Este artigo foi apoiada pelo Grant NSERC # 299280, IRSST como uma bolsa de estudos para G. Pais e FRSQ como um prêmio de graduação de estudantes de pesquisa para M. Cyr. Agradecemos a Yoan Lemieux-Laneville para realizar as manipulações gravadas em vídeo.

<html> Antes de qualquer manipulação, é preciso identificar o grupo de tendões para ser usado, dependendo da experiência que estão a realizar e os aparelhos à sua disposição. Para os nossos propósitos, tendões ventral foram escolhidos porque são menores e, portanto, mais fácil de manipular durante a medição da área transversal e equipando-os para dentro da câmara biorreator. Por favor note que todos os instrumentos são autoclavados ou esterilizados com álcool 70%. Além disso, um frasco de spray contendo álcool 70% é colocado ao lado de cada estação de trabalho para esterilizar as luvas experimentadores antes de cada operação. Parte 1: Extração Após a ressecção, a cauda é cuidadosamente manipulado por suas extremidades para evitar danificar os tecidos. Além disso, para conservar a viabilidade celular, todas as manipulações são realizadas em solução salina gelada. 1A) Materiais: <ul><li> Solução salina fria (D-PBS) </li><li> Gelo picado </li><li> Protetor de superfície </li><li> Tábua </li><li> Placas individuais de manipulação </li><li> 2 500 pratos ml </li><li> 2 2L pratos de vidro </li><li> Fita adesiva </li><li> Uma pinça </li><li> 1 Pinça </li><li> Uma pinça ficar </li><li> 1 par de tesouras cirúrgicas </li><li> Um bisturi </li><li> 1 par de tesouras cirúrgicas <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Manipulação individual com a identificação de orientação (&quot;P&quot; para &quot;proximal&quot;) </li></ul> 1B) Estação de Trabalho: <ol><li> Espalhar o protetor de superfície e coloque a placa de corte na parte superior. </li><li> Preencher cada dois pratos de vidro para maior até a metade com gelo picado e coloque-os no papel. </li><li> Furar um pedaço de fita em um canto da placa de manipulação e identificar com uma letra para indicar o fim proximal. </li><li> Preencha os dois pratos de vidro pequeno para a metade e todas as ranhuras das placas de manipulação com soro fisiológico frio. Colocá-los nos pratos de vidro grande contendo gelo. </li><li> Organizar todos os instrumentos esterilizados no protector de superfície. </li><li> Transferência da cauda em um dos prato de vidro contendo solução salina. </li></ol> 1C) Manipulações: <ol><li> Observar a anatomia da extremidade proximal da cauda para distinguir o lado ventral do lado dorsal. O lado ventral tem um maior número de tendões e vasos sanguíneos que pode ser verificado pressionando ligeiramente a cauda para produzir pequenas gotas de sangue. </li><li> Usando a tesoura cirúrgica, cortar a pele ao longo do lado dorsal da cauda se você quer extrair os tendões ventral (ou ao longo do lado ventral se precisar os tendões dorsal). </li><li> Abrir a incisão na extremidade proximal e remover a pele com a pinça ou com os dedos e com cuidado manipular as extremidades da cauda. </li><li> Enxaguar o sangue e cabelo em solução salina e transferir a amostra no prato de vidro contendo solução fresca restantes. Mudar de luvas. A seção transversal visto sob microscopia de luz mostra os grupos tendão seis. Um tendão de cada grupo é unido à extremidade caudal de cada vértebra, por isso cortamos no disco intervertebral para expor novas tendões ao longo do corte. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Secção transversal da cauda de ratos visto sob microscopia de luz. </li><li> Corte a extremidade distal através da cartilagem 2-3 vértebras mais curto com uma tesoura cirúrgica. Coloque a cauda na tábua de corte para cortar os tecidos moles, usando um bisturi e imediatamente substituí-lo na solução. </li><li> Usando uma pinça, puxe um tendão da cauda distal. </li><li> Com uma retenção suave em ambas as extremidades, coloque o tendão na placa de manipulação individual. Repita os dois últimos passos até que não mais pode ser tendões brincou e cortar uma vértebra mais curta sempre que novos tecidos precisam ser expostos. </li></ol> Parte 2: transversal medição da área 7 Quando o tecido sofre caracterização mecânica ou estimulação, suas propriedades mecânicas são descritos por normalizar a força no interior do tendão ao estresse. É por isso que nós avaliamos área transversal. 2A) Materiais: <ul><li> Micrômetro óptica </li><li> Estereomicroscópio </li><li> Câmera digital </li><li> Reconhecimento de ponta e algoritmos de reconstrução 5,6 Perfil </li><li> Solução salina fria (D-PBS) </li><li> 1 pipeta de volume de 20 200μL Micro </li><li> Uma chave de Hex para ajustes micrômetro óptico </li><li> 2 Pinças / Files/ftp_upload/2176/2176fig3.jpg &quot;alt =&quot; Figura 3 &quot;/&gt; Figura 3. Micrômetro Optic </li></ul> 2B) Estação de Trabalho: <ol><li> Abra o software (câmera digital e algoritmos). </li><li> Coloque o micrômetro óptico para que haja espaço suficiente para carregar o tendão no aparelho. </li><li> Organizar os instrumentos e prato de vidro contendo os tendões extraídos à mão. </li></ol> 2C) Manipulações: <ol><li> Encha o compartimento de medição com solução salina fria até que ambos os sistemas de ancoragem são submersas. </li><li> Transferência do tendão no compartimento, segurando as pontas com uma pinça. </li><li> Usando a pipeta de sucção através de micro-volume, puxe uma extremidade de cada vez para dentro do tubo de silício. Aspirar até o final se estende além do eixo colares. </li><li> Aperte os colares de eixo para comprimir os tubos e instale o aparelho sob o estereomicroscópio. </li><li> Com ampliação de 105X, esticar os tendões, enquanto observa o tecido até os vincos já não são perceptíveis. Estiramento por 0,40% adicionais. