Esta pesquisa foi financiada pelo prêmio do USDA-NIFA 2015-67015-23488 para Roger Cone. Os autores agradecer Dr. Ronald Phelps para a descrição dos critérios de seleção de ações ninhada no vídeo. Ahmed Elaswad e Karim Khalil gostaria de agradecer para os egípcios Cultural e educacional em Washington DC para financiar a sua investigação de doutoramento.

Este experimento foi conduzido na unidade de pesquisa genética de peixes, E. W. Shell Fisheries Research Center, Universidade de Auburn, AL. Todos os protocolos experimentais utilizados neste experimento foram aprovados pelo Comitê de uso (AU-IACUC) e Auburn University institucional Cuidado Animal antes que o experimento foi iniciado. Uma lista de equipamentos e suprimentos usados neste experimento pode ser encontrada na tabela de materiais. A seguir estão as etapas e procedimentos para a preparação e microinjeção de embriões de uma célula de bagre do canal conforme ilustrado na Figura 1.
1. ninhada de desova e seleção das ações
<ol><li>Escolha saudável channel catfish estoque ninhada do estirpe ou linha genética de interesse. Fêmeas e machos de bagre do canal devem apresentar boas características de sexuais secundárias.</li>
	<li>Selecione os machos que têm uma ampla cabeça muscular que é maior do que o resto de seus corpos com papila genital bem desenvolvida. Cor escura, cicatrizes e feridas de combate territorial também são sinais de prontidão sexual. Selecionar as fêmeas que têm cabeças que são mais estreitas do que o resto de seus corpos e tem o abdômen macio, palpável, bem-arredondado. Para precisão e evitar salientando os peixes durante o tratamento inicial, pare de alimentar as fêmeas 2-3 dias antes de examinar a sua prontidão para a desova.</li>
	<li>Execute o peixe manipulação rapidamente, mas cuidadosamente. Para reduzir o estresse da manipulação, execute todos os procedimentos que exigem manipulação fêmeas enquanto segura o peixe desova sacos (malha de tamanho de 32 mm).</li>
	<li>Pouco antes da injeção de hormônio para induzir a ovulação, medir o peso do corpo das fêmeas.</li>
	<li>Pendure os desova sacos com fêmeas dentro de um fluxo através de tanque com fluxo contínuo de água e aeração adequada.</li>
	<li>Assepticamente, carrega a implantar que tem uma agulha de 14g com 85 µ g/kg de implante (LHRHa) analógico de hormônio de liberação de hormônio luteinizante. Lave o local da injeção (musculatura dorsal) com solução salina estéril 0,9%, antes da injeção. Inserir a implantar em um ângulo de 45° e liberar o implante. Retire a agulha e o local da injeção de furto com uma bola de algodão previamente embebida em etanol 70%.</li>
	<li>Lugar o saco de desova no tanque de exploração para que o peixe está completamente submersa em água 15-20 cm abaixo da superfície da água. Aeração adequada (acima de oxigênio dissolvido a 5 ppm) e a boa qualidade da água são importantes para a ovulação de ovos de alta qualidade.</li>
	<li>Prever o tempo de ovulação baseado na temperatura da água, usando a relação de graus-hora (h)35. Tempo de resposta de grau-h = tempo entre a injeção de hormônio e ovulação (h) * temperatura (° C) de água. Por exemplo, para um tempo de resposta de grau-h de 900-1000, uma fêmea é esperada para desovar em 36-40 h de tempo de injeção de hormônio a 25 ° C. Geralmente, o primeiro cheque para ovos é feito em cerca de 36 h após a injeção de hormônio e, depois, no intervalo de 4h.</li>
	<li>Para verificar se há ovulação, retire o saco de desova acima da superfície da água enquanto você está procurando os ovos que estão conectados dentro do saco de desova. Vendo pelo menos 10 ovos indica esta fêmea ovulating e pronto para descascar da mão.</li>
</ol>2. preparação de esperma
Nota: Esperma pode ser preparada alguns h antes do tempo esperado da ovulação.
<ol><li>Eutanásia em machos por uma percussão pancada na cabeça sem anestesia, desde que a anestesia pode ter um efeito negativo na mobilidade do esperma.</li>
	<li>Recolher os testículos em uma panela pequena de pesagem, remover todo o tecido e lave-os com 50 mL de solução salina 0,9% para remover o sangue, se necessário. Testículos bem desenvolvidos são brancos com muitas projeções villiform ( Figura 2).</li>
	<li>Determine o peso dos testículos.</li>
	<li>Para preparar a solução de esperma para fertilização do ovo, transferi os testículos para o centro de um 100 cm2 100 µm de malha usando fórceps. Dobre a malha com os testículos dentro, esmagar os testículos e o esperma do filtro em um tubo de coleta de 50 mL. Isso pode ser feito através da aplicação de pressão para testículos dentro da malha contra a borda do tubo da coleção através do polegar. Use solução salina 0,9% para lavar o esperma da malha no tubo de coleta. Solução salina pode ser adicionada até 10 mL/g de testículos.</li>
	<li>Determinar a concentração do esperma, verificar a motilidade e viabilidade. Nota: A concentração pode ser determinada através da contagem de espermatozoides num volume conhecido diluídos de milt usando um hemocytometer. Alternativamente, a densidade do esperma pode ser estimada através da avaliação da densidade óptica de milt usando um espectrofotômetro. Neste método, a absorção, o comprimento de onda 505 nm é comparada a um gráfico de controle que foi previamente preparado para a absorção de diferentes concentrações de esperma36. Mobilidade do esperma pode ser verificada sob o microscópio, como o tempo de ativação do esperma até cessação do esperma movimento (chamado a duração da motilidade)37. A viabilidade do esperma pode ser determinada pela coloração do esperma com corantes seletivos como trypan azul, que manchará espermatozoides só não viáveis, enquanto esperma viável permanecerá imaculada. No entanto, para esses procedimentos de microinjeção, isso não é necessário se os testículos são bem desenvolvidos.</li>
