Este método pode ser usado para a dissecção de pâncreas suíno contendo conexão, lóbulos duodenais e esplênicos e eventual descelularização através da perfusão de detergentes a temperaturas frias. Embora este método de descelularização forneça uma visão do pâncreas suíno, ele também pode ser aplicado à pancreata de outros animais de grande porte. A principal vantagem dessa técnica é que facilita a recuperação intacta de um órgão complicado, como o pâncreas, para novas aplicações de engenharia de tecidos.
Geralmente, indivíduos novos nesse método, eles vão lutar porque a dissecação do pâncreas intacto ao identificar e ligar todos os vasos sanguíneos circundantes requer muita prática para dominar. Antes de iniciar o procedimento, use um tubo de silicone de três por cinco milímetros para conectar o recipiente de detergente à bomba peristáltica e um segundo tubo de silicone de três por cinco milímetros para conectar a bomba peristáltica à câmara do órgão através do degasser. Conecte um Luer macho à extremidade livre do segundo tubo, e use um terceiro tubo de silicone de três por cinco milímetros para conectar a câmara de órgãos ao recipiente de coleta de detergente através da bomba peristáltica.
Por fim, conecte uma pipeta sem rótulo de dois milímetros às extremidades livres dos tubos no recipiente de detergente e no recipiente de coleta de detergente. Em seguida, coloque a configuração de descelularização em quatro graus Celsius. Para colher o pâncreas, coloque uma heparinizada, 45 kg, uma porca feminina em uma mesa de dissecção na posição supina, e use um bisturi para fazer uma incisão de linha média de 40 centímetros do processo xiphoide até o osso púbico para expor os órgãos abdominais.
Depois de identificar os lóbulos esplênicos, duodenais e de conexão, localize a papila duodenal principal e use duas suturas individuais para ligar oralmente o duodeno do local. Ligate o esôfago inferior com suturas adicionais, e corte entre as ligaduras com uma tesoura para facilitar a remoção do estômago. Separe os tecidos conjuntivos do cólon para alcançar o intestino delgado, e separe o tecido conjuntivo do cólon que se prende ao lobo esplênico do pâncreas.
Intestinos delgados são ligados ao pâncreas por tecido conjuntivo no lobo esplênico, mas também circunda o pâncreas. Você tem que seguir cuidadosamente o caminho intestinal para desembaraçar e separar o tecido conjuntivo entre o intestino e o pâncreas. Depois de ligar as artérias, remova o cólon do intestino delgado.
Identifique a veia mesentérica inferior, a árvore arterial mesentérica inferior, e liga os vasos com uma sutura caudal ao pâncreas e corte com tesoura. Ligate a artéria esplênica e a veia juntas no hilum, perto do baço, e corte distally com uma tesoura para remover o baço. Siga o duodeno até que os lobos duodenais e de conexão sejam limpos, e ligate o duodeno no final com duas suturas separadas.
A parte do duodeno que está em contato próximo com a conexão e lóbulos duodenais é removida com o pâncreas, pois a ligadura de todos os pequenos vasos sanguíneos entre os dois órgãos é muito difícil. Depois de dissecar a veia do portal, ligar o vaso com uma sutura para evitar qualquer vazamento de sangue do fígado, e dissecar e ligar o ducto biliar e artéria hepática com duas suturas. Em seguida, corte a veia portal, artéria hepática e ducto biliar com uma tesoura.
Localize a aorta sob a veia renal, e disseca a aorta na direção craniana do músculo e tecido conjuntivo até que o vaso atinja o pâncreas. Agora, vire suavemente o pâncreas e disseque a aorta, mantendo intacta a artéria mesentérica superior e o tronco celíaco. Corte a aorta cranial ao tronco celíaco, e disseque sem cortes o tecido circundante restante para permitir a colheita do pâncreas.
Em seguida, use uma seringa de 50 mililitros conectada a uma cânula de arteriotomia de quatro milímetros para lavar o órgão através da aorta com solução dois até que todo o órgão seja perfundido ou até que todo o órgão esfrie. Coloque a solução com dois pâncreas perfumados em uma bandeja de metal no gelo, com a aorta virada para cima, e use uma tesoura para cortar as suturas do duodeno. Use uma pipeta de 25 mililitros para lavar o duodeno com 50 a 150 mililitros de água ultrapura, e religar o tecido com suturas frescas.
Ligate uma extremidade da aorta e todos os ramos, excluindo a artéria mesentérica superior e o tronco celíaco, para evitar vazamentos, e insira uma cânula de arteriotomia de quatro milímetros na outra extremidade da aorta. Em seguida, coloque o pâncreas na câmara do órgão, e conecte a cânula no pâncreas a um Luer macho. Em seguida, perfumar o pâncreas com solução três por uma hora a 20 mililitros por minuto, e congelar o pâncreas de dupla perfumada a menos 20 graus Celsius na solução quatro até o início da descelularização.
No dia da descelularização inicial, descongele o pâncreas a quatro graus Celsius, e coloque o pâncreas descongelado na câmara do órgão de descelularização. Conecte o tubo de entrada de detergente à aorta do pâncreas e lave o pâncreas com a solução três a 20 mililitros por minuto durante a noite a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, decante qualquer solução restante na câmara de órgãos, e perfunde o pâncreas por 30 minutos a 20 mililitros por minuto na solução cinco a quatro graus Celsius.
No final da solução cinco perfusão, perfusam o pâncreas por oito horas a 20 mililitros por minuto na solução seis e quatro graus Celsius, seguido por uma lavagem de 96 horas em solução fresca cinco a 20 mililitros por minuto e quatro graus Celsius. Substitua a lavagem por 500 mililitros de DPBS suplementados com cálcio e magnésio por 30 minutos a 37 graus Celsius, seguido de perfusão com 250 mililitros de solução sete por quatro horas a 20 mililitros por minuto e 37 graus Celsius. Em seguida, lave o órgão por mais 120 horas com solução fresca cinco a 20 mililitros por minuto e quatro graus Celsius, e armazene o órgão na solução oito.
Aqui, pode ser observada a morfologia bruta de um pâncreas normal, que parece rosa claro e contém lóbulos esplênicos, conexões e lobos duodenais. Após a descelularização, a cor rosa é perdida, e o pâncreas processado aparece branco pálido na cor. Em um pâncreas normal, muitos núcleos azuis são aparentes pela coloração de H e E, enquanto em um pâncreas descelularizado os núcleos não podem mais ser visualizados, confirmando sua perda.
O pâncreas suíno intacto isolado, seguindo este procedimento, permitirá uma completa perfusão e descelularização bem sucedida, preservando a estrutura e também permitindo a obtenção de algumas proteínas de matriz extracelular. O pâncreas descelularizado pode ser usado para o desenvolvimento de estratégias de recelularização de órgãos inteiros em sistemas bioreatores com tipos celulares relevantes. Após a recelularização com células-tronco receptoras, o pâncreas projetado por tecido pode ser usado para aplicações clínicas e testes medicamentosos.
Não se esqueça que trabalhar com Triton X-100 e SDC pode ser extremamente perigoso e que precauções, como usar luvas e preparar as soluções sob capô de fumaça, devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