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Projeção do tendão com ampliação de 105x antes e após o alongamento. </li><li> Ajustar a posição e se concentrar para manter uma imagem clara do tendão mais de uma rotação de 180 °. </li><li> Tirar uma foto a cada 10 ° de rotação, sem alterar o foco de tensão, ou posição. Use apenas o eixo rotativo para realizar a rotação. Devido à sua forma de cone, estes passos podem ser repetidos em diferentes pontos ao longo do tendão. </li><li> Ativar o reconhecimento de ponta e algoritmos de reconstrução do perfil, a fim de analisar o banco de dados que você registrou. </li><li> Livre do tendão soltando os colares de eixo e soprando ar para dentro dos tubos de silicone usando a pipeta de volume micro. </li><li> Reinserir o tendão na placa de manipulação, manuseá-lo novamente pelas extremidades. </li><li> Verificar a forma de a reconstrução do perfil obtido eo valor da área transversal. </li></ol> Parte 3: lavagem Para remover a contaminação que pode ter ocorrido durante as manipulações anterior, os tecidos são lavados sob biossegurança gabinete. 3A) Materiais: <ul><li> Solução salina fria (D-PBS) </li><li> Múltiplas-groove placa manipulação </li><li> Individuais placas de Manipulação </li><li> Fita adesiva </li><li> 2 Pinças </li><li> Uma pinça ficar </li></ul> 3B) Estação de Trabalho: <ol><li> Ligue o ventilador na cabine de segurança biológica 15 minutos de antecedência e limpar as superfícies internas com álcool a 70%. </li><li> Trazer todos os instrumentos dentro da cabine de segurança biológica. </li><li> Vara pedaços de fita adesiva em um canto de cada prato individual para identificar a extremidade proximal. </li><li> Preencher todas as ranhuras com solução salina estéril. </li></ol> 3C) Manipulações: <ol><li> Introduzir a placa de manipulação contendo o tendão extraído no gabinete. </li><li> Usando uma pinça, remova o tendão de seu prato com um aperto suave em cada extremidade. </li><li> Mergulhar e agitar suavemente o tendão na solução salina de cada compartimento da placa de manipulação de múltipla groove, a partir de mais próximo e prosseguindo ao ritmo mais longe. </li><li> Finalmente submergir, o tendão em uma placa de manipulação individual. </li></ol> Parte 4: Carregando em biorreator câmara Para evitar maior contaminação, as manipulações a seguir também são realizadas no gabinete de biossegurança. 4A) Materiais: <ul><li> Biorreator de 4 câmaras </li><li> Âncoras estéril </li><li> Uma placa de Petri estéril </li><li> Médio cela fria cultivados (DMEM) </li><li> Cianoacrilato </li><li> 2 Pinças </li><li> Pinças pé </li><li> 0.5-10μl pipeta Micro-volume </li><li> 1 Régua <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Biorreator câmara </li></ul> 4B) Estação de Trabalho: <ol><li> Desde a etapa anterior também foi realizado em biossegurança do gabinete, remoção de ferramentas desnecessárias lhe dará mais espaço de trabalho. </li><li> Trazer todos os outros instrumentos dentro do armário. </li></ol> 4C) Manipulações: <ol><li> Coloque uma âncora na placa de manipulação com o seu spool centrado sobre a extremidade do tendão e ferir o tecido para cima e ao redor do carretel. </li><li> Rolar a âncora mais e segure a extremidade solta, garantindo que o tecido fica preso à âncora. Parar após ¾ vez. </li><li> Realizar o mesmopassos com a outra extremidade. </li><li> Rolar duas âncoras sobre igual até que é de 6 cm entre seus centros 1. </li><li> Solte o tendão para mergulhá-lo na solução e permitir que as seções ancoradas para secar rapidamente para melhorar suas propriedades mecânicas 2-3. </li><li> Despeje cianoacrilato em placa de Petri e desenhar 2.5μL na pipeta de volume micro. </li><li> Aplique uma gota de cianoacrilato no tecido liquidada sem deixar cair nenhuma cola na solução salina. Repita até 2 gotas foram aplicadas a cada âncora. </li><li> Com o tendão ainda completamente imerso, aguarde 5 minutos para a cola secar completamente. </li><li> Durante este tempo, encher o compartimento de câmara com solução salina. </li><li> Hidratar todos os tecidos com solução salina para evitar danos. </li><li> Manipulando apenas as âncoras, a transferência do tendão na câmara biorreator e fechá-lo para evitar vazamento e contaminação durante a transferência. </li></ol> Parte 5: Resultados Representante: O resultado do protocolo mostra que quando feita corretamente, nosso isolamento do tecido rigoroso procedimento de preparação e torná-lo possível para manter a esterilidade dos tecidos, viabilidade e integridade. Primeiro, usando o método de extração simples e repetitivas, que são capazes de extrair tendões da cauda sem danificar a rede de colágeno como pode ser observado por uma análise microscópica de H &amp; E seções contaminado realizada após a extração. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Rede de colágeno do tendão após a extração (5m seção longitudinal corados com H &amp; E). Em seguida, tendões cultivadas por até dez dias e realizou testes de esterilidade. Cada dia, solução de cultura banhado usado em agar e incubado por 24 horas. Uma vez que não foi observado crescimento bacteriano, concluímos que nossas manipulações não resultam em contaminação. Com o algoritmo de reconstrução perfil e micrômetro óptico, somos capazes de estimar a área transversal dentro de uma margem de 2% de erro 7. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. Reconstrução do perfil de um RTT. Finalmente, avaliamos a viabilidade usando o LIVE / MORTOS Kit de Viabilidade / citotoxicidade para células de mamíferos após a etapa de lavagem e após um período de cultura de doze dias. Uma vez que a grande maioria dos verde fluorescente de células vivas eram evidentes, podemos confirmar que os nossos procedimentos de isolamento são bem sucedidos na preservação do tecido vivo. O mesmo teste foi realizado duas horas depois de prender o tendão para dentro da câmara biorreator. Verificou-se que a desidratação e cola na âncora não havia se espalhado no tecido entre as duas âncoras. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig8.jpg" alt="Figura 8" /> Figura 8. Viabilidade do tecido na âncora (verde = células vivas, vermelho = células mortas)

