 설명합니다. 콜라게나제 분해를 위해 조직 해리제를 사용하면 실험 변동이 줄어들고 재현성이 높아집니다.

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...

우리는 열의 형태로 에너지를 발산하는 갈색 및 베이지색 지방세포의 아형에 관심이 있는 반면, 백색 지방세포는 일반적으로 에너지 섭취를 억제하는 것이 아니라 에너지 소비를 촉진하여 비만과 당뇨병에 대한 새로운 치료법을 개발하는 것이 목표입니다. 우리는 전사 인자인 NFI를 게놈 차원의 개방형 염색질 분석에 의해 갈색 지방세포 분화의 중요한 조절자로 확인했습니다. NFI와 지방 생성의 마스터 전사 조절자인 PPAR-감마는 갈색 지방 특이적 강화제로 공동 국소화됩니다.마우스 지방 조직으로부터 기질 혈관 분획을 분리하는 과정에서, 지방 조직의 수동 다짐 및 콜라게나제 소화는 실험적 가변성 및 오염을 초래할 수 있다. 우리의 방법은 콜라게나제 소화를 위해 조직 해리제를 사용하여 SVF 분리를 용이하게 하고 실험 가변성과 오염을 줄이며 재현성을 향상시킵니다. 개별적으로 분화된 지방세포를 이용한 실험은 본 분야의 연구에 빠뜨릴 수 없습니다.우리의 프로토콜은 후속 지방 세포 분화를 위해 쉽고 재현 가능한 SVF 분리를 제공하고 우리 커뮤니티에서 연구를 가속화할 것입니다. 현재 우리는 기능 마우스 모델의 이득 및 손실을 사용하여 체중 및 포도당과 같은 전신 대사의 NFI의 역할을 조사하고 있습니다. 우리는 또한 가까운 장래에 각 다운스트림 경로에 대한 NFI의 다른 약리학적 활성화를 탐구할 것입니다.

semi-automated-isolation-stromal-vascular-fraction-from-murine-white

Research

JoVE Journal

Biology

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

1.5K 조회수.  The University of Tokyo. 우리는 열의 형태로 에너지를 발산하는 갈색 및 베이지색 지방세포의 아형에 관심이 있는 반면, 백색 지방세포는 일반적으로 에너지 섭취를 억제하는 것이 아니라 에너지 소비를 촉진하여 비만과 당뇨병에 대한 새로운 치료법을 개발하는 것이 목표입니다. 우리는 전사 인자인 NFI를 게놈 차원의 개방형 염색질 분석에 의해 갈색 지방세포 분화의 중요한 조절자로 확인했습니?...

비디오: 저자 스포트라이트: 조직 해리제를 사용하여 Murine White 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리  

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their mechanisms. Immortalized white preadipocyte cell lines are publicly available and widely used. However, the emergence of beige adipocytes in white adipose tissue in response to external cues is difficult to recapitulate to the full extent using publicly available white adipocyte cell lines. Isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue is commonly executed to obtain primary preadipocytes and perform adipocyte differentiation. However, mincing and collagenase digestion of adipose tissue by hand can result in experimental variation and is prone to contamination. Here, we present a modified semi-automated protocol that utilizes a tissue dissociator for collagenase digestion to achieve easier isolation of the SVF, with the aim of reducing experimental variation, reducing contamination, and increasing reproducibility. The obtained preadipocytes and differentiated adipocytes can be used for functional and mechanistic analyses.

This protocol describes the semi-automated isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue to obtain preadipocytes and achieve adipocyte differentiation in vitro. Using a tissue dissociator for collagenase digestion reduces experimental variation and increases reproducibility.

연구

생물학

Isolation, Digestion, Filtration and Cell Plating of Murine Adipose Tissue

Begin by placing a seven to eight week old euthanized male mouse on a clean bench surface. Cut the abdominal skin of the mouse with a pair of scissors towards the lower abdomen. Excise the adipose tissue from the inner thighs.Place the excised tissue into tube C on ice containing 2.5 milliliters of an enzyme mixture of enzymes D, R, A and 2.35 milliliters of DMEM/F12 without FBS or antibiotics. Using scissors, cut the adipose tissue into approximately two square millimeter sized pieces. Tightly close the cap of tube C and invert the tube.Attach the tube to the sleeve of a tissue dissociator and digest the samples at 37 degrees Celsius for 40 minutes. Next, prewarm DMEM/F12 media containing FBS and antibiotics to 37 degrees Celsius. After incubation, remove tube C from the tissue dissociator and stop digestion by adding five milliliters of DMEM/F12 with FBS and antibiotics.Gently pipette four times. Centrifuge the suspension at 700 g for 10 minutes at 20 degrees Celsius. Without disturbing the cell palette, carefully aspirate the supernatant.Resuspend the pellet in 10 milliliters of DMEM/F12 containing FBS and antibiotics, and gently pipette five times. Filter the cell suspension through a 70 micron diameter cell strainer placed on a 50 milliliter tube. Centrifuge the filtrate at 250 g for five minutes.Resuspend the pellet in 10 milliliters of PBS. Before plating, centrifuge the cell suspension at 500 g for five minutes. Discard the supernatant.Resuspend the pellet in 10 milliliters of DMEM/F12 containing FBS and antibiotics. Mix by pipetting the suspension gently, 10 times. Plate 10 milliliters of the suspension on a 10 centimeter collagen coated dish.Place the dish in a cell culture incubator. Aspirate the medium and wash the cells three times with three milliliters of PBS per wash. Add 10 milliliters of DMEM/F12 containing FBS and antibiotics and incubate.Oil Red O staining showed lipid laden adipocytes seven days after inducing adipocyte differentiation. The degree of full differentiation was confirmed by mRNA expression analysis of adipogenesis regulators. Rosiglitazone induced a dose dependent effect on the expression levels of brown fat specific genes such as Ucp1 and Ppargc1a.However, for Fabp4, the effect saturated at 0.1 micromole rosiglitazone concentration. Differentiated adipocytes can be used for various functional and mechanistic analyses such as oxygen consumption rate analysis and chromatin immunoprecipitation.