Agradecemos Melissa Klocke de assistência preparando Figura 1 e Anna Ratliff para demonstrar o protocolo. Este trabalho foi financiado pela Corporação de Pesquisa para o Avanço da Ciência.

1. Microtúbulos deslizamento Ensaio Soluções de Stock Preparar antes do ensaio de deslizamento. <ol><li> Polimerizar 0,5 mg escassamente microtúbulos marcados com fluoróforo brilhante orgânico 22. A concentração etiqueta-alvo é um fluoróforo por micrómetro de microtúbulo, ou a densidade de etiquetagem de cerca de 1 por 1500 fluoróforo dímeros de tubulina. Armazenar à luz à temperatura ambiente, protegida com uma folha de alumínio, até duas semanas. </li><li> Purifica-biotina-cinesina 21 a cerca de 1 uM. Armazenar a -80 ° C em alíquotas de 5 ul para utilização em experiências individuais. </li><li> Preparar o tampão de ensaio (AB), de 50 imidiazole mM, 50 mM de cloreto de potássio (KCl), 4 mM de cloreto de magnésio (MgCl2), 2 mM de etileno glicol tetracético (EGTA), pH 6,7. Filtro estéril e armazenar a 4 ° C. </li><li> Dissolver biotinilado albumina de soro bovino (BSA-biotina) a 2 mg / ml em AB. Filtre com filtro de seringa de 0,2 | im.Armazenar a -80 ° C em alíquotas de 100 ul por longos períodos, a 4 ° C, durante até um mês. </li><li> Dissolver estreptavidina (SA) a 10 mg / ml em AB. Filtre com filtro de seringa de 0,2 | im. Armazenar a -80 ° C em alíquotas de 20 ul por longos períodos, a 4 ° C durante um período máximo de duas semanas. </li><li> Dissolver α-caseína a 5 mg / ml em AB. Filtre com filtro de seringa de 0,2 | im. Armazenar a -80 ° C em alíquotas de 100 ul por longos períodos, a 4 ° C durante um período máximo de duas semanas. </li><li> Dissolver ditiotreitol (DTT) em água desionizada a 200 mM. Armazenar a -20 ° C em alíquotas de 100 ul, utilizar dentro de 8 horas de descongelamento. Pode ser novamente congelado. </li><li> Dissolver o paclitaxel (PT) em grau HPLC sulfóxido de dimetilo (DMSO) a 4 mM. Armazenar em alíquotas de 10 ul a -80 ° C a longo prazo, de -20 ° C a curto prazo. Utilizar dentro de 8 horas de descongelamento. Pode ser novamente congelado. </li><li> Dissolver glucose em água desionizada a 120 mg / ml. Armazenar em alíquotas de 100 uL a -20 ° C. Pode ser novamente congelado. </li><li> Disresolver o trifosfato de adenosina (ATP) em água desionizada a 150 mM, pH 7,0. Armazenar em aliquotas de 5 uL a -80 ° C, utilizar dentro de 8 horas de descongelamento. </li><li> Prepare 100x estoque de eliminação de oxigénio 25, dissolvendo glicose oxidase 10.000 unidades e as unidades de catalase 156000 em 600 ul de tampão de ensaio total. Centrifugar brevemente numa microcentrífuga para sedimentar os sólidos; sobrenadante filtro com 0,2 de filtro de seringa ^ m. Armazenar a -80 ° C em alíquotas de 10 ul por longos períodos, a 4 ° C durante até uma semana. </li></ol> 2. Microtúbulos Gliding Ensaio, Preparação Solução mesmo dia Preparar as soluções de 2,1-2,6, no dia da experiência. Com a prática, as soluções de 2,2-2,6 podem ser preparados durante o fluxo de células de lavagem. Salvo indicação em contrário, as soluções de manter em gelo. <ol><li> Prepare AB, 1 ml de tampão de ensaio com 10 ul de DTT stock (AB com 2 mM de DTT). Mantenha à temperatura ambiente. </li><li> Prepare bio-BSA, 40 &amp; mu; L de uma mistura de 1:1 do material de biotina-BSA e AB. Mantenha à temperatura ambiente. </li><li> Preparar tampão de BSA, 645 uL de mistura de AB, com 5,5 ul de BSA (1 mg / ml de BSA em AB). Mantenha à temperatura ambiente. </li><li> Preparar tampão SA, misturando 57 ul de estoque AB com 3 ul de estreptavidina (0,5 mg / ml de estreptavidina em AB). Mantenha à temperatura ambiente. </li><li> Prepare α-caseína tampão, misturando 200 ul de BSA, 50 ul de estoque de caseína, e 0,8 ul de 15 mM de ATP (1 mg / ml α-caseína, 0,8 mg / ml BSA, 50 nM de ATP em AB). Mantenha à temperatura ambiente. </li><li> Preparar tampão anti-branqueamento fluorescente, a mistura de tampão 95 ul α-caseína, 2,5 ul de estoque de glicose, uma mistura de oxigénio ul 100x limpeza, um estoque paclitaxel ul, 1 ul de 2-mercaptoetanol (βME). Adicionar βME sob coifa. Utilize uma solução tampão anti-lixívia fluorescência dentro de 1 hora de preparação CUIDADO:. ΒME é altamente tóxico e cheiro horrível. Certifique-se de abrir apenas sob a coifa. Garrafa loja noausência de luz, a luz degrada βME e sua capacidade de reduzir a fotodegradação. </li></ol> 3. Microtúbulos Ensaio