<ol>
	<li>Bennett, M. B., Ker, R., Dimery, N., Alexander, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+various+mammalian+tendons.">Mechanical properties of various mammalian tendons.</a> J. Zool. Lond. A209, 537-548 (1986).</li><li>Dupuis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> D&#233;shydratation de matrices collag&#233;niques reconstruites in vitro: effets sur les propri&#233;t&#233;s m&#233;caniques et histologiques [dissertation]. , 114-114 (1981).</li><li>Haut, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+influence+of+strain+rate+on+the+tensile+failure+of+rat+tail+tendon.">Age-dependent influence of strain rate on the tensile failure of rat tail tendon.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 105, 296-299 (1983).</li><li>Hupp&#233;, N., Lessard, J. -. L., Langelier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bioreactor+Design+for+the+Mechanobiological+Study+of+Soft+Tissue+Damage+and+Repair+in+Conditions+that+Provide+the+Best+Approximation+of+Actual+Use.">A Bioreactor Design for the Mechanobiological Study of Soft Tissue Damage and Repair in Conditions that Provide the Best Approximation of Actual Use.</a> , (1985).</li><li>Langelier, E., Dupuis, D., Guillot, M., Goulet, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Rancourt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-sectional+profiles+and+volume+reconstructions+of+soft+tissues+using+laser+beam+measurements.">Cross-sectional profiles and volume reconstructions of soft tissues using laser beam measurements.</a> J Biomech Eng. 126, 796-802 (2004).</li><li>Lee, T. Q., Woo, S. L. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+determining+cross-sectional+shape+and+area+of+soft+tissues.">A new method for determining cross-sectional shape and area of soft tissues.</a> J Biomech Eng. 110, 110-114 (1988).</li><li>Parent, G., Cyr, M., Cousineau-Pelletier, P., Desbiens-Blais, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Langelier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Techniques+for+the+Evaluation+of+Cross-Sectional+Area+in+Rat+Tail+Tendons+Generate+Significant+Errors.">Current Techniques for the Evaluation of Cross-Sectional Area in Rat Tail Tendons Generate Significant Errors.</a> , (1985).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Aplicando os procedimentos experimentais, podemos realizar uma grande variedade de estudos in vitro sobre este tipo de tecidos. Como por exemplo, um estudo sobre a degeneração do tecido foi realizada pela aplicação de sub-estimulação para RTTs por um período de 10 dias. Cada dia, nós avaliamos as propriedades mecânicas do tecido em ensaios não-destrutivos de relaxamento stress. No final, pudemos observar variação de tensão RTT e, portanto, analisar a evolução das propriedades mecânicas....

