Comece colocando as articulações dissecadas do joelho do rato em uma placa de cultura. Aspirar o meio de cultura e adicionar meio de cultura fresco. Repita a lavagem três ou quatro vezes.
Em seguida, sob um microscópio estéreo, desloque todas as articulações no meio de cultura, puxando-as usando pinças de ponta fina. Remova a tíbia e o maior número possível de vasos, tendões e ligamentos, tomando cuidado para não quebrar os ossos. Prepare dois tubos de 15 mililitros por amostra.
Com pinças, transfira os ossos deslocados com tecidos moles para o primeiro tubo. Para cada amostra obtida de ambas as patas traseiras, adicionar quatro mililitros de meio de digestão ao tubo. Para coletar células residuais e fragmentos de tecido, transferir o meio de cultura da placa de dissecção para o segundo tubo de 15 mililitros.
Centrifugar o meio a 500 G durante 5 minutos à temperatura ambiente. Após a remoção do sobrenadante, ressuspenda o pellet com um mililitro de meio de digestão. E transfira esta solução para o primeiro tubo de 15 mililitros para que contenha quase todo o tecido, no total cinco mililitros de meio de digestão.
Em seguida, digerir a amostra por 60 a 120 minutos a 37 graus Celsius com agitação em um forno de hibridização. Após a incubação, misturar a amostra por pipetagem e filtrar a solução celular através de um filtro de células de 40 mícrons em um tubo de 50 mililitros. Adicione 10 mililitros de meio de cultura ao tubo através do filtro celular.
Centrifugar a 300 G durante 5 minutos à temperatura ambiente. Retire o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular com 10 mililitros de meio de cultura. Repita a centrifugação, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet com dois mililitros de meio de cultura.