Gliding <ol><li> Construção de cerca de quatro pistas de fluxo entre uma lamela 24 mm x 60 e 22 x 22 mm lamela utilizando graxa de vácuo, extrudados de uma seringa através de uma ponteira, como um espaçador. Cada pista de fluxo deve ser de aproximadamente 10 ul de volume (escala volumes subsequentes em conformidade). </li><li> Lave 10 ul de tampão BSA-bio em cada pista. Incubar 5 min para permitir a BSA para revestir as superfícies de vidro. </li><li> Lava-se cada pista três vezes com 15 ul de tampão de BSA para remover a biotina livre-BSA, enquanto continua a bloquear a superfície da lâmina. Usar um Kimwipe ou filtro de papel para remover o tampão de um lado oposto da câmara de fluxo, tendo a certeza de não permitir que as bolhas de ar a passar através da câmara de fluxo. </li><li> Lave 15 ul de tampão-SA em cada pista. Esperar 10 min, ou até 2 horas. A estreptavidina irá ligar à superfície ligada a biotina-BSA. </li><li> Lava-se cada pista três vezes com 15 ul de tampão de BSA para remover SA livre enquanto continua a bloquear a superfície da lâmina. </li><li> Lava-se cada via com 15 tampão α-caseína ul. α-caseína ajuda adicional bloquear a ligação não específica de cinesina e microtúbulos ao vidro. </li><li> Diluir cinesina de 10 nM em tampão de α-caseína e lave cada pista com 15 ul desta cinesina - α-caseína solução. Esperar 15 minutos (ou até uma hora) para a cinesina biotinilado para se ligarem especificamente a estreptavidina ligada à superfície. Os domínios kinesin motores serão livres de microtúbulos se ligam. </li><li> Diluir com paclitaxel a 40 uM em temperatura ambiente α-caseína-tampão, e lave cada pista com 15 ul desta solução para lavar a cinesina livre e para pré-carregar cada uma das câmaras de fluxo com uma solução de paclitaxel para evitar microtúbulos a partir de despolimerização. Frio também depolymerizes microtúbulos, para ter certeza essas etapas ocorrem em temperatura ambiente com sala de temperature soluções. </li><li> Diluir marcado por fluorescência microtúbulos 1:100-1:1,000 em tampão anti-branqueador fluorescente com 1 mM de ATP. Lave 15 ul em uma pista e observar dentro de 30 minutos. </li></ol> 4. Coleta de Dados <ol><li> Observar o deslizamento microtúbulos por microscopia de fluorescência, uma microscópio capaz de resolver fluoróforos individuais, tais como uma configuração TIRF comercial ou casa-build é necessária 26 (Figura 2). Os microtúbulos devem ser impelido pelos motores cinesina sobre o substrato a cerca de 0,5 um / s, dependendo da temperatura. Se o campo de visão do microscópio é 50 um, os microtúbulos individuais, deverá ser visível durante cerca de 100 segundos. Definido de modo que a intensidade de iluminação fluoróforos individuais não Fotobranqueador mais rapidamente do que 100 segundos. Se utilizar excitação com laser, uma configuração de corrente de aproximadamente 3-5 mW é adequada. </li><li> Colete sequências de imagens para análise. 600 imagens em5 Hz (total de 2 min) funciona bem. Utilize sequências de tempo suficiente para que os microtúbulos atravessar todo o campo de visão. </li></ol> 5. Análise de Dados Uma rotina IDL, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50117/50117IDL_Routines.zip" target="_blank">get_lp.pro</a> , está ligado. Esta rotina retorna um valor de comprimento persistência com base em todas delta microtúbulos em uma seqüência determinada imagem. Ou execute esta rotina em cada seqüência de imagens, modificar os parâmetros de intensidade, dependendo da configuração do seu microscópio especial, ou faça o seguinte: <ol><li> Acompanhar cada fluoróforo ligado a um microtúbulo para criar trajetórias fluoróforo. </li><li> Combine todas as trajetórias de fluoróforos sobre um microtúbulo dada em uma trajetória de microtúbulos global; repita para cada microtúbulo na seqüência de imagens (Figura 3). </li><li> Calcula-se o ângulo da tangente para cada ponto ao longo do percurso (Figura 4)E calcular &lt;cos θ s&gt; na equação. 1 por uma média de co-seno do ângulo de diferença para cada par de pontos separados por um caminho de comprimento s (Figura 5). Encontre o comprimento de persistência para um microtúbulo ou um grupo de microtúbulos por &lt;cos montagem θ s&gt; a eq. Uma ponderação, os pontos de dados individuais no ajuste do número de valores independentes de cos θ s que são usados ​​para calcular a média. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.