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>D-PBS </td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc.</td>
<td>311-410-CL</td>
<td>Saline solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Glucose </td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc. </td>
<td>609-037-EL </td>
<td>Saline solution
 1g/L</td>
</tr>
<tr>
<td>Antibiotics-antimycotics </td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen Corp.</td>
<td>15240-062 </td>
<td>Saline solution
 1%</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen Corp.</td>
<td>12800-017</td>
<td>Culture solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Bicarbonate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc.</td>
<td>600-105-CG</td>
<td>Culture solution 3.7g/L</td>
</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc.</td>
<td>090150</td>
<td>Culture solution 10%</td>
</tr>
<tr>
<td>Antibiotics-antimycotics</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen Corp.</td>
<td>15240-062</td>
<td>Culture solution 1%</td>
</tr>
<tr>
<td>Optic Micrometer</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Manipulation plate</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bioreactor chamber</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation of rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies

Tendões de ratos de cauda (RTTs) são um modelo comum biológicos utilizados em estudos experimentais in vitro nas áreas de fisiologia do tendão e tendinopatia. Trabalhando com esses tecidos é um desafio, porque eles são muito frágeis, e até agora não havia nenhum protocolo rigorosamente detalhadas para o seu isolamento. Diante desses desafios, temos desenvolvido métodos e instrumentos para facilitar a manipulação de RTTs e tecido controle de viabilidade esterilidade e integridade. Este artigo descreve os procedimentos experimentais usados ​​para preparar RTTs para estudos biomecânicos e mechanobiological. Nosso trabalho é dividido em quatro etapas principais: extração, transversal medição da área, lavagem e carregamento na câmara biorreator. A cada passo, todos os procedimentos, materiais e manipulações são apresentados em detalhe, para que possam ser facilmente reproduzidos. Além disso, os instrumentos específicos desenvolvidos são apresentados: uma placa de manipulação usada para segregar RTTs, um micrômetro óptico para posicionar o tecido durante a medição da área transversal e um sistema de ancoragem para fixar a RTTs em um biorreator. Por fim, descrevemos os resultados obtidos após vários testes para validar os nossos métodos. Avaliações a viabilidade de esterilidade e integridade demonstrar que os nossos procedimentos são suficientemente rigorosas para manipulações de tecidos frágeis, como os tendões da cauda de rato.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies at JoVE.com