	<li>Armazenar esperma em soro fisiológico a 0,9% da etapa 2.5 a 4 ° C e usar dentro de 24 horas após o preparo.</li>
</ol>3. recolha e fertilização do ovo
<ol><li>Aplique uma camada muito fina de gordura para um diâmetro de 20 cm limpo e seco desova pan vegetal.</li>
	<li>Coloque a fêmea na solução anestésica contendo 100 ppm de sulfonato de metano tricaina tamponada com bicarbonato de sódio (pH da solução final deve ser 7.0) até que o peixe é completamente anestesiados38. Cuidado: Tricaina sulfonato de metano pode ser irritante se inalado, ingerido ou absorvido pela pele.</li>
	<li>Com cuidado, retire o peixe do saco desova e mergulhá-lo em soro fisiológico a 0,9% para lavar a solução anestésica. Seca o peixe completamente usando uma toalha limpa, evitando a remoção da camada de muco na superfície do corpo de peixe.</li>
	<li>Aplica gordura vegetal na área em torno do respiradouro, incluindo as nadadeiras pélvicas, para evitar a penhora dos ovos durante o descascamento de mão.</li>
	<li>Mão tira os ovos na panela untada desova, aplicando uma pressão suave para os ovários. Ovos bons devem fluir livremente, ser amarelo dourado na cor e têm mínimos ou sem grumos ou coágulos de sangue (Figura 2). Evite o contacto entre ovos e água antes de fertilização, como a água pode estimular fechamento micrópila.</li>
	<li>Para fertilizar os ovos para microinjeção, transferi 200 – 300 ovos para uma desova untada. Planta de plástico untado rótulos pode ser usadas como uma colher para transferir os ovos para a desova untada. Adicionar 1-2 mL da solução de esperma (da etapa 2.5) com os ovos e misture delicadamente. O rácio de esperma para ovo deve ser aproximadamente 11.000 esperma e do ovo.</li>
	<li>Adicione água doce para os ovos para ativar os espermatozoides e óvulos. Adicione água suficiente para cobrir um pouco os ovos. Agite suavemente os ovos por 30 s. fertilização deve ocorrer em 1 a 2 min. É importante fertilizar os ovos que estão dispostos em uma única camada. Ovos de peixe-gato aderirem ao outro dificultando a microinjeção de múltiplas camadas de embriões.</li>
	<li>Adicionar mais água doce para os ovos fertilizados e permitir que os ovos endurecer por 10 a 15 min.</li>
	<li>Tampe a panela desova contendo o restante dos ovos não fertilizados em uma toalha molhada para evitar a secagem e fertilizar durante algumas horas. Fertilização pode ser feita de forma escalonada, por exemplo,, um lote de 200 – 300 ovos podem ser fertilizado cada 30-60 min para garantir um fornecimento contínuo de embriões na fase de uma célula para microinjeção e controle não injectada embriões. Evite o contacto entre a toalha molhada e os ovos como os ovos podem aderir a toalha molhada, tornando difícil para removê-los. Neste protocolo, ovos fertilizados dentro de 2-3 h após o descascamento foram injetados com eficiência e teve sucesso similar como ovos fertilizados imediatamente após o descascamento.</li>
</ol>4. agulha puxando e carregamento
<ol><li>Colocar um vidro de borosilicato de OD 1,0 mm capilar 2 agulhas (Figura 3). Armazene as agulhas em uma caixa de papel com um pedaço de esponja em que foram feitas várias incisões. Para evitar quebrar a agulha, o diâmetro da esponja deve ser menor que o comprimento da haste da agulha.</li>
	<li>Abra a ponta da agulha, quebrando um pedaço pequeno de região mais fina da agulha, usando um objeto pontiagudo. Como alternativa, abra a agulha por beliscar fora da região mais fina da ponta com pinça sob o microscópio.</li>
	<li>Prepare a solução de injeção através da mistura de gRNA(s) com Cas9 proteína. Outros tipos de RNA ou proteína também podem ser injetados com o mesmo procedimento. Neste protocolo, gRNAs foram projetados para alvo dois dos bagres do canal imune relacionados genes, pedágio/interleucina 1 receptor domínio-contendo adaptador molécula (TICAM1) gene e gene de lectina (RBL) de vinculação de ramnose e preparados de acordo com Soares et al. com o uso de uma alta fidelidade Taq polimerase32,39. As metas de genômicas para gRNAs eram 5' GGA GGT GAA GCA CGT GGA de CGA 3' do gene TICAM 1 (Figura 4) e 5' GGA CTT TGA GTC GGA GAA GTG G 3' exon 1 do gene RBL com motivo de protospacer adjacentes (PAM) sequência sublinhada (Figura 6).<ol>
<li>Alvos de guia RNA explosão contra o genoma channel catfish sequenciar e selecionar aqueles com nenhum potenciais sites fora do alvo.</li>
		<li>Vermelho de fenol Adicione cor a proteína gRNA/Cas9 misturar-se a um terço do volume total.</li>
		<li>Ajustar a concentração final da mistura de proteína de gRNA/Cas9 com água livre de nuclease, para que cada embrião é injetado com 50 nL contendo aproximadamente 2,5 ng gRNA e 7,5 ng Cas9 de proteína. Incube a mistura durante 10 minutos no gelo antes de usar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Com um microloader, carrega 5 – 10 µ l da mistura de gRNA/Cas9 para a agulha de injeção introduzindo o microloader na haste da agulha e expulsando a mistura lentamente enquanto retrai a ponta de microloader (Figura 3). Evite aprisionando bolhas de ar dentro.</li>
