Agradecemos ao Dr. Yih-Fan Chen ajuda com as pinças ópticas axiais e contribuir alguns de seus dados de alongamento para este manuscrito. Este trabalho foi patrocinado pela NSF concessão PHY-0957293 e concessão FOCUS PHY-0114336.

1. Pinças Setup <ol><li> O feixe de um laser 1064 nm é dividida em dois feixes polarizados ortogonalmente. Um é utilizado para manipular a biomolécula, enquanto o outro é usado para fins de calibração (ver a Fig. 2.). </li><li> A intensidade do feixe de manipulação é controlada por um deflector acústico-óptico (AOD), enquanto que a posição de focagem e de cada feixe é controlada de forma independente por espelhos de feixe de direcção e telescópios ópticos, respectivamente. </li><li> Os feixes são então recombinadas com um outro divisor de feixe polarizador e mais condicionada por um conjunto final de óptica de telescopagem para ligeiramente sobrecarregue a abertura traseira da objectiva do microscópio. Um transbordo de 50% para o feixe de calibração leva a uma armadilha apertado óptico, enquanto que um factor ligeiramente menor para o feixe de manipulação, cerca de 20%, dá uma menor atenção que se traduz numa maior região funcional do potencial linear. As vigas são bem focada por um 60x/1.4 obj óleo microscópio PlanApo imersãotiva para a célula de amostra. </li><li> Esta configuração de pinça é combinada com um microscópio de campo brilhante casa construída que proporciona uma iluminação de uma lâmpada de halogéneo focalizada sobre a câmara de amostra por um condensador. A imagem de campo claro é separada da luz de laser por um espelho dicróico e depois trabalhada em duas câmaras CCD. Um age CCD como nosso principal meio de aquisição de dados e software é accionado, para se obter as taxas de amostragem de precisão, enquanto que a outra CCD é usada para a imagem de uma microesfera de referência única presa cuja posição serve como um sistema de realimentação de controlo, para compensar o desvio no microscópio. </li><li> A amostra é grosseiramente posicionada em relação ao objectivo, um estágio XY, e pode, então, ser posicionado com precisão por um incorporado tridimensional piezo-fase. </li><li> A luz do laser para a frente-disperso e transmitido é recolhido pelo condensador de campo claro e focado em um fotodetector. O sinal resultante é filtrada através de um filtro anti-aliasing a 100 kHz, e amplificada umacquired a 200 kHz, utilizando uma placa de aquisição de dados. </li></ol> 2. Calibrar tamanho aparente do Talão a posição axial <ol><li> Carregar uma câmara de amostra 9 com uma solução dispersa de 800 nm de diâmetro de poliestireno microesferas diluído em solução salina tamponada com fosfato. Deixe descansar por 10-15 minutos e depois lave levemente com tampão para remover o excesso de microesferas. </li><li> Localizar uma microesfera aleatoriamente preso à lamela e ajustar a altura da câmara de amostra até a microesfera é de cerca de 1 um a seguir a focagem para gerar uma imagem desfocada. </li><li> Para medir o tamanho aparente da imagem, em primeiro lugar encontra o centro da microesfera utilizando o padrão geométrico correspondente em função LabView. </li><li> Em seguida, gerar um perfil de intensidade radial da microesfera pela média de 360 ​​° em torno do centro de cada secção transversal. O perfil radial, o que corresponde a um anel branco em cada uma das imagens de campo claro, pode ser equipado com uma função quadrática para encontrarum pico de brilho. A distância entre o pico e o centro pode ser usado como uma medida do tamanho aparente do grânulo. </li><li> Usando o piezostage calibrado, aumentar gradualmente a posição axial da microesfera e adquirir uma imagem em cada posição axial com a câmara CCD. </li><li> Repita a análise de imagem para cada imagem sucessiva de correlacionar o tamanho aparente da microesfera com a sua localização axial (ver fig. 3). A resolução axial obtida por método é de cerca de 1,4 nm 7. </li></ol> 3. Mapeamento do Potencial óptica do Boca Manipulação <ol><li> Comece colinearmente alinhar o feixe de manipulação e o feixe de calibração. O feixe de calibração deve ser cerca de 50 mW na abertura traseira do objectivo que o feixe de manipulação devem ser muito mais fracas, digamos, 10 mW. </li><li> Com o feixe de manipulação desligado, confinar uma microesfera livre dentro da armadilha muito mais dura do feixe de calibração. </li><li> Agora, ligue o manifeixe pulação. Uma vez que o feixe de manipulação é muito mais fraco do que