Medições de comprimento persistência são uma boa caracterização das propriedades mecânicas dos biopolímeros individuais. Neste artigo, descreve um método de medição do tamanho de persistência de microtúbulos. Conforme referido na introdução, este método é facilmente estendido para examinar as propriedades mecânicas de microtúbulos em uma variedade de condições, simplesmente por variação dos reagentes, temperatura, viscosidade ou no último passo do ensaio delta, 3,9, ou por polimerização de micr...

O citoesqueleto, uma rede de biopolímeros encontrados na maioria das células eucariotas, desempenha um papel na organização celular, transporte intracelular, e da mecânica de células. As características mecânicas dos biopolímeros do citoesqueleto (principalmente actina e microtúbulos) desempenham um papel importante na determinação das características mecânicas da célula como um 12 todo. Uma vez que a mecânica de células inteiras pode caracterizar as células saudáveis ​​e doentes 13,14 e está envolvido na motilidade celular 15, as propriedades mecânicas dos componentes do citoesqueleto subjacentes têm sido uma área activa de estudo para as duas últimas décadas 1. A flexibilidade (ou rigidez) de biopolímeros é caracterizado pela persistência comprimento, o comprimento do polímero, que se dobra por aproximadamente um radiano sob flutuações térmicas à temperatura ambiente. Um número de técnicas têm sido desenvolvidas para medir o comprimento da persistência 16, por example técnicas activas que envolvem flexão do polímero utilizando fluxo hidrodinâmico, armadilhas ópticas, ou campos eléctricos 4,17,18, e técnicas passivas que medem as variações de polímeros livres em solução de 5,6. As medidas activas, no entanto, exigem instalações especializadas para implementar forças conhecidas na escala micrométrica, e as medições de flutuação livre pode ser um desafio devido à difusão para fora do plano de focagem do microscópio utilizado. Neste artigo, descrevemos um complementar, a técnica passiva, para medir o comprimento persistência de microtúbulos, um polímero do citoesqueleto. A técnica envolve a ensaios de deslizamento, que asseguram que o polímero permanece sempre no plano focal 19. Além disso, envolve rastreamento fluoróforos individuais ligados permanentemente ao polímero de interesse, de modo a que locais específicos ao longo do polímero estão bem caracterizados. Uma caricatura do método é mostrado na Figure 1. Cinesina move especificamente para a extremidade + de microtúbulos, de modo que os microtúbulos em um ensaio de deslizamento são impulsionadas unidireccionalmente. A extremidade dianteira do microtúbulo, para além da última cinesina ligado, está livre para oscilar sob as forças térmicas da solução circundante. À medida que o microtúbulo é impelido para a frente, a fim flutua até se ligar a uma molécula de cinesina novo mais ao longo da lâmina de vidro congela numa variação determinada. Porque cinesina atribui microtúbulos muito fortemente, a microtúbulos é obrigada a seguir o caminho da extremidade dianteira. Portanto, as flutuações estatísticas congelados na trajectória de microtúbulos são as mesmas que as flutuações estatísticas da extremidade livre dos microtúbulos 11, e pode, portanto, ser utilizadas para calcular o comprimento de acordo com persistência a 20 <img alt="Equação 1" fo:content-width="1in" fo:src="/files/ftp_upload/50117/50117eq1highres.jpg" src = &quot;files/ftp_upload/50117/50117eq1.jpg /&quot; /&gt; onde p l é o comprimento de persistência do microtúbulo, θ s é o ângulo entre as tangentes à trajetória separados por um comprimento de contorno, e &lt;&gt; denota uma média sobre todos os pares de posições, separadas por um comprimento de contorno. O ensaio de deslizamento próprio usa cinesina biotinilado na 21 coiled-coil se liga especificamente a lâmina de vidro por meio de uma ligação biotina-estreptavidina. Esta ligação assegura que os domínios do motor está livre para se ligar a microtúbulos e impulsionar. A fim de acompanhar as trajetórias de microtúbulos, os microtúbulos são escassamente marcado com fluoróforos orgânicos 22,23 - os rótulos devem ser escasso o suficiente para que fluoróforos individuais são resolúveis por microscopia de fluorescência única molécula. Fluoróforos individuais são rastreados usando rotinas de análise de imagem escritas em IDL. As trajetórias de cada fluoróforo ligado a um microfone dadorotubule são combinados em uma trajetória de microtúbulos composto automaticamente 24. Os ângulos θ tangentes a cada ponto ao longo de uma trajetória são calculados, a partir desses ângulos tangentes a &lt;cosθ s&gt; valor é calculado para cada s comprimento do contorno. Finalmente, estes dados estão aptos a equação. 