	<li>Anexar a agulha para o titular micropipeta e garantir uma conexão apertada e em seguida, anexar o titular para o micromanipulador. Garantir a livre circulação estável. Aplique pressão para microinjection abrindo o cilindro de nitrogênio e ajustar o regulador de pressão. Nota: O volume de injeção pode ser afetado pela pressão, diâmetro da abertura da agulha e a duração da injeção. Para determinar o volume a injectar, injete uma gota de óleo mineral, colocado em um hemocytometer. Se necessário, a pressão, a duração da injeção e o diâmetro da agulha pode ser ajustada para aumentar ou diminuir o volume da injeção. Injecte várias vezes o óleo mineral para garantir volume consistente.</li>
</ol>5. microinjeção de embriões de peixe-gato
<ol><li>Aplica uma camada muito fina de gordura para um prato de Petri limpo 100mm vegetal.</li>
	<li>Usando um rótulo de planta de plástico untado, transferir 50 – 100 ovos da fertilização panela para o prato de Petri e cubra-os com solução de Holtfreter (tabela de materiais). Alinhe os ovos uns contra os outros em uma única camada. Este alinhamento deve manter os ovos no lugar durante o processo de microinjeção.</li>
	<li>Coloque a placa de Petri com os ovos no palco do microscópio e segure-o com uma mão. Abaixe a agulha com a outra mão (Figura 3) até que perfure o córion e a gema em um único movimento suave. A ponta da agulha deve ser tão próxima quanto possível para o discoidal antes de entregar o material de injeção.<ol>
<li>Pressione o pedal para entregar o material de injeção para a gema. Se o discoidal não é claramente visível, o material de injeção pode ser espalhado em diferentes locais a gema. Para isso, a agulha é inserida até o final da gema e, em seguida, pressionando o pedal e retirar a agulha são feitas simultaneamente para espalhar o material de injeção através de diferentes áreas da gema. Até 50 nanoliters pode ser injetado a gema do bagre do canal embriões, no entanto, a quantidade de proteína de gRNA/Cas9 precisa ser otimizado para cada gene alcançar os melhores resultados para a mutação taxa e embrião sobrevivência32.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire a agulha suavemente para não danificar o ovo. Mova a placa de Petri para injetar outro ovo com o mesmo procedimento. Evite movimento da caixa de Petri durante o processo de injeção, pois isso pode danificar o ovo ou quebrar a agulha. Remova os ovos que se rompeu ou danificados devido a microinjeção. A injeção pode ser iniciado em 15 – 20 min após a fertilização e continuar enquanto os embriões estão ainda em fase de uma célula (até cerca de 60-90 min após a fertilização).</li>
	<li>Coloque embriões injetados em solução do Holtfreter com 10 ppm de doxiciclina e aeração suave contínua por 6-7 dias até40de incubação. Alterar a solução diariamente e remover os embriões mortos.</li>
</ol>6. mutação deteção
<ol><li>Aleatoriamente, coletar vários embriões injetados na fertilização post de 72 h, retire a gema e extrair DNA genômico. Incluem os embriões não injectada de 3 – 5 como um controle. Nota: DNA genômico pode ser extraído de embriões após a remoção das cascas de ovos e material de gema usando digestão proteinase K e precipitação de etanol32.</li>
	<li>Amplifica um segmento de ADN flanqueando os alvos genômicos para gRNA de cada gene, onde as mutações são esperadas para ocorrer, usando uma alta fidelidade Taq polimerase32. Para TICAM 1, as primeiras demão 5' GCTGCTGAATGTCTGATTATG 3' (em frente) e 5' GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (reverso) foram utilizados para amplificar um 750 bp enquanto para RBL, as primeiras demão 5' TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA 3' (em frente) e 5' AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3' (reverso) foram usados para amplifica um segmento bp 375 do gene de RBL.<ol>
<li>Use a seguinte reação de PCR: até 20 água de µ l do PCR da classe; 1 x alta fidelidade amortecedor da reação da enzima Taq com MgCl2, 0,2 mM dNTP mix, 0,4 µM para cada um da cartilha frente e verso do mesmo conjunto, 100-300 ng DNA genômico e 1,25 unidades de mistura de enzima Taq alta fidelidade. Executar o ciclismo condições do PCR: desnaturação inicial a 94 ° C por 3 min; 35 ciclos de desnaturação a 94 ° C por 30 s, recozendo a 60 ° C para 55 s para TICAM e 40 s para RBL, extensão a 72 ° C, durante 1 min/kb; e uma extensão final a 72 ° C por 10 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Detectar os embriões mutantes usando um método de deteção de mutação como sequenciamento de purificado produtos PCR, ensaios de deteção de mutação de agrimensor, ensaio de mobilidade doheteroduplex, perda do sítio de reconhecimento de enzima de restrição, ou qualquer outro método de deteção mutação que é apropriado para o alvo. Neste protocolo, detecta embriões mutantes usando o ensaio de deteção de mutação surveyor para TICAM 1 e perda da enzima de restrição que SAPI corte local, bem como a sequenciação de purificado produtos PCR para o gene RBL.</li>
	<li>Para identificar os alelos mutantes, clone produtos do PCR e vetores da sequência das colônias individuais. Os alelos mutantes, apresentados na Figura 4 e Figura 6 veio de embriões injetados. Produtos PCR de seis injetadas e embriões de controle 3 para cada gene foram agrupados em dois tubos separados, um para embriões microinjected e o outro para embriões de controle, rapidamente clonados e 86 vetores para TICAM 1 e 48 vetores para gene RBL sequenciado, incluindo 8 reações de 3 embriões não injectada de controle para cada gene de sequenciamento.</li>
	<li>Para identificar diferentes alelos mutantes, compare as sequências de embriões mutantes para a sequência de tipo selvagem usando qualquer ferramenta de alinhamento de sequência de DNA como explosão ou T-café.</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm nenhum conflito de interesses.

