Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave em uma ampla variedade de campos que requerem inativação condicional e transitória de um gene de interesse, expressando reversivelmente uma versão negativa dominante dele. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite apenas uma ablação parcial na atividade proteica, preservando assim uma expressão endógena residual. Embora, aqui descrevemos a condição de inativação da proteína RB, que funciona em um conjunto multimédico, essa metodologia também pode ser aplicada a proteínas monoméricas.
Umesh Pyakurel, nosso técnico de laboratório e coautor do manuscrito demonstrará os procedimentos. Para começar, cresça células NIH3T3, seguindo as especificações do fornecedor, a 37 graus Celsius com 5% de CO2, utilizando o meio de cultura celular recomendado contendo 10% de soro bovino fetal. Para cotransfectar as células usando os vetores pTet-Splice e pCMV-Tet3G, primeiro misture dois a quatro microliters do reagente de transfecção à base de lipídios por poço, e um mililitro de DMEM incompleto por poço em um tubo de 15 mililitros, e incubar por cinco minutos à temperatura ambiente.
Adicione dois a três microgramas de DNA de plasma por poço à mistura de DMEM deste reagente de transfecção. Misture e incubar por 20 minutos em temperatura ambiente. Adicione um mililitro da mistura contendo DNA e o reagente de transfecção em DMEM a cada poço de placa de seis poços com células NIH3T3.
Após três a quatro horas de incubação a 37 graus Celsius com 5% de CO2, adicione um mililitro de meio completo. Em seguida, adicione 2 microliters de estoque de doxiciclina a cada poço e marque a placa como plus-doxiciclina. Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de CO2.
Para avaliar a funcionalidade da construção TetO-DN-CB-myc6-Rb1 na promoção da proliferação celular não programada, cultura células HEI-OC1 no DMEM contendo 10% de FBS, em condições permissivas. Para estudos de proliferação celular, conte as células HEI-OC1 usando um contador celular. Placa 10.000 células HEI-OC1 por poço em uma placa de 96 poços em 200 microliters de volume cada.
Incubar as células durante a noite a 33 graus Celsius com 5% de CO2. Para induzir a expressão transgênica, adicione um micrograma por mililitro de doxiciclina a um subconjunto de células HEI-OC1 transfectadas. Use o outro subconjunto rotulado como menos-doxiciclina e as células HEI-OC1 não transfectadas como controles, e incubar as células como 33 graus Celsius com 10% de CO2.
Para avaliar a proliferação celular, 48 horas após a transfecção, remova o meio de cultura celular e adicione 100 microliters de solução de ligação de corante 1x de um kit de proliferação celular a cada poço da microplacante. Siga o protocolo do fabricante e incubar por uma hora a 37 graus Celsius. Use um leitor de microplaca de fluorescência para medir a intensidade da fluorescência de cada amostra.
Para avaliar ainda mais a proliferação celular usando a imunocitoquímica, aplaque as células HEI-OC1 em um copo de cobertura colocado em cada poço de uma placa de 12 poços em DMEM. Incubar as células durante a noite a 33 graus Celsius. No dia seguinte, cotransfecte para as células em dois poços com os vetores pTet-Splice e pCMV-Tet3G, e então realizar o tratamento de doxiciclina em um bem como feito com as células NIH3T3.
Use um não transintratado, bem como um controle. Para processar as células para rotulagem Ki-67, fixe-as com 4% de paraformaldeído em PBS por 10 minutos à temperatura ambiente. Depois disso, lave-os três vezes com PBS gelado por cinco minutos cada.
Adicione 0,25% de detergente noniônico na PBS e incubar por 10 minutos. Repita a lavagem três vezes em PBS por cinco minutos cada. Use 10% de soro para bloquear as células.
Em uma câmara umidificada por uma hora em temperatura ambiente. Adicione 500 microliters de anticorpos primários Ki-67 e incubar durante a noite a quatro graus Celsius. Lave as células novamente três vezes em PBS por cinco minutos cada.
Adicione um mililitro do anticorpo secundário e incuba as células por uma hora à temperatura ambiente no escuro. Depois de remover a solução de anticorpos secundários, lave as células novamente três vezes por cinco minutos em PBS no escuro. Para rotular as células HEI-OC1 com fábula, incuba-as em 1:200 phalloidin por 30 minutos em temperatura ambiente.
Para rotular os núcleos celulares, incubar as células com cinco microgramas por mililitro de DAPI por 10 minutos à temperatura ambiente. Após a entrega dos camundongos transgênicos, o genótipo dos filhotes usando um conjunto de primer específico para a região de fusão CBRb1, conforme descrito no manuscrito. Crie camundongos TetO-DN-CB-myc6-Rb1 para a linha de indutor ROSA-CAG-rtTA e tetrecycline para gerar camundongos DN-CBRb experimentais, e genótipo de seus descendentes, conforme descrito no manuscrito.
NIH3T3 não expressa proteína RB1 endógena, por isso a expressão robusta RB1 vista aqui se deve à indução transgênica na presença do Dox, mas não na sua ausência, confirmando a ativação eficiente da construção do mix RB1 TetO-DN-CB-myc6-Rb1. Em contraste, as células HEK293 têm expressão RB1 endógena. A adição de doxycycline levou à ativação TetO-DN-CB-myc6-Rb1 e à regulação de down-regulation RB1.
A expressão RB1 foi retomada 21 horas após a doxilalina ser removida da mídia. As células HEI-OC1 cotransfectadas com os mesmos vetores, apresentaram um aumento modesto, mas significativo no número de células, seguindo o tratamento da doxiciclina em comparação com as células transfeinadas não tratadas com doxiciclina, e as células não transtravadas. A hibridização fluorescente in situ confirmou a inserção genômica do transgene TetO-DN-CB-myc6-RB1 em camundongos.
Houve um aumento inicial na expressão total da proteína RB1 na cóclea dos camundongos transgênicos tratados com doxiciclina por três dias em comparação com o grupo controle. Entretanto, em grupos tratados com doxociclina durante sete e 10 dias, observou-se uma redução significativa na expressão RB1. Independentemente do tecido analisado, observou-se redução significativa da proteína RB1 em camundongos transgênicos tratados com doxocycline, mas não no grupo controle, confirmando a eficiência da construção TetO-DN-CB-myc6-RB1.
Ao tentar este procedimento, é importante verificar se cada um dos elementos de codificação do transgene estão em quadro entre si. Se as regiões de codificação de Cathepsin B e retinoblastoma descritas neste relatório estivessem, por acaso, conectadas fora do quadro, não produziria a proteína de fusão pretendida. Assim, a verificação da sequência de DNA deve ser feita antes de injetar o transgene em embriões de camundongos unicelulares.
Após esse procedimento, o onipresente promotor cag pode ser substituído por promotores específicos, a fim de estudar a função genética de forma específica de uma célula.