o feixe de calibração, a posição axial da microesfera seja ligeiramente perturbado. A alteração resultante na posição axial pode ser medida a partir das imagens de campo claro defocused como já descrito. </li><li> Desligue o feixe de manipulação e com a microesfera ainda preso no feixe de calibração, mudar o foco axial do feixe de calibração, ajustando a lente telescópica. Ligue o feixe de manipulação, medir o deslocamento subsequente da microesfera e de repetição. </li><li> A AX deslocamentos pode ser registada em função da posição axial do foco do feixe de calibração. A posição axial correspondente ao maior deslocamento da microesfera determina o centro da região linear da armadilha óptica (ver fig. 4). </li><li> O passo final para a obtenção da força óptico do feixe de manipulação como uma função da posição axial requer uma medição cuidadosa da rigidez dofeixe de calibração. Para se obter isso, mover o microesfera, preso pelo feixe de calibração, para cerca de um micrómetro acima da superfície através do ajuste da lente telescópica, enquanto o feixe de manipulação é desligado. </li><li> Gravar o movimento térmico axial da microesfera, medindo a intensidade da luz transmitida com um fotodetector. </li><li> A autocorrelação do sinal pode ser ligado a uma função de decaimento exponencial simples para dar a constante de tempo das flutuações,. Τ z </li><li> O coeficiente de atrito hidrodinâmico ζ, da microesfera pode ser corrigido para a proximidade a um microesferas 5,10 superficiais. A rigidez da armadilha de calibração é então dada por κ z = ζ / τ z (ver Materiais Suplementares A e B). </li><li> Conhecendo a rigidez da armadilha de calibração permite converter os deslocamentos axiais previamente medidos em uma força ƒ z = z κ Integração AX de this gera uma curva de mapeamento espacial do potencial axial óptico do feixe de manipulação (ver fig. 4). </li></ol> 4. Esticar uma amostra de DNA <ol><li> Montar a câmara 9 de superfície que contêm as moléculas de ADN ancoradas (&lt;1 kbp) e, enquanto observa a imagem de campo claro, posicionar o foco do feixe de manipulação ligeiramente acima das microesferas não estirada através do ajuste do telescópio. Em seguida, ajustar a posição da fase até que uma das microesferas é aprisionado. </li><li> Cerca de posicionar a microesfera no centro do plano XY da armadilha óptica. Gerar uma série de ondas quadradas em LabView e enviá-los para a AOD para repetidamente transformar o feixe de laser ligado e desligado. Cuidadosamente controlar a intensidade do laser e da duração do estado de ligado para evitar o aquecimento da câmara de amostragem. Normalmente, uso em torno de 2 MW de potência do laser (medido na abertura de trás do objetivo) e enviar pulsos de 200 ms (on) e MS 500 (off). A amplitude do quadrado wav enviado para o AOD deve ser cerca de 0,5 V. </li><li> Assista ao microesfera como a armadilha é repetidamente ligado e desligado e observe se o laser induz qualquer direção preferencial ao movimento da microesfera de. Embora de forma iterativa o ajuste da posição de microsferas tanto na direcção X e Y, por meio do controle do piezostage, o movimento aleatório das microesferas devem tornar-se isotrópica, no plano XY, embora notavelmente restringida quando o laser é ligado. </li><li> Em seguida, alinhar o talão na direcção Z. Novamente pulsar o feixe de laser ligado e desligado enquanto, desta vez, para medir simultaneamente a microesferas de deslocamento axial em tempo real. Centro de fase dentro da região linear, que é o ponto em que o deslocamento Z é maior. </li><li> Depois de um alinhamento cuidadoso na direcção Z, que é imperativo para verificar que a armadilha está ainda centrado no plano XY. Se o alinhamento XY mudou, tanto o XY e Z alinhamento deve ser repetido até que a microesfera é centrada adequadamente ao longo de todos os trêseixos. </li><li> Para o alongamento do ADN, rampa a intensidade do laser através do envio de um sinal de tensão para o AOD, a partir de 0 V para 0,5 V em incrementos de 0,025 V. Em cada passo, o registro 400 quadros a 100 fps e média-los para obter o deslocamento axial. </li><li> As curvas de força de extensão pode agora ser traçados e ajustados a um modelo modificado WLC 11 (ver Materiais Suplementares B). </li></ol> 5. Resultados representativos: Apresentamos as curvas de força de extensão para duas sequências de ADN: um pb 1298 e uma sequência de 247 pb, sendo este último o mais curto de sequência, temos sido capazes