Foi apresentado um protocolo detalhado para microinjeção de embriões de bagre do canal para conseguir o nocaute do gene. Injeção de proteína CRISPR/Cas9 a gema é muito mais simples, economiza tempo e não requer treinamento extensivo em relação ao microinjecting o discoidal do embrião de uma célula, que é a técnica comum para a maioria das transferência do gene e gene edição com peixe 30 , 42. o protocolo atual provou para ser bem sucedido na indu...

Microinjeção é uma técnica comum de laboratório usada para entregar uma pequena quantidade de uma substância como DNA, RNA, proteínas e outras macromoléculas em células ou de embriões através de um capilar de vidro1. Microinjeção é executada usando a instalação de equipamentos especiais, incluindo um microinjector e um microscópio2micromanipulador. A técnica tem sido usada por pesquisadores para modificar geneticamente muitos organismos através da geração de transgênicos, gene nocautes e terapia genética, com o objectivo de compreensão da dinâmica dos componentes intracelulares3,4 , 5.
O bagre do canal (Ictalurus punctatus) é as mais populares espécies de bagres na aquicultura e actividades de pesca recreativa nos Estados Unidos. Há uma crescente necessidade de estudar a genómica funcional em bagre do canal, e o sequenciamento do genoma completo de bagre do canal aumenta a utilidade dos avanços recentes em6,de ferramentas de edição do genoma7. Compreender a função do gene teria não só enriquecer a pesquisa que está sendo realizada no peixe-gato, mas também pode levar à programas de melhoramento genético mais eficazes para melhorar a indústria de peixe-gato. Uma vez identificados os genes críticos para uma determinada característica de interesse, eles podem ser usados para melhorar geneticamente produção de bagre através do genoma de edição para gerar alelos benéficos, seleção para estes alelos, suprimindo os alelos prejudiciais, transferência os alelos benéficos através de transgênese, ou uma combinação destas opções. Combinar os melhores genes para diferentes características comercialmente vantajoso de espécies diferentes em um peixe extremamente iria melhorar a produtividade e rentabilidade da produção de peixe operações8.
Nocaute do gene é um método direto para o estudo de funções do gene em vivo. Mutações no nível do DNA serão herdadas pelas gerações futuras, que facilitarão o estudo de seus efeitos em diferentes gerações. Ferramentas de edição de genoma diferentes foram desenvolvidos incluindo zinco dedo as nucleases (ZFNs), transcrição nucleases activator como efetoras (TALENs) e agrupado regularmente intercalada curta palíndromo repetições/CRISPR-proteína associada 9 (CRISPR/Cas9 ) sistema9,10,11,12.
O sistema CRISPR/Cas9 é uma ferramenta poderosa e eficiente que tem sido usada para editar sequências genomic DNA, incluindo o nocaute do gene em peixes através de RNA guiadas site-specific DNA clivagem5,13. O sistema consiste de um RNA guia (gRNA), que determina a sequência alvo do genoma e uma enzima endonuclease de DNA, Cas9. O sistema CRISPR/Cas9 pode ser projetado para qualquer sequência no genoma com várias vantagens sobre ZFNs e TALENs-alvo: (1) baixo custo de engenharia (2) mais fácil ligação (3) mais específica do guia do RNA para a sequência do alvo e reduzida mutações fora do alvo (4) várias sequências podem ser direcionadas com gRNA diferente com a mesma taxa de mutagénese alta de tempo (5) nos genes que poderia não ser mutado por TALENs e (6) taxa de transmissão do germline melhorada de mutações para cima para 6-fold quando comparado com ZFNs e TALENs14, 15,16,17,18.
O principal método alternativo para o microinjection é electroporation, no qual os impulsos elétricos são aplicados a embriões ou células para aumentar a permeabilidade da membrana e a absorção de moléculas biológicas19,20. Vários peixes transgênicos foram gerados usando electroporation como medaka (Oryzias latipes), peixe-zebra (Danio rerio), salmão chinook (Oncorhynchus tshawytscha), bagre de canal, goraz (amiláceos sarba), e comum carpa (Cyprinus carpio)21,22,23,24,25,26.
Electroporation serviu para fornecer proteína de DNA, RNA e Cas9 plasmídeo nocaute do gene. Em células de mamíferos, Cas9/gRNA plasmídeo, Cas9 mRNA/gRNA e complexos de proteína/gRNA Cas9 foram entregues usando electroporation e as taxas de mutagênese foram mais altos usando Cas9 proteína/gRNA complexos para a maioria de condições testadas electroporation27. Os Cordados urocordado (Ciona intestinalis), TALENs expressando construções foram electroporated em ovos fertilizados para induzir o nocaute de múltiplos genes28. ZFNs expressando de shRNA construções foram electroporated para nocautear o hormônio luteinizante em bagre do canal29. No entanto, uma vez introduzido na célula, construções de plasmídeo precisará ser transcrito para o RNA e traduzido para proteínas funcionais antes que eles podem direcionar a sequência de DNA desejada, que provavelmente iria atrasar a hora de mutagénese comparado a microinjeção de RNA / proteína. Como um embrião está se desenvolvendo, mutagênese retardada aumenta o mosaicismo dos fundadores injetados. Além disso, expressão transgênica é improvável alcançar o nível de expressão possível com microinjeção, reduzindo a eficiência de mutagénese.
