O objetivo deste procedimento é comparar o dispositivo padrão de biofilme da tampa de pino com um dispositivo de biofilme de poço profundo de polipropileno através de coloração violeta cristalina e testes de suscetibilidade antimicrobiana. Um dispositivo padrão de biofilme de tampa de pino tem 96 pinos e se encaixa em cima de uma placa de microteter padrão de 96 poços, permitindo experimentos de biofilme de alto rendimento. A tampa de pino fornece uma superfície para o crescimento de biofilmes e biofilmes cultivados nos pinos podem ser ainda mais analisados em experimentos a jusante.
No entanto, as placas utilizam um volume máximo de 200 microliters tornando mais desafiador estudar a formação de biofilme e a biomassa usando experimentos que exigem maiores quantidades de biofilme. Aqui, descrevemos o dispositivo de biofilme profundo para cultivar biofilmes estáticos. O dispositivo de biofilme bem profundo utiliza uma placa microtiter bem profunda de 96 poços de profundidade equipada com uma placa PCR de 96 poços semi-saias como a tampa de pino.
Este método permite um volume máximo de placas de 750 microliters, fornece mais área de superfície de pino para o crescimento de biofilm, e é menor em custo em comparação com o dispositivo biofilm padrão. Descreveremos e compararemos os protocolos de coloração violeta cristalina de biofilmes para determinar a biomassa biofilme, bem como a determinação da concentração mínima de erradicação de biofilmes, também conhecida como MBEC. Mostrado é uma visão geral esquemática do experimento que será descrito.
Raia desejava cepas bacterianas de um estoque criopreservado diretamente em uma placa de ágar nutriente. Incubar placas de ágar durante a noite com condições ideais de tensão. No dia seguinte, inocular uma única colônia em cinco mililitros de mídia de crescimento e cultivar culturas em uma incubadora durante a noite.
As placas de biofilme serão preenchidas como mostrado. Encha os poços externos com 750 microliters de água estéril e poços de controle negativos com 750 microliters de mídia de crescimento estéril. Encha os poços restantes com 675 microliters de mídia de crescimento estéril.
Padronize culturas durante a noite para uma densidade óptica a 600 nanômetros de 1,0. Crie uma série de diluição de dez vezes até que uma diluição de 10 a menos três seja alcançada. Poços de mídia inoculados com a cultura diluída de 10 a menos três para uma diluição bacteriana final de 10 para o menos quatro e volume total final em poço de 750 microliters.
Insira cuidadosamente a tampa do pino na placa de biofilme. Incubar placas em condições ideais de tensão com tremor máximo de 160 RPM por 24 horas. Remova cuidadosamente a tampa do pino da placa de crescimento do biofilme e enxágue os biofilmes em uma nova placa de poço profundo cheia com 800 microliters de PBS estéreis por poço.
Transfira as tampas de pinos para uma nova placa de poço profundo contendo 800 microliters por poço de 0,1% de peso em volume cristal violeta e deixe manchar por cinco minutos. Enxágüe as tampas novamente em uma placa fresca e profunda e cheia de PBS para remover o excesso de manchas. Depois de permitir que as tampas sequem por 10 minutos em um armário de biossegurança, desestabilizam os pinos em uma placa de poço profundo cheia de 800 microliters de ácido ascético de 30% por poço durante cinco minutos.
Retire a tampa do pino e misture bem para distribuir uniformemente a mancha. Transfira 200 microliters do dispositivo biofilme de poço profundo em uma placa de microteter padrão de 96 poços e leia a densidade óptica em 550 nanômetros. As placas de desafio antimicrobiano serão preparadas como mostrado.
Encha os poços externos com 750 microliters de água estéril e os poços de controle positivo e negativo com 750 microliters de mídia de crescimento. Encha os poços restantes com 750 microliters da série de diluição antimicrobiana desejada. Remova cuidadosamente a tampa do pino do dispositivo e enxágue em uma placa de poço profundo estéril com 800 microliters por poço de PBS.
Transfira a tampa do pino para a placa de desafio antimicrobiana e incubar para o prazo de exposição desejado. Remova aspas aspáticas da placa de exposição antimicrobiana e enxágue em uma placa estéril e cheia de PBS. Remova a tampa do pino do PBS e transfira para uma nova placa de poço profundo contendo 750 microliters de mídia de recuperação por poço.
Sonicar a placa em um banho de água sônica por 30 minutos. Remova a tampa do pino e substitua por uma tampa de placa de microtiter plana padrão não atrelada para evitar contaminação. Incubar em condições ideais de tensão durante a noite.