de esticar de forma reprodutível. Para trechos curtos de DNA, a Cadeia Worm-Like convencional (WLC) modelo não explica totalmente a relação de extensão força, porque em ambas as escalas de comprimento deve levar em conta um tamanho finito efeitos e extensão vigor a zero resultante de restrições de limite. As medições de extensão de força, portanto, tem que estar em forma usando um modelo modificado WLC que tem uma efetividadeve tamanho de persistência e uma extensão de força zero como parâmetros de ajuste, descritas ainda mais nos materiais complementares. Para comprimentos de contorno grandes de dsDNA, o comprimento efectivo de persistência é simplesmente o comprimento nominal de persistência (~ 50 nm) e a extensão de força zero pode ser negligenciada. No entanto, como o comprimento do contorno é mais curto o comprimento eficaz persistência diminui bem abaixo de 50 nm e o DNA, mesmo sob a força de zero, mostra um aumento significativo. Os dados e os ajustes correspondentes das curvas de força de extensão são mostrados na Fig. 5 para as duas sequências. A partir do WLC modificado encaixa, determinamos os comprimentos eficazes de persistência para ser de 35 nm para a 1298 pb de ADN e 25 nm de 247 pb de DNA. Para fins ilustrativos, estamos apresentando medidas individuais das curvas de força de extensão para cada seqüência. Na prática, pode-se repetir as medições várias vezes e obter os resultados médios, juntamente com os desvios-padrão. Deve também ser notado that após a obtenção de cada curva é imperativo para assegurar que a microesfera fica presa e adequadamente posicionada dentro da região linear, caso contrário, a microsfera tem de ser realinhada, como anteriormente descrito no protocolo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig1.jpg" /> Princípio figura 1 do axial pinças ópticas. (Esquerda) Convencional armadilha pinças ópticas perto do foco. O talão é então deslocado lateralmente à lamela de exercer tensão. (Direita) Em axiais pinças ópticas, uma microesfera está presa para longe do foco, na região linear do potencial óptico. Nesta configuração, o polímero é mantido sob tensão constante para uma série de extensões. Além disso, aumentando a intensidade do laser se move da microesfera na direcção axial. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig2.jpg" /> Figura Representação esquemática 2 deAxiais pinças ópticas do laser de luz (1064nm Nd: YVO 4). Está dividida em dois feixes por passagem através de um divisor de feixe polarizador (PBS). O feixe de manipulação, passa através de um deflector acústico-óptico (AOD) e o feixe de calibração pode ser ajustado independentemente usando lentes telescópicas. Os dois feixes são então recombinados usando outro PBS e centrada sobre a amostra por um objectivo NA elevada. Simultaneamente, a iluminação de campo claro usado para controlar a microesfera, passa através da amostra, é de infravermelhos (IR) e filtrado é, então, visualizado por duas câmaras CCD, uma das quais toma as medições, enquanto o outro atua como parte de um sistema de controlo de realimentação. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig3.jpg" /> Figura 3 Calibração posição axial. Para calibrar a posição axial, adquirimos imagens desfocadas de um cordão preso ao lamela câmara em diferentes posições axiais do palco. O tamanho do microsfera é determinado pela distância entre o seu centro e a posição do pico de intensidade sobre o anel brilhante formado em torno da imagem da microesfera. A inserção mostra a distribuição de intensidade radial que proporciona o tamanho do grânulo. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig4.jpg" /> Figura 4 Mapeamento do princípio atrás Potential óptico. Para mapear a força óptico do feixe de manipulação, o deslocamento axial que induz numa microesfera presa dentro de um feixe de calibração muito mais forte é medido. O centro da região linear que este deslocamento é uma máxima está situado. A Força óptica em função da curva de posição axial pode ser integrado para encontrar o potencial óptico. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig5.jpg" /> Figura 5 Curva de Extensão Force. Dados é mostrado por alguns aleatórios 1298 pb e 247 pb (detalhe) Segment de dsDNA esticado por axiais pinças ópticas. Os pontos de dados foram ajustados para o WLC modificado modelo de equação. 3 (linhas a cheio) e rendeu comprimentos de persistência eficazes de 34 nm e 25 nm, respectivamente, para o 1298bp e ​​247bp.