Como um meio para a introdução de ferramentas de edição do genoma em células, microinjeção tem várias vantagens sobre eletroporação. Edição de moléculas de genoma pode ser confiantemente introduzida em células ou de embriões através de microinjeção de30. Menos material de injeção é necessária. É fácil determinar as quantidades de material injetado. Maior mutação taxas com mosaicismo baixa no peixe fundador podem ser alcançado que melhorariam germline transmissão de mutações de F-1. Menos peixes fundador precisam ser analisado para produzir a primeira geração, devido à maior taxa de mutação. Na eletroporação, mais peixes fundador precisam ser analisado que aumentará os custos. No entanto, a sobrevivência de embriões channel catfish injetadas é inferior a electroporated os, embora isto pode ser superado pela injeção de mais embriões31,32. Em bagre do canal, sobrevivência de embriões de gema-injetadas variou entre 16 e 55%, dependendo dos genes alvo e a dosagem de proteína gRNA/Cas932.
Microinjection regular de embriões de peixe-gato é tecnicamente exigente e demorado, no entanto, um protocolo de microinjeção rápido e eficiente CRISPR/Cas9 proteína é apresentado para embriões de bagre do canal. Este protocolo requer menos tempo e experiência desde a solução de proteína CRISPR/Cas9 é injectada a gema de um embriões de célula. Centenas de ovos fertilizados podem ser injetadas em 1h (aproximadamente o tempo necessário para a primeira divisão celular ocorra). Para validar o protocolo, dois genes de suscetibilidade-relacionados de doença foram eliminados em bagre do canal, o gene molécula (TICAM1) do adaptador de domínio-contendo do pedágio/interleucina 1 receptor e o gene de lectina (RBL) de vinculação de ramnose. TICAM 1 está envolvido na via de sinalização iniciada por receptores do tipo toll (TLR) 3. Em bagre do canal, 1 TICAM foi dramaticamente upregulated seguindo o desafio bacteriano com Edwardsiella ictaluri, enquanto era ativador em bagre azul, uma espécie resistente à ictaluri E.33. RBL desempenha um papel importante na infecção precoce com Flavobacterium columnare, o agente causador da doença de columnaris, onde aguda e upregulation robusto foi gravado em uma cepa de bagre de canal columnaris-sensíveis em comparação com um estirpe resistente columnaris34.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="520">
	<tbody>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:136px;">Reproboost implant</td>
			<td style="width:115px;">Center of Marine Biotechnology</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:136px;">TRICAINE-S</td>
			<td style="width:115px;">Western Chemical. Inc.</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:136px;">Phenol red</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:99px;">P0290</td>
			<td style="width:171px;">0.5%, sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:136px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:115px;">Olympus</td>
			<td style="width:99px;">213709</td>
			<td style="width:171px;">For visualizing the eggs during microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:136px;">Microinjector</td>
			<td style="width:115px;">ASI-Applied Scientific Instrumentation&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Model MPPI-3</td>
			<td style="width:171px;">For the delivery of the injection material into the embryos</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:136px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:115px;">ASI-Applied Scientific Instrumentation&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Model MM33&#160;</td>
			<td style="width:171px;">For holding and controlling the movement of the injection needle.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:136px;">Eppendorf Microloader</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:99px;">5242956.003</td>
			<td style="width:171px;">For loading injection solution into microinjection needles.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:136px;">Vertical needle puller</td>
			<td style="width:115px;">David Kopf Instruments</td>
			<td style="width:99px;">Model 720</td>
			<td style="width:171px;">For pulling microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:136px;">Cas9 protein</td>
			<td style="width:115px;">PNA Bio Inc.&#160;</td>
			<td style="width:99px;">CP01</td>
			<td style="width:171px;">Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:136px;">Expand High FidelityPLUS PCR System</td>
			<td style="width:115px;">&#160;Roche Diagnostics, USA</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:136px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:115px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:136px;">Petri dish</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:99px;">25384-302</td>
			<td style="width:171px;">For holding the embryos during the microinjection.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:136px;">Crisco</td>
			<td style="width:115px;">The J.M. Smucker Company</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:136px;">Holtfreter`s solution</td>
			<td style="width:115px;">Home Made</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:136px;">Doxycycline hyclate USP (monohydrate)</td>
			<td style="width:115px;">Letco Medical</td>
			<td style="width:99px;">690904</td>
			<td style="width:171px;">Antibiotic added to Holtfreter&#39;s solution to 10 ppm to prevent bacterial infections.</td>
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microinjection of crispr/cas9 protein into channel catfish, ictalurus punctatus, embryos for gene editing