1, a fim de extrair um comprimento de persistência para um microtúbulo dado, ou para muitos microtúbulos no ensaio de deslizamento mesmo. O método é suficientemente robusto para trabalhar com microtúbulos preparados numa grande variedade de condições (com diferentes agentes estabilizadores ou outras moléculas pequenas ligadas ao microtúbulo, com proteínas de microtúbulos ligados associados (MAPs), ou com uma variedade de soluções viscosas). No nosso laboratório, a técnica tem sido utilizada para caracterizar a duração de persistência de microtúbulos, como uma função do comprimento ao longo dos microtúbulos e microtúbulos com diferentes agentes estabilizantes. A principal restrição é que os microtúbulos deve ainda suporte motilidade cinesina. Uma vez que é uma enzima cinesina do motor robusto, este é uma restrição relativamente solta. Através da substituição de microtúbulos com a actina e com uma enzima de cinesina família miosina, o comprimento de persistência da actina podem ser medidos utilizando a mesma técnica.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; Reagentes</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Imidazol</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; I2399</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cloreto de potássio</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; P9541</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cloreto de magnésio</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; M8266</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BSA</td&gt;<td&gt; Calbiochem</td&gt;<td&gt; 126615</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Biotinilado BSA</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 29130</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Α-caseína</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; C6780</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Estreptavidina</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 21125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ditiotreitol</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; D0632</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Paclitaxel</td&gt;<td&gt; LC Laboratories</td&gt;<td&gt; P-9600</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glucose oxidase</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; G2133</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Catalase</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; C100</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glicose</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; G8270</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ATP</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; A2383</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 2-mercaptoetanol</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; M3148</td&gt;<td&gt; Tóxico. Comprar pequena quantidade.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24x60 mm N. º 1 1/2 tampa de vidro</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48393-252</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 22x22 mm No. 1 tampa de vidro</td&gt;<td&gt; Gold Seal</td&gt;<td&gt; 3306</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Graxa de alto vácuo</td&gt;<td&gt; Dow Corning</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; Equipamentos</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Microscópio TIRF</td&gt;<td&gt; Muitos</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt; O microscópio TIRF usado neste método foi feito em casa.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; IDL (software)</td&gt;<td&gt; Exelis</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt; Poderia substituir MATLAB, ImageJ, ou outro software de análise de imagem.</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