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Este artigo descreve os procedimentos experimentais usados ​​para preparar os tendões da cauda de rato para estudos biomecânicos e mechanobiological. Várias características dos principais passos na preparação são demonstrados, começando com a extração, transversal medição da área, lavagem e carregamento na câmara biorreator.

Preparação de tendões da cauda de rato de Estudos biomecânicos e Mechanobiological

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

preparation-rat-tail-tendons-for-biomechanical-mechanobiological

Research

JoVE Journal

Biology

16.8K visualizações.  Université de Sherbrooke. Este artigo descreve os procedimentos experimentais usados ​​para preparar os tendões da cauda de rato para estudos biomecânicos e mechanobiological. Várias características dos principais passos na preparação são demonstrados, começando com a extração, transversal medição da área, lavagem e carregamento na câmara biorreator.

Vídeo: Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Interview: Protein Folding and Studies of Neurodegenerative Diseases

In this interview, Dr. Lindquist describes relationships between protein folding, prion diseases and neurodegenerative disorders. The problem of the protein folding is at the core of the modern biology. In addition to their traditional biochemical functions, proteins can mediate transfer of biological information and therefore can be considered a genetic material. This recently discovered function of proteins has important implications for studies of human disorders. Dr. Lindquist also describes current experimental approaches to investigate the mechanism of neurodegenerative diseases based on genetic studies in model organisms.

In this interview, Dr. Lindquist describes relationships between protein folding, prion diseases and neurodegenerative disorders. The problem of the protein folding is at the core of the modern biology. In addition to their traditional biochemical functions, proteins can mediate transfer of biological information and therefore can be considered a genetic material. This recently discovered function of proteins has important implications for studies of human disorders. Dr. Lindquist also describes current experimental approaches to investigate the mechanism of neurodegenerative diseases based on genetic studies in model organisms.

Entrevista: o dobramento de proteínas e Estudos de Doenças Neurodegenerativas

In this interview, Dr. Lindquist describes relationships between protein folding, prion diseases and neurodegenerative disorders. The problem of the ...

Biologia

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) would provide a powerful platform for neuroscientists to investigate axo-glial interactions, properties and differentiation of multipotent progenitors, and progression of oligodendroglial lineage cells at the cellular and molecular level.  We describe here a CNS aggregate culture system from embryonic rat forebrains, which can be maintained in a serum-free medium up to 3-4 weeks and is used in our laboratory as a model to study neuron-glia interaction and CNS myelination.  This video clip will demonstrate how to isolate and grow these CNS aggregate cultures from E16 rat brain.  Furthermore, from the same brain dissection, highly enriched regular dissociated neuronal cultures can be readily obtained and used for various studies on CNS neurons or used for co-cultures with other cells. 

A protocols for an embryonic rat brain aggregate culture system is described. Multipotent progenitors in the aggregates can develop and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes.

Preparação das Culturas cérebro de um rato Aggregate para Neuron Glia e Estudos de Desenvolvimento

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

The anterior surface of the ocular lens is covered by a monolayer of epithelial cells, which proliferate in an annular zone underlying the ciliary body.  Following division, these cells migrate posteriorly, where FGF diffusing from the retina induces them to differentiate into a posterior array of elongated lens fiber cells, which compose the bulk of the lens.  Differentiation of lens epithelial cells into lens fibers can be induced in vitro by culturing explants of the central region of the anterior epithelium in the presence of FGF-2.  Explants are prepared from lenses of neonatal rats by removing the lens from the eye and grasping the lens capsule on the posterior side with dissecting tweezers.  The posterior capsule is then gently torn open and pressed down into the plastic bottom of a tissue culture dish. The peripheral regions of the explant are removed with a scalpel and the central area is then cultured in the presence of 100ng/ml FGF-2 for as long as 2-3 weeks, depending on the parameters to be studied.  Since epithelial cells in cultured explants differentiate in approximate synchrony over a period of days to weeks, the time course of signaling and gene expression can be determined using molecular, biochemical, and pharmacological techniques.  Immunofluorescence microscopy is a powerful adjunct to these methods as it demonstrates the subcellular localization of proteins of interest and can reveal the physiological consequences of experimental manipulations of signaling pathways.