O genoma completo do bagre do canal, Ictalurus punctatus, foi sequenciado, levando a maiores oportunidades para estudar a função do gene de bagre do canal. Nocaute de gene tem sido usada para estudar estas funções de gene em vivo. O cluster regularmente intercaladas curta palíndromo repetições/CRISPR associado da proteína 9 (CRISPR/Cas9) sistema é uma poderosa ferramenta usada para editar sequências genomic do DNA para alterar a função do gene. Embora a abordagem tradicional tem sido introduzir os embriões de célula única através de microinjeção CRISPR/Cas9 mRNA, esse pode ser um processo lento e ineficiente em bagre. Aqui, um protocolo detalhado para microinjeção de embriões channel catfish com proteína CRISPR/Cas9 é descrito. Brevemente, óvulos e espermatozoides foram coletada e então artificial fertilização realizada. Ovos fertilizados foram transferidos para uma placa de Petri contendo solução do Holtfreter. Volume de injeção foi calibrada e então guia RNAs/Cas9 alvejando o pedágio/interleucina 1 receptor domínio-contendo adaptador molécula (TICAM 1) gene e gene de lectina (RBL) de vinculação de ramnose foram injetadas na gema de uma célula de embriões. O nocaute do gene foi bem-sucedido como puntuais foram confirmados por sequenciamento de DNA. As alterações de sequência da proteína predita devido a estas mutações incluíam frameshift e truncado proteína devido códons de parada prematura.

