Para começar, baixe e instale a versão mais recente do Fiji em um computador. Depois de baixar o convert_to_TIFF. py, arraste e solte o script em Fiji e execute o código.
Navegue até o caminho em que o experimento está armazenado. Os arquivos TIFF convertidos são criados na mesma pasta experimental. Clique em plugins, depois em 3D Suite e abra as opções do gerenciador 3D.
Na janela do gerenciador 3D, marque as caixas de seleção correspondentes ao volume em unidade, valor médio de cinza, caixa delimitadora em pixel, valor de cinza de desvio padrão, centróide em pixel e centróide em unidade. Marque os objetos de exclusão nas arestas XY e os objetos de exclusão nas arestas Z.Em seguida, clique em OK. Abra a imagem fluorescente de linfócitos T humanos.
Clique em Control Shift D para duplicar o canal de proteína, incluindo a pilha. Marque a caixa de seleção da hiperpilha. Especifique o número do canal apropriado na caixa de canais e renomeie-o de acordo.
Para iniciar o gravador de macros Fiji, navegue até os plug-ins, depois macros e selecione gravar. Em seguida, para abrir o plug-in FindFoci, clique sequencialmente nos plug-ins GDSC, FindFoci e FindFoci GUI. No menu suspenso da imagem, selecione a imagem a ser analisada.
Defina o desfoque gaussiano como 1,5, o método de fundo como desvio padrão acima da média, o parâmetro de fundo como nove, o método de pesquisa como fração do fundo de pico, o parâmetro de pesquisa como 0,7, o método de pico como relativo acima do plano de fundo, o parâmetro de pico como 0,2 e o tamanho mínimo como cinco. Defina os picos máximos para números altos para incluir todos os focos na imagem. Para melhorar a identificação dos focos, ajuste o desfoque gaussiano próximo ao diâmetro dos focos e aumente os valores do parâmetro de fundo para impor limites mais rigorosos.
Em seguida, diminua os valores do parâmetro de pesquisa para incluir áreas mais distantes do pico de fluorescência e diminua os valores do parâmetro de pico para a separação dos picos. Execute FindFoci e copie a cadeia de caracteres que aparece na janela do gravador. A cadeia de caracteres contém os parâmetros selecionados, excluindo as aspas.
Depois de baixar o script nuclear_prod_q. py, arraste e solte o script em Fiji e clique em executar para executar o código. No canal do núcleo, insira o número correspondente ao canal do DAPI.
Para desfoque gaussiano do núcleo, insira o valor de sigma necessário para desfocar a imagem para segmentação. Em seguida, insira o número correspondente ao canal da coloração de interesse para o canal de proteína. No parâmetro FindFoci, cole a cadeia de caracteres que representa a gravação de macro dos parâmetros selecionados.
Marque a caixa de seleção visual e clique em procurar para selecionar o diretório onde as imagens estão armazenadas. Depois que todas as caixas forem compiladas, clique em OK para continuar a execução. Na lista ROI na janela 3D do gerenciador de ROI, selecione o canal de núcleos e clique em ROI ao vivo para ativado.
Selecione o ROI pertencente ao mesmo núcleo e pressione mesclar. E para núcleos indesejados, pressione delete. Novamente, clique em ROI ao vivo para ativado, selecione todos e confirme se todos os núcleos estão segmentados corretamente.
Na pasta de quantificação, abra o arquivo TXT com registros dos parâmetros usados para a análise. Abra o Google Colab em um navegador. Em seguida, no arquivo, selecione abrir notebook e carregue as métricas finais da proteína nuclear.
script ipynb. Faça upload de todas as pastas que contêm os arquivos CSV de cada campo de imagem para uma pasta de sua preferência no Google Drive. No notebook, indique o caminho da pasta onde as subpastas de resultados estão armazenadas e execute todas as células.
Quando o código terminar de compilar, abra o arquivo de planilha final contendo todos os dados compilados.
