Antes de iniciar, realizar o isolamento dos fibroblastos sinoviais e utilizar as células não aderentes coletadas da placa revestida com colágeno neste procedimento. Seme as células não aderentes em placas de 40 a 60 milímetros que não tenham sido revestidas com colágeno. Cultivar as células a granel por um dia a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada com 5% de dióxido de carbono.
Para remover linfócitos não aderentes, aspirar o meio de cultura e, em seguida, adicionar meio de cultura fresco. Cultivar as células a granel aderentes por uma a duas semanas com trocas de meio a cada dois dias, mantendo a confluência. Em seguida, lave duas vezes com PBS ou HBSS.
Selecionar macrófagos sinoviais tratando com 0,05% de tripsina em HBSS e incubar por três minutos a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada com dióxido de carbono a 5%. Em seguida, adicione o meio de cultura suavemente a 0,05% de tripsina em HBSS. Após esta etapa, não despeje o meio diretamente sobre as células.
Para remover as células destacadas, aspirar o meio de cultura e, em seguida, adicionar o meio de cultura fresco suavemente. Repetir duas ou três vezes e manter as células na placa em meio de cultura fresco até o uso. Células semelhantes a macrófagos foram isoladas de camundongos C57BL/6 fêmeas com sete a oito semanas de idade e analisadas por RT-qPCR.
A expressão de RNAm dos marcadores pan-macrófagos CD68, EMR1, ITGAM, CSF1R mostrou um isolamento rico em macrófagos do tecido da sinovite. Para estabelecer a pureza dos macrófagos, marcadores proteicos de superfície para macrófagos e outros tipos celulares foram analisados por citometria de fluxo. Mais de 90% das células expressaram marcadores de macrófagos CD45, CD11b e F4/80, enquanto a expressão do marcador de neutrófilos Ly6G e do marcador de células T CD3 foi menor que 1%