Explants of the central region of rat lens epithelia differentiate synchronously when cultured in the presence of FGF-2. Immunofluorescence microscopy of such cultures can provides novel information about gene expression and signaling events associated with terminal differentiation.

Preparação e Cultura de explantes Rat Lens epitelial para estudar a diferenciação terminal

The anterior surface of the ocular lens is covered by a monolayer of epithelial cells, which proliferate in an annular zone underlying the ciliary body.  ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagênese e Análise Funcional de canais iônicos Heterologously Expresso em células de mamíferos

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there have been significant advances in our understanding of the functions of mitochondria other than the generation of energy. These include their role in apoptosis, acting as signalling organelles, mammalian development and ageing as well as their contribution to the coordination between cell metabolism and cell proliferation. Our understanding of biological processes modulated by mitochondria is based on robust methods for isolation and handling of intact mitochondria from tissues of the laboratory animals. Mitochondria from rat heart is one of the most common preparations for past and current studies of cellular metabolism including studies on knock-out animals.
Here we describe a detailed rapid method for isolation of intact mitochondria with a high degree of coupling. Such preparation of rat heart mitochondria is an excellent object for functional and structural research on cellular bioenergetics, transport of biomolecules, proteomic studies and analysis of mitochondrial DNA, proteins and lipids.

We describe &#1072; protocol for isolation of pure, highly coupled rat heart mitochondria for functional or structural studies of cellular bioenergetics, biophysical measurements, proteomics or mitochondrial DNA and lipids analysis.

Preparação de coração de rato altamente acoplado mitocôndrias

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

Na eletroporação in vivo de Morpholinos no Adulto Regeneração Zebrafish Cauda Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantificar Único microvasos Permeabilidade em perfusão isolada-Sangue Rat Lung Preparação

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Preparação de Rat Serum Indicado para cultura de embriões de mamíferos Whole

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

A amostragem de sangue a partir da veia lateral da cauda do rato

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe a new strategy that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues, to generate mammalian pluripotent cells. Two main steps are required. In the first step, adult mature (terminally differentiated) cells are exposed to the epigenetic eraser 5-aza-cytidine to drive them into a pluripotent state. This part of the protocol was developed, based on the increasing understanding of the epigenetic mechanisms controlling cell fate and differentiation, and involves the use of the epigenetic modifier to erase cell differentiated state and then drive into a transient high plasticity window.
In the second step, erased cells are encapsulated in polytetrafluoroethylene (PTFE) micro-bioreactors, also known as Liquid Marbles, to promote 3D cell rearrangement to extend and stably maintain the acquired high plasticity. PTFE is a non-reactive hydrophobic synthetic compound and its use permits the creation of a cellular microenvironment, which cannot be achieved in traditional 2D culture systems. This system encourages and boosts the maintenance of pluripotency though bio-mechanosensing-related cues.
The technical procedures described here are simple strategies to allow for the induction and maintenance of a high plasticity state in adult somatic cells. The protocol allowed the derivation of high plasticity cells in all mammalian species tested. Since it does not involve the use of gene transfection and is free of viral vectors, it may represent a notable technological advance for translational medicine applications. Furthermore, the micro-bioreactor system provides a notable advancement in stem cell organoid technology by in vitro re-creating a specific micro-environment that allows for the long-term culture of high plasticity cells, namely as ESCs, iPSCs, epigenetically erased cells and MSCs.

We here present a method that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues to efficiently generate mammalian pluripotent cells, without the need of gene transfection or retroviral vectors. This strategy is, therefore, promising for translational medicine and represents a notable advancement in stem cell organoid technology.

Uma estratégia de duas etapas que combina modificação epigenética e sinais biomecânicos para gerar células pluripotentes mamíferas

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...