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	<li>Halford, S. E., Welsh, A. J., Szczelkun, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-mediated+DNA+looping.">Enzyme-mediated DNA looping.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 1-24 (2004).</li><li>Allemand, J. F., Cocco, S., Douarche, N., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loops+in+DNA:+an+overview+of+experimental+and+theoretical+approaches.">Loops in DNA: an overview of experimental and theoretical approaches.</a> Eur. Phys. J. E. Soft. 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N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtonewton+entropic+forces+can+control+the+formation+of+protein-mediated+DNA+loops.">Femtonewton entropic forces can control the formation of protein-mediated DNA loops.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 048301-048301 (2010).</li><li>Raghunathan, K., Milstein, J. N., Juliar, B., Blaty, J., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+Dependent+Effects+on+the+Elasticity+of+Short+DNA+Molecules.">Sequence Dependent Effects on the Elasticity of Short DNA Molecules.</a> , (2011).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Pinças ópticas convencionais dependem tanto de feedback analógico ou controlado por computador para aplicar uma força constante sobre um objecto refrangente. Estes sistemas de retroalimentação activas têm dificuldade em realizar, em condições em que as alterações súbitas na extensão do espécime ocorrem, por exemplo, a partir da ligação de uma proteína ao ADN ou a intensificação rápida de um motor molecular ao longo de um filamento. Vários métodos para a aplicação de forças passivas constantes fo...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente / Equipamento </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Laser Nd: YVO4 </td><td> Spectra Physics </td><td> T40-Z-106C </td><td></td></tr><tr><td> Óptico-acústico defletor </td><td> IntraAction </td><td> DTD-274HA6 </td><td></td></tr><tr><td> Objetivo microscópio </td><td> Olimpo </td><td> PlanApo </td><td> 60X, NA 1,4 </td></tr><tr><td> Fase Piezo </td><td> Mad City Labs </td><td> Nano-LP100 </td><td> Estágio XYZ </td></tr><tr><td> Câmera CCD </td><td> PixeLink </td><td> PL-A741 </td><td></td></tr><tr><td> Fotodetector </td><td> Electro-Optics Tecnologia </td><td> ET-3020 </td><td></td></tr><tr><td> Esferas de poliestireno </td><td> Spherotech </td><td> SVP-08-10 </td><td> 800nm, estreptavidina revestido </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenina </td><td> Roche </td&gt; <td> 11333089001 </td><td> De ovelhas </td></tr><tr><td> Iniciadores </td><td> MWG operon </td><td> Oligos personalizados </td><td> Um primer: biotina Outros: digoxigenina </td></tr><tr><td> PCR reagentes </td><td> Nova Inglaterra Biolabs </td><td> Taq polimerase, dNTPs </td><td></td></tr><tr><td> Lamela </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Outros produtos químicos para amortecer </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Materiais suplementares A. Coeficiente de Fricção hidrodinâmica Para determinar o coeficiente de atrito hidrodinâmico da microesfera perto de uma superfície pode-se utilizar os 5,10 expansão seguintes: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq1.jpg" alt="Equação 1" /> onde o h abreviada a seguircomo foram introduzidos: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq2.jpg" alt="Equação 2" /> O coeficiente de atrito é definido em termos de fluido de viscosidade η e o raio da microesfera, com o centro da microesfera, localizada a uma distância acima da superfície η. A soma converge razoavelmente bem quando expandido para cerca de 10 termos. B. Influência da posição axial em Calibração Rigidez A calibração da rigidez armadilha envolve uma troca entre a precisão da calibração, que aumenta com o aumento da distância a partir da superfície, e a posição real axial onde a armadilha é usada experimentalmente. Em geral, a armadilha é calibrado em cerca de 800-1000 nm a partir da superfície, que é maior do que a verdadeira condição experimental. C. Modificado Worm-Like Cadeia Modelo (WLC) As curvas de extensão da força pode ser ajustado a um WLC modificada modelo que as contas para efeitos de volume de exclusão em vigor óptico zero, como segue: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq3.jpg" alt="Equação 3" /> em que F é a força opt óptico, o x é um parâmetro de ajuste para a extensão de força zero, x é a extensão opt em vigor, l é o comprimento do contorno do DNA, e l * p é um parâmetro de ajuste para uma segunda eficaz &quot; &quot;comprimento de persistência. wlc F é dada pelo modelo habitual WLC 11 <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq4.jpg" alt="Equação 4" /> onde ε é a extensão de DNA relativo.

stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers

Molécula única de técnicas de alongamento de ADN de comprimentos de contorno inferior a uma kilobase estão repletas de dificuldades experimentais. No entanto, muitos interessantes eventos biológicos tais como a ligação histona e proteínas mediada por looping de ADN a 1,2, ocorrem nesta escala de comprimento. Nos últimos anos, as propriedades mecânicas do ADN têm sido mostrados para desempenhar um papel importante em processos celulares fundamentais como a embalagem do ADN em nucleossomas compactos e fibras de cromatina 3,4. Claramente, é então importante compreender as propriedades mecânicas dos trechos curtos de DNA. Neste artigo, apresentamos um guia prático para uma técnica de uma única molécula de óptica tweezing que temos desenvolvido para estudar o comportamento mecânico de DNA com comprimentos de contorno tão curtos quanto a algumas centenas de pares de bases. O grande obstáculo no alongamento pequenos segmentos de DNA é que convencionais pinças ópticas são geralmente projetados para aplicar a força em um direction lateral ao estágio 5,6, (ver fig. 1). Nesta geometria, o ângulo entre o rebordo e as lamelas, para o qual o DNA é presa, torna-se muito íngremes para submicron DNA comprimento. A posição axial deve agora ser considerado, que pode ser um desafio, e, uma vez que a extensão da microesfera arrasta mais perto da lamela, efeitos estéricos são melhoradas. Além disso, como resultado da assimetria das microesferas, as extensões laterais irá gerar vários níveis de binário devido à rotação da microesfera no interior da armadilha óptica uma vez que a direcção das variações de força reactiva durante a extensão. Métodos alternativos para DNA submicron alongamento correr até contra seus próprios obstáculos únicos. Por exemplo, uma armadilha de duplo feixe óptico é limitada ao estiramento DNA de cerca de um comprimento de onda, em que os efeitos de interferência entre os pontos de duas armadilhas e de dispersão da luz entre as microsferas começam a ser um problema significativo. Substituindo uma das armadilhascom uma micropipeta provavelmente sofrem de desafios semelhantes. Embora se possa utilizar directamente o potencial axial para alongar o DNA, um esquema de feedback ativo que seria necessário para aplicar uma força constante e a largura de banda que será bastante limitado, especialmente em baixas forças. Nós contornar esses problemas fundamentais diretamente puxando o DNA de distância da lamínula usando uma força constante axial pinças ópticas 7,8. Isto é conseguido prendendo o grânulo em uma região linear do potencial óptico, em que a força óptica é constante, a força que pode ser ajustada através do ajuste da potência do laser. Prendendo dentro da região linear também serve como um todo óptico força de fixação sobre o ADN que se estende por cerca de 350 nm no sentido axial. Nós simultaneamente compensar o desvio térmico e mecânico com a ajustar com precisão a posição da fase de modo a que uma microesfera referência preso à lamela permanece na mesma posição e foco, umllowing para um período de observação de praticamente ilimitadas.

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Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Ilustramos o uso de uma constante de força axial pinças ópticas para explorar as propriedades mecânicas das moléculas de ADN curtas. Esticando DNA axialmente, minimizamos impedimento estérico e artefatos provenientes de manipulação laterais convencional, o que nos permite estudar moléculas de DNA tão curto quanto ~ 100 nm.