flexural rigidity measurements of biopolymers using gliding assays

Microtúbulos do citoesqueleto são polímeros que têm um papel na divisão celular, a mecânica de células e transporte intracelular. Cada uma dessas funções requer microtúbulos, que são rígidas e reto suficiente para abranger uma fracção significativa do diâmetro da célula. Como resultado, o comprimento de persistência de microtúbulos, uma medida de rigidez, tem sido activamente estudados nas duas últimas décadas 1. No entanto, permanecem questões abertas: microtúbulos curtas são 10-50 vezes menos rígido do que os microtúbulos de comprimento 2-4, e mesmo os microtúbulos longos mediram comprimentos de persistência que variam de uma ordem de magnitude 5-9. Aqui, apresentamos um método para medir o comprimento persistência microtúbulos. O método baseia-se num ensaio de cinesina-driven microtúbulos deslizamento 10. Através da combinação de marcação fluorescente esparsa de microtúbulos individuais com acompanhamento única partícula de fluoróforos individuais associadas ao microtúbulo, o glidintrajetórias g de microtúbulos individuais são controlados com nível de precisão nanométrica. O comprimento das trajectórias de persistência é o mesmo que o comprimento de persistência do microtúbulo sob as condições utilizadas 11. Uma rotina de rastreamento automatizado é utilizado para criar trajectórias de microtúbulos a partir de fluoróforos ligados aos microtúbulos individuais, e o comprimento desta trajectória persistência é calculada utilizando rotinas escritas em IDL. Esta técnica é rapidamente implementável, e capaz de medir o comprimento de 100 persistência microtúbulos no mesmo dia da experimentação. O método pode ser estendido para medir o comprimento da persistência sob uma variedade de condições, incluindo a duração de persistência como uma função do comprimento ao longo dos microtúbulos. Além disso, as rotinas de análise utilizados pode ser estendido a miosina ensaios baseados em acção de deslizamento, para medir o comprimento dos filamentos de actina persistência também.

Um instantâneo a partir de um ensaio de deslizamento é mostrado na Figura 2. A densidade de microtúbulos bom é microtúbulos 1-10 por campo de observação; substancialmente mais resultará em mistracking como microtúbulos se cruzam. Um gráfico das trajectórias de microtúbulos a partir de 11 no ensaio de deslizamento da Figura 2 é mostrado na Figura 3. Trajetórias típicas são de 10 a 30 ^ m de comprimento; algumas trajetórias têm lacunas onde se cruza com ...

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Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Um método para medir o comprimento de persistência ou rigidez à flexão de biopolímeros é descrito. O método utiliza uma cinesina-driven microtúbulos ensaio deslizar para determinar experimentalmente o comprimento persistência dos microtúbulos individuais e é adaptável a actina ensaios baseados em deslizamento.

Flexão Medidas rigidez de Biopolímeros usando ensaios de deslizamento

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.7K visualizações.  Lawrence University. Um método para medir o comprimento de persistência ou rigidez à flexão de biopolímeros é descrito. O método utiliza uma cinesina-driven microtúbulos ensaio deslizar para determinar experimentalmente o comprimento persistência dos microtúbulos individuais e é adaptável a actina ensaios baseados em deslizamento.

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Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale's proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.
An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale's biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.
To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.
Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Development of custom assays on the ViBE platform for more sensitive, reproducible, automated results in complex matrices is described. The universal cartridge allows assays to be easily adapted for use with custom assays. This versatility enables rapid development and validation of novel assays or automated versions of existing manual assays, exemplified in this video.

Desenvolvimento personalizado Ovário de Hamster Chinês hospedar-Cell ensaios de proteína utilizando a Tecnologia micropartícula Acústico Membrana

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Bioengenharia

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Multiplexados molécula única Força Medidas proteólise, usando uma pinça magnética

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

Micro-partículas Velocimetry Imagem para a velocidade Medidas de fluxos de sangue Micro Perfil

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

Medição Longitudinal de Matriz Extracelular Rigidez em 3D tumorais modelos com o uso de rastreamento de partículas Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Conta Agregação ensaios para a caracterização dos putativos Moléculas de Adesão Celular

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Molecular Entanglement and Electrospinnability of Biopolymers

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope was found to be an essential prerequisite for successful electrospinning. Rheology is a powerful tool to probe the molecular conformation and interaction of biopolymers. In this report, we demonstrate the protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan, from their dimethyl sulfoxide (DMSO)/water dispersions. Well-formed starch and pullulan fibers with average diameters in the submicron to micron range were obtained. Electrospinnability was evaluated by visual and microscopic observation of the fibers formed. By correlating the rheological properties of the dispersions to their electrospinnability, we demonstrate that molecular conformation, molecular entanglement, and shear viscosity all affect electrospinning. Rheology is not only useful in solvent system selection and process optimization, but also in understanding the mechanism of fiber formation on a molecular level.