Para demonstrar a eficiência do protocolo microinjeção, foram injetadas gRNAs projetados para atingir o channel catfish pedágio/interleucina 1 gene do receptor domínio-contendo adaptador molécula (TICAM1) e ramnose gene de lectina (RBL) de vinculação.
TICAM 1 Sequenciamento de DNA de vetores de colónias individuais de produtos PCR em pool, clonados revelou as mutações indel induzidas em TICAM 1 gen...

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Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Um protocolo simples e eficiente de microinjeção para edição de genes em embriões de bagre de canal usando o sistema CRISPR/Cas9 é apresentado. Neste protocolo, guia de RNAs e proteínas Cas9 foram injetadas na gema de uma célula de embriões. Este protocolo foi validado por nocauteando dois genes imune-relacionados de bagre do canal.

Microinjeção de proteína CRISPR/Cas9 em bagre do canal, Ictalurus punctatus, embriões para Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

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QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the identification and verification of a drug resistance gene in the Apicomplexan parasite Toxoplasma gondii, the method of Quantitative Trait Locus (QTL) mapping using a Whole Genome Sequence (WGS) -based genetic map and the method of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 -based gene editing. The approach of QTL mapping allows one to test if there is a correlation between a genomic region(s) and a phenotype. Two datasets are required to run a QTL scan, a genetic map based on the progeny of a recombinant cross and a quantifiable phenotype assessed in each of the progeny of that cross. These datasets are then formatted to be compatible with R/qtl software that generates a QTL scan to identify significant loci correlated with the phenotype. Although this can greatly narrow the search window of possible candidates, QTLs span regions containing a number of genes from which the causal gene needs to be identified. Having WGS of the progeny was critical to identify the causal drug resistance mutation at the gene level. Once identified, the candidate mutation can be verified by genetic manipulation of drug sensitive parasites. The most facile and efficient method to genetically modify T. gondii is the CRISPR/Cas9 system. This system comprised of just 2 components both encoded on a single plasmid, a single guide RNA (gRNA) containing a 20 bp sequence complementary to the genomic target and the Cas9 endonuclease that generates a double-strand DNA break (DSB) at the target, repair of which allows for insertion or deletion of sequences around the break site. This article provides detailed protocols to use CRISPR/Cas9 based genome editing tools to verify the gene responsible for sinefungin resistance and to construct transgenic parasites.

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Details are presented on how QTL mapping with a whole genome sequence based genetic map can be used to identify a drug resistance gene in Toxoplasma gondii and how this can be verified with the CRISPR/Cas9 system that efficiently edits a genomic target, in this case the drug resistance gene.

Mapeamento QTL e edição CRISPR / Cas9 para identificar um gene de resistência a medicamentos em<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Genética

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide RNA (sgRNA) that confers specificity, the Cas9 protein cleaves both DNA strands at the targeted locus. The DNA break can trigger either non-homologous end joining (NHEJ) or homology directed repair (HDR). NHEJ can introduce small deletions or insertions which lead to frame-shift mutations, while HDR allows for larger and more precise perturbations. Here, we present protocols for generating knockout cell lines by coupling established CRISPR/Cas9 methods with two options for downstream selection/screening. The NHEJ approach uses a single sgRNA cut site and selection-independent screening, where protein production is assessed by dot immunoblot in a high-throughput manner. The HDR approach uses two sgRNA cut sites that span the gene of interest. Together with a provided HDR template, this method can achieve deletion of tens of kb, aided by the inserted selectable resistance marker. The appropriate applications and advantages of each method are discussed.

Recent advances in the ability to genetically manipulate somatic cell lines hold great potential for basic and applied research. Here, we present two approaches for CRISPR/Cas9 generated knockout production and screening in mammalian cell lines, with and without the use of selectable markers.

Geração independente dependente da seleção e de genes independentes de CRISPR / Cas9 em células de mamíferos

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Uma metodologia padrão para examinar a mutagenicidade no local como uma função de ponto de mutação reparação catalisada por CRISPR/Cas9 e SsODN em células humanas

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical regions, is caused by infection with Plasmodium parasites. The development of more effective drugs to combat malaria can be accelerated by improving our understanding of the biology of this complex parasite. Genetic manipulation of these parasites is key to understanding their biology; however, historically the genome of P. falciparum has been difficult to manipulate. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been utilized in malaria parasites, allowing for easier protein tagging, generation of conditional protein knockdowns, and deletion of genes. CRISPR/Cas9 genome editing has proven to be a powerful tool for advancing the field of malaria research. Here, we describe a CRISPR/Cas9 method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in P. falciparum. This method is highly adaptable to other types of genetic manipulations, including protein tagging and gene knockouts.