No dia seguinte, transfira 200 microliters da placa do poço profundo para uma placa de microtítmetro padrão e leia a densidade óptica a 600 nanômetros. A coloração violeta cristalina é um método eficaz e amplamente utilizado para aproximar a biomassa de biofilmes bacterianos. A coloração cristalina dos dispositivos de poço padrão e profundo mostrou que ambas as espécies bacterianas cresceram significativamente mais biomassa no dispositivo de poço profundo em comparação com o dispositivo padrão com escherichia coli formando 2,1 vezes mais biomassa em comparação com o dispositivo biofilme padrão e Pseudomonas aeruginosa formando 4,1 vezes mais biomassa.
Esses resultados foram consistentes com nossa hipótese de que o aumento da área superficial do dispositivo de biofilme de poços profundos permitiria um aumento do acúmulo de biomassa. Apesar da maior variabilidade na replicação técnica de valores manchados de CV para ambas as cepas que crescem no dispositivo do poço profundo, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas para as réplicas biológicas de qualquer uma das espécies usando a ANOVA bidirecional ou o teste T do aluno com valores P superiores a 0,05. Este achado mostra que a formação de biofilmes por dispositivos de poços profundos formam biofilmes reprodutíveis semelhantes aos dos dispositivos padrão.
Nossos resultados após a padronização da biomassa biofilme para área de volume e superfície de pinos entre os dispositivos padrão e poço profundo indicaram uma ligeira, mas significativa preferência material entre as duas espécies bacterianas testadas. No dispositivo de poço profundo de polipropileno, Pseudomonas aeruginosa demonstrou um aumento relativo de 1,4 vezes na formação de biomassa e escherichia coli demonstrou uma diminuição relativa de 1,52 vezes na formação de biomassa com o efeito inverso observado no dispositivo padrão de poliestireno. Essa diferença na preferência de espécies bacterianas pelo material de pino de dispositivo biofilme indica que os resultados não podem ser comparados entre dispositivos biofilm.
O desafio antimicrobiano dos biofilmes 24 horas foi testado usando o cloreto de benzalkonium composto de amônio quaternário que é conhecido por ser um inibidor eficaz da formação de biofilmes bacterianos, mas um antimicrobiano menos eficaz para erradicação de biofilmes. Nossos resultados mostraram que os valores BZK BMEC obtidos do dispositivo de biofilme de poço profundo aumentaram em média seis vezes para Escherichia coli e oitovezes para Pseudomonas aeruginosa quando comparados ao crescimento no dispositivo biofilme padrão. Os resultados do BZK MBEC foram mais variáveis como esperado, uma vez que é um antimicrobiano menos eficaz para erradicação de biofilmes e resultou em uma faixa para valores Escherichia coli MBEC em ambos os dispositivos devido a um par de pinos de biofilme outlier que sobreviveram em concentrações mais altas.
Também comparamos o alvejante desinfetante, que é conhecido por ser um antimicrobiano muito eficaz para erradicação de biofilmes bacterianos. O alvejante demonstrou um valor mbec ligeiramente maior quando testado no dispositivo padrão em comparação com o dispositivo de poço profundo para ambas as espécies, levando a um aumento de quatro vezes na Escherichia coli e um aumento duplo em Pseudomonas aeruginosa, respectivamente. No entanto, essas diferenças estavam dentro do intervalo de erro reprodutível entre dispositivos e demonstravam muito menos variabilidade do que o BZK, confirmando o alvejante como um antimicrobiano mais eficaz para erradicação de biofilm.
Uma grande limitação de cada dispositivo biofilme seria a composição plástica diferente dos pinos e a variabilidade resultante na adesão e formação de biomassa de diferentes espécies bacterianas a essas superfícies. Além disso, as interações químicas e as compatibilidades entre diferentes antimicrobianos e o material de pino de plástico devem ser levadas em conta antes de realizar o protocolo descrito. Em conclusão, este protocolo e os achados de nossas comparações de biomassa nos poços profundos e dispositivos biofilmes padrão mostram que ambos são capazes de cultivar robustos biofilmes robustos de Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa com o dispositivo de poço profundo fornecendo significativamente mais biomassa por área de superfície de pino do que o dispositivo padrão.
O dispositivo de biofilme de poço profundo oferece uma alternativa viável e acessível para estudos estáticos e de alto rendimento de biofilme e triagem que requerem maiores quantidades de biofilme para análise a jusante. Devido às diferenças nas composições de materiais plásticos entre cada dispositivo, a biomassa biofilm manchada de CV e os valores mbec não podem ser diretamente comparados entre os dispositivos. No entanto, se os experimentos são consistentemente conduzidos no mesmo dispositivo, os resultados obtidos entre isolados e antimicrobianos são comparáveis.
O dispositivo de biofilme de poço profundo é recomendado para laboratórios que gostariam de estudar biofilmes em ensaios de alto rendimento usando materiais de baixo custo.