Electrospinning is a fascinating technique used to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. Molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope is essential for successful electrospinning. We present a protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan.

Entanglement Molecular e Electrospinnability de Biopolímeros

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and macro-structures, as seen in the cases of moving water in vascular bundles and moisturizing water in skin layers. In this study, we developed a method for assessing the effect of aqueous liquid crystalline (LC) solutions composed of biopolymers on drying. As LC biopolymers have megamolecular weight, we chose to study polysaccharides, cytoskeletal proteins, and DNA. The observation of biopolymer solutions during drying under polarized light reveals milliscale self-integration starting from the unstable air-LC interface. The dynamics of the aqueous LC biopolymer solutions can be monitored by evaporating water from a one-side-open cell. By analyzing the images taken using cross-polarized light, it is possible to recognize the spatio-temporal changes in the orientational order parameter. This method can be useful for the characterization of not only artificial materials in various fields, but also natural living tissues. We believe that it will provide an evaluation method for soft materials in the biomedical and environmental fields.

A method for the drying-induced self-integration of megamolecular biopolymers on the air-liquid crystalline interface is provided here. This methodology will be useful not only for understanding the macroscopic potentials of biopolymers, but also as an evaluation method for soft materials in biomedical and environmental fields.

Os métodos para a auto-integração da Megamolecular Biopolímeros na secagem ao ar-LC interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. However, the experimental determination of the power input in small-scale vessels is still challenging due to relatively high friction losses inside typically used bushings, bearings and/or shaft seals and the accuracy of commercially available torque meters. Thus, only limited data for small-scale bioreactors, in particular single-use systems, is available in the literature, making comparisons among different single-use systems and their conventional counterparts difficult.
This manuscript provides a protocol on how to measure power inputs in benchtop scale bioreactors over a wide range of turbulence conditions, which can be described by the dimensionless Reynolds number (Re). The aforementioned friction losses are effectively reduced by the use of an air bearing. The procedure on how to set up, conduct and evaluate a torque-based power input measurement, with special focus on cell culture typical agitation conditions with low to moderate turbulence (100 &#60; Re &#60; 2&#183;104), is described in detail. The power input of several multi-use and single-use bioreactors is provided by the dimensionless power number (also called Newton number, P0), which is determined to be in the range of P0 &#8776; 0.3 and P0 &#8776; 4.5 for the maximum Reynolds numbers in the different bioreactors.

The power input in stirred bioreactors can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. This manuscript describes how an air bearing can be used to effectively reduce friction losses observed in mechanical seals and improve the accuracy of power input measurements in small-scale vessels.

Entrada de poder de medições em biorreatores mexidas em escala de laboratório

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the flexural behavior of these LBBSs is important for understanding the origins of their remarkable mechanical functions.
We describe a protocol for performing three-point bending tests using a custom-built mechanical testing device that can measure forces ranging from 10-5 to 101 N and displacements ranging from 10-7 to 10-2 m. The primary advantage of this mechanical testing device is that the force and displacement capacities can be easily adjusted for different LBBSs. The device&#39;s operating principle is similar to that of an atomic force microscope. Namely, force is applied to the LBBS by a load point that is attached to the end of a cantilever. The load point displacement is measured by a fiber optic displacement sensor and converted into a force using the measured cantilever stiffness. The device&#39;s force range can be adjusted by using cantilevers of different stiffnesses.
The device&#39;s capabilities are demonstrated by performing three-point bending tests on the skeletal elements of the marine sponge Euplectella aspergillum. The skeletal elements&#8212;known as spicules&#8212;are silica fibers that are approximately 50 &#181;m in diameter. We describe the procedures for calibrating the mechanical testing device, mounting the spicules on a three-point bending fixture with a &#8776;1.3 mm span, and performing a bending test. The force applied to the spicule and its deflection at the location of the applied force are measured.

We present a protocol for performing three-point bending tests on sub-millimeter scale fibers using a custom-built mechanical testing device. The device can measure forces ranging from 20 &#181;N up to 10 N and can therefore accommodate a variety of fiber sizes.

Um milímetro escala Flexural sistema de testes para medir as propriedades mecânicas de espículas de esponja marinha

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.