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

We describe a method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in Plasmodium falciparum using CRISPR/Cas9 genome editing.

CRISPR/Cas9 Gene edição para fazer condicional mutantes de humano parasita da malária por p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

Proteína endógena de marcação em humanos induzida por células-tronco pluripotentes usando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of CRISPR/Cas9 elements into the target cells by transfection is a prerequisite for efficient gene editing. This protocol demonstrates that tube electroporation (TE) machine-mediated delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP), along with single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor templates to different types of mammalian cells, leads to robust precise gene editing events. First, TE was applied to deliver CRISPR/Cas9 RNP and ssODNs to induce disease-causing mutations in the interleukin 2 receptor subunit gamma (IL2RG) gene and sepiapterin reductase (SPR) gene in rabbit fibroblast cells. Precise mutation rates of 3.57%-20% were achieved as determined by bacterial TA cloning sequencing. The same strategy was then used in human iPSCs on several clinically relevant genes including epidermal growth factor receptor (EGFR), myosin binding protein C, cardiac (Mybpc3), and hemoglobin subunit beta (HBB). Consistently, highly precise mutation rates were achieved (11.65%-37.92%) as determined by deep sequencing (DeepSeq). The present work demonstrates that tube electroporation of CRISPR/Cas9 RNP represents an efficient transfection protocol for gene editing in mammalian cells.

Presented here is a protocol for efficient CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated gene editing in mammalian cells using tube electroporation.

CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteína-mediada por Gene preciso de edição por tubo Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target against T. cruzi, it is important to validate the essentiality of the target gene in the mammalian stage of the parasite, the amastigote. Amastigotes of T. cruzi replicate inside the host cell; thus, it is difficult to conduct a knockout experiment without going through other developmental stages. Recently, our group reported a growth condition in which the amastigote can replicate axenically for up to 10 days without losing its amastigote-like properties. By using this temporal axenic amastigote culture, we successfully introduced gRNAs directly into the Cas9-expressing amastigote to cause gene knockouts and analyzed their phenotypes exclusively in the amastigote stage. In this report, we describe a detailed protocol to produce in vitro derived extracellular amastigotes, and to utilize the axenic culture in a CRISPR/Cas9-mediated knockout experiment. The growth phenotype of knockout amastigotes can be evaluated either by cell counts of the axenic culture, or by replication of intracellular amastigote after host cell invasion. This method bypasses the parasite stage differentiation normally involved in producing a transgenic or a knockout amastigote. Utilization of the temporal axenic amastigote culture has the potential to expand the experimental freedom of stage-specific studies in T. cruzi.

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Here, we describe a protocol to introduce a gene knockout into the extracellular amastigote of Trypanosoma cruzi, using the CRISPR/Cas9 system. The growth phenotype can be followed up either by cell counting of axenic amastigote culture or by proliferation of intracellular amastigotes after host cell invasion.

Introduzindo um nocaute genético diretamente no estágio Amastigote do Trypanosoma cruzi usando o sistema crispr/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

Edição de genoma mediado por CRISPR-Cas9 no Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to visceral pathology. Deciphering the nature of the vector/parasite interactions is of primary importance for better understanding of Leishmania transmission to their hosts. Among the parameters controlling the sand fly vector competence (i.e. their ability to carry and transmit pathogens), parameters intrinsic to these insects were shown to play a key role. Insect immune response, for example, impacts sand fly vector competence to Leishmania. The study of such parameters has been limited by the lack of methods of gene expression modification adapted for use in these non-model organisms. Gene downregulation by small interfering RNA (siRNA) is possible, but in addition to being technically challenging, the silencing leads to only a partial loss of function, which cannot be transmitted from generation to generation. Targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 technology was recently adapted to the Phlebotomus papatasi sand fly. This technique leads to the generation of transmissible mutations in a specifically chosen locus, allowing to study the genes of interest. The CRISPR/Cas9 system relies on the induction of targeted double-strand DNA breaks, later repaired by either Non-Homologous End Joining (NHEJ) or by Homology Driven Repair (HDR). NHEJ consists of a simple closure of the break and frequently leads to small insertion/deletion events. In contrast, HDR uses the presence of a donor DNA molecule sharing homology with the target DNA as a template for repair. Here, we present a sand fly embryo microinjection method for targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 using NHEJ, which is the only genome modification technique adapted to sand fly vectors to date.

Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

This protocol details the steps of CRISPR/Cas9 targeted mutagenesis in sand flies: embryo collection, injection, insect rearing, and identification as well as selection of mutations of interest.

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microinjeção de Embrião para Mutagenesis CRISPR/Cas9

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...