Nossa combinação de microdissecção a laser e espectrometria de massa permite a investigação de alterações espacialmente resolvidas no nível proteômico em qualquer tipo de tecido. No nosso caso, grânulos de neuromelanina. Nosso protocolo permite a análise proteômica com base em material de amostra limitado.
O que geralmente é um grande desafio ao trabalhar com tecido cerebral post-mortem. Uma vez que as células individuais podem ser isoladas para comparar condições saudáveis e de doença no nível proteômico. Isso pode melhorar nossa compreensão dos mecanismos da doença.
Para começar, coloque a lâmina da membrana do tecido no suporte da lâmina no palco robo com o tecido voltado para cima. Para adquirir uma varredura de visão geral da seção de tecido. Use a função de digitalização, selecione a área de interesse no canto superior esquerdo e inferior direito.
Em seguida, selecione verificar todos os ROIs para executar a verificação. Para a seleção automática de grânulos de neuromelanina no campo de visão atual. Selecione a análise do campo de visão.
Em seguida, selecione inverter o resultado e defina o limite para os canais RGB. Para que apenas os grânulos de neuromelanina sejam destacados em vermelho na janela de visualização. Agora clique em OK, para usar as configurações ajustadas para o campo de visão.
Ajuste as configurações do laser usando uma área da lâmina coberta apenas pela membrana. Encha a tampa do tubo de coleta de amostras com 50 microlitros de água ultrapura. E insira a tampa no coletor do robô motor.
Usando a interface do software, posicione o robô mover acima do estágio dois do robô para iniciar a coleta de amostras. Inicie o laser. Controle as configurações de energia e foco durante o processo a laser e ajuste as configurações, se necessário.
Garantir o isolamento adequado e a catapulta dos objetos isolados para a tampa do tubo de coleta de amostras para pelo menos os primeiros 10 objetos. Quando a amostragem estiver concluída, navegue pelo robô até sua posição inicial e remova o tubo de coleta de amostras. Após fiação das amostras por centrificação.
Secar as amostras durante 1,5 horas num concentrador de vácuo. Depois de realizar a digestão tríptica como descrito no texto. Preparar a amostra para análise por HPLC-MS dissolvendo 200 a 400 nanogramas de péptidos de amostra num volume definido de 0,1%TFA.
Em entradas de frascos de vidro espectrométrico de massa inerte. Se a determinação da concentração não for aplicável devido a uma baixa quantidade de amostra. Verifique o carregamento idêntico da amostra comparando a corrente total de íons.
Para iniciar a análise proteômica de dados brutos. Clique em carregar para carregar os arquivos brutos no software. Clique em definir experimento para atribuir os nomes de amostra.
Para definir parâmetros específicos do grupo. Adicione as modificações escolhendo NQ de desamidação, oxidação M e carbamidometilação N-termo como modificações variáveis. e, em seguida, adicione a carbamidometilação C como modificação fixa.
Escolha tripsina como uma enzima de digestão na guia de digestão. Na guia de quantificação livre de rótulos, adicione a opção LFQ e, se mais de 10 arquivos forem processados, escolha a opção LFQ rápida para reduzir o tempo de processamento. Garantir que todos os outros parâmetros específicos do grupo permaneçam nas configurações de fábrica.
Prossiga para a guia parâmetros globais e adicione o arquivo FASTA derivado do uniprot. org na guia sequências. Modifique a regra de identificador de acordo.
E adicione a taxonomia ID 9606 para o Homo sapiens. Para quantificação de proteínas, escolha peptídeos únicos e navalhadores. Em seguida, adicione a opção iBAQ como medida para quantificação de proteínas na guia de quantificação livre de rótulos.
Certifique-se de que todos os outros parâmetros globais permaneçam nas configurações de fábrica e clique em Iniciar. Após a análise ter sido realizada com sucesso, recupere os grupos de proteínas. txt de saída.
Carregue os grupos de proteínas. txt no software de análise. Adicione os valores do iBAQ como colunas principais e classifique todas as outras colunas de acordo com seu tipo.
Filtre iscas e contaminantes filtrando linhas com base na coluna categórica e filtre os resultados com base em valores válidos. Exporte a saída no formato txt para processamento adicional. E avaliar os resultados em relação à questão de pesquisa.
No presente estudo, 1.898 grupos proteicos foram identificados em NMGs e 1.565 foram identificados em tecido SN circundante, dos quais 1.384 foram identificados em ambas as áreas teciduais. Assim, 514 e 181 grupos proteicos foram identificados exclusivamente em NMGs e tecido SN, respectivamente. Nas medições representativas do DDA.
Valores ligeiramente mais elevados de iBAQ em NMGs em comparação com SN indicaram uma maior abundância da proteína citoplasmática dynien-1, cadeia pesada 1 em NMGs. Esta observação pôde ser verificada em experimentos de PRM para o peptídeo ESPEVLLTLDILK. Em que foi detectada uma maior abundância em NMGs.
Com base na área de pico nos níveis MS1 e MS2. O passo mais importante é, de longe, o isolamento dos NMGs, pois o restante do protocolo é baseado nessa etapa para ser executada corretamente. Após o procedimento de LMD, as amostras podem ser utilizadas e processadas para qualquer tipo de técnica ômica, como genômica, transcriptômica, proteômica ou lipidômica.