Alongamento curtas seqüências de DNA com Pinça força constante óptico axial

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K visualizações.  University of Michigan. Ilustramos o uso de uma constante de força axial pinças ópticas para explorar as propriedades mecânicas das moléculas de ADN curtas. Esticando DNA axialmente, minimizamos impedimento estérico e artefatos provenientes de manipulação laterais convencional, o que nos permite estudar moléculas de DNA tão curto quanto ~ 100 nm.

Vídeo: Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

Visualização do DNA recombinante e Complexos de Proteínas Usando Microscopia de Força Atômica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Bioengenharia

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Multiplexados molécula única Força Medidas proteólise, usando uma pinça magnética

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Quantificar as propriedades mecânicas do Glicocálix endotelial com Microscopia de Força Atômica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

Biossensor para detecção de bactérias Staphylococcus resistente a antibióticos

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Investigando Sistemas receptor-ligante do Celulossoma com base-AFM única molécula Força Espectroscopia

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Microscopia ótica quantitativa: Measurement of Cellular Biofísica Características com um microscópio óptico padrão

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch cells plated on a PolyDiMethylSiloxane (PDMS) membrane, compatible with imaging. This technique is reproducible and versatile. The PDMS membrane can be micropatterned in order to confine cells or tissues to a specific geometry. The first step is to print micropatterns onto the PDMS membrane with a deep UV technique. The PDMS membrane is then mounted on a mechanical stretcher. A chamber is bound on top of the membrane with biocompatible grease to allow gliding during the stretch. The cells are seeded and allowed to spread for several hours on the micropatterns. The sample can be stretched and unstretched multiple times with the use of a micrometric screw. It takes less than a minute to apply the stretch to its full extent (around 30%). The technique presented here does not include a motorized device, which is necessary for applying repeated stretch cycles quickly and/or computer controlled stretching, but this can be implemented. Stretching of cells or tissue can be of interest for questions related to cell forces, cell response to mechanical stress or tissue morphogenesis. This video presentation will show how to avoid typical problems that might arise when doing this type of seemingly simple experiment.

This manuscript presents a technique to apply or release forces on adherent cells or tissues using unidirectional stretching.

Alongamento Células micropatterned num PDMS Membrana

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

Pinças magnéticas para a Medição do Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

NANOmanipulação de Solteiro RNA Moléculas por pinça óptica

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression of a wide range of diseases including breast, ovarian, kidney, and pancreatic cancers. Freely available fiber quantification software tools are mainly focused on the calculation of fiber alignment or orientation, and they are subject to limitations such as the requirement of manual steps, inaccuracy in detection of the fiber edge in noisy background, or lack of localized feature characterization. The collagen fiber quantitation tool described in this protocol is characterized by using an optimal multiscale image representation enabled by curvelet transform (CT). This algorithmic approach allows for the removal of noise from fibrillar collagen images and the enhancement of fiber edges to provide location and orientation information directly from a fiber, rather than using the indirect pixel-wise or window-wise information obtained from other tools. This CT-based framework contains two separate, but linked, packages named &#8220;CT-FIRE&#8221; and &#8220;CurveAlign&#8221; that can quantify fiber organization on a global, region of interest (ROI), or individual fiber basis. This quantification framework has been developed for more than ten years and has now evolved into a comprehensive and user-driven collagen quantification platform. Using this platform, one can measure up to about thirty fiber features including individual fiber properties such as length, angle, width, and straightness, as well as bulk measurements such as density and alignment. Additionally, the user can measure fiber angle relative to manually or automatically segmented boundaries. This platform also provides several additional modules including ones for ROI analysis, automatic boundary creation, and post-processing. Using this platform does not require prior experience of programming or image processing, and it can handle large datasets including hundreds or thousands of images, enabling efficient quantification of collagen fiber organization for biological or biomedical applications.

Here, we present a protocol to use a curvelet transform-based, open-source MATLAB software tool for quantifying fibrillar collagen organization in the extracellular matrix of both normal and diseased tissues. This tool can be applied to images with collagen fibers or other types of line-like structures.

Quantificando a organização do colágeno fibrilar com ferramentas baseadas em curvas

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression ...