Este protocolo foi desenvolvido no âmbito de um Wellcome Trust subvenção. Agradecemos a Sra. Maureen Sinclair para manter os estoques de moscas e preparar a comida mosca ao longo dos anos. Gostaríamos também de agradecer ao Sr. Michael Aitchison por sua ajuda e apoio técnico no desenvolvimento deste protocolo.

1. Moscas transgênicas e Manutenção <ol><li> O transgénico moscas utilizado nesta demonstração: UBQ-GFP-Cdc20 (II), UBQ-rfp-His2B (X *); UBQ-GFP-Cdc20 (II *), UBQ-GFP-Cdc20 (II *); Mad2 EY ( III *) e UBQ-GFP-Cdc20 moscas transgênicas foram previamente gerado em laboratório através de uma abordagem mediada padrão P-elemento transgênico 10,11 e UBQ-rfp-His2B é um presente tipo de Yohanns Belaïche em UMR 144 CNRS / Instituto Curie, Paris, França. Eles foram introduzidos em um fundo Mad2 mutante através de padrão de Drosophila genética. O Mad2 EY linha original mutante foi comprada do estoque Bloomington centro. Nós não vamos discutir o procedimento utilizado para elevar os transformantes neste protocolo. Nota: * representa o número de cromossomos. </li><li> Manutenção: moscas transgénicas foram mantidas a 25 ° C em frascos de plástico containing voar alimentos e de pó de levedura seco adicional no topo. O frasco foi rotineiramente substituído a cada 3-4 semanas, dependendo das condições de crescimento (Figura 1). </li></ol> 2. Fly Preparação de Alimentos (escala de laboratório) <ol><li> Uma quantidade apropriada da mistura alimentar mosca foi aquecida com agitação constante para dissolver os componentes. </li><li> Cerca de 8-10 ml deste meio foi distribuído como lama em cada frasco de plástico (2,5 cm de diâmetro x comprimento de 8 cm) utilizando um Jencons Scientific Ltd bomba peristáltica. </li><li> Quando a lama alimento foi definido e ter arrefecido até à temperatura ambiente, o frasco é então ligado com um tampão de espuma de algodão. Estes frascos alimentos são colocados em uma bandeja que é então selado num saco de plástico e mantida a 4 ° C para utilização posterior. </li></ol> 3. Pequena escala coleta de ovos <ol><li> Cerca de 50 pares de 2-3 dias de idade moscas adultas foram transferidos para um frasco fresco mosca alimento fornecido com pó de levedura adicional sobre a sua superfície seca a 25 ° C durante leigoção embriões. </li><li> As moscas são então transferidos para um frasco fresco a cada hora e deixar os embriões no frasco durante 30 minutos para assegurar a alguns dos embriões recolhidos são envelhecidas de cerca de 8-10 ciclo nuclear de divisão, quando os núcleos são gradualmente migrar para o córtex e organizada como uma monocamada único. A coleção de primeira hora são normalmente descartados, pois muitas vezes contém embriões idade que foram retidos nos corpos femininos quando as condições não eram adequadas para o assentamento. </li></ol> 4. Preparando Lamelas e slides <ol><li> Retire uma lamela de 50 x 22 mm e ligeiramente molhado seus quatro cantos de um lado com uma quantidade muito pequena de água utilizando uma escova de caneta húmido fina e colocá-la numa lâmina de microscópio de modo a que a lamela não se move por causa da tensão superficial capilar causada pela película fina de líquido. </li><li> Aplicar uma tira fina de cola heptano através do meio da lamela, o heptano deve evaporar em segundos para deixar a cola sobre a lamela. </li><li>Corte outra lamela com uma caneta de diamante em quadrados pequenos (~ 1,5 mm 2), pegar um e colocá-lo em uma extremidade da tira de cola (isto é usado para abrir a ponta da agulha quando microinjeção é necessária) e salvar os outros para o futuro usar. </li><li> Pegue outra lâmina de microscópio e enfiar um pedaço de fita dupla face adesiva cerca de 2 cm de comprimento para ele e retire o papel da capa. (Veja a Figura 2A e B). </li></ol> 5. Embriões Dechorionate <ol><li> Transferir as moscas para um frasco de alimentos frescos e usar uma escova de caneta humedecido fina para transferir cerca de 50 ovos na fita de dupla face adesiva na lâmina com uma quantidade apropriada de líquido, para permitir que os ovos de ser espalhada. Quando o líquido se evapore os ovos vai ficar com a fita. </li><li> De acordo com um toque estereomicroscópio os ovos várias vezes ao longo de seu eixo longitudinal usando o lado externo da metade de um par de pinças suavemente até que o córion é quebrado e aberto, mas deixar o embrião no chorion shell para evitar a desidratação rápida. Continue este processo até 10-20 dos ovos foi tratado (dependendo do número de ovos necessários para uma única experiência). </li><li> Os embriões podem então ser levantado e retirado do reservatório cório e colocado suavemente sobre a tira de cola, um por um. Os ovos pode ser colocado e alinhado tanto com o lado comprido do paralelo embrião ou anti-paralela ao lado longo da tira de cola depender se eles estão a ser microinjeção. </li><li> Os embriões podem ser coberta imediatamente com uma quantidade apropriada de Voltalef óleo 10S (uma mistura 5:1 de óleo de Holocarbon 700 e 27 óleo, Sigma) para evitar a dessecação ainda mais para imagiologia imediata ou colocado numa câmara de dessecação por 3-8 minutos para desidratar-los ainda mais, dependendo da umidade da sala eo propósito do experimento. Os embriões desidratados deve ser coberta com óleo de 10S, quando apropriado para evitar excesso de desidratação-se microinjecção é necessária. (Veja a figura. 2C, D&amp; E). </li></ol> 6. Embriões de imagem <ol><li> Imagens lapso de tempo ou único de embriões vivos são coletados por meio de uma Leica TCS SP2 sistema de microscopia confocal invertido com uma APO PL HCX CS 40X 1,25 objetiva de imersão em óleo (60 ou objetivos 100X pode ser usado também, dependendo da finalidade do experimento, o maior a ampliação usou a foto mais de branqueamento irá ocorrer). </li><li> Quando fluoróforos de imagem múltiplos, que se sobrepõem espectros e são co-expressas no mesmo embrião, cada comprimento de onda de emissão fluorescente de proteína foi recolhido sequencialmente. Os comprimentos de onda de excitação e emissão disponíveis no sistema Leica SP2 TCS são: GFP, λ Ex: 488 nm e λ Em: 500-600 nm. RFP, λ Ex: 543 nm e λ Em: 555-700 nm. </li><li> Uma única imagem foi geralmente obtido como uma média de 2 scanlines com uma média de 2 moldura-scans. Isso leva um mínimo de 6,3 segundos para digitalizar uma p 512x512Ixel imagem num modo de varrimento simultâneo, e 15,44 segundos para um modo de busca sequencial e produz uma relação sinal-ruído boa. Estes tempos precisam ser levados em conta quando configurar os prazos para lapso de tempo de coleta de imagem. </li><li> O furo foi normalmente ajustado para 1-2 UA (unidade arejado), ea potência do laser foi ajustado para o nível mais baixo possível, para evitar qualquer fotobranqueamento significativa. </li></ol> 7. Provocar o SAC por Microinjecting os embriões com reagentes apropriados <ol><li> Preparar a agulha antes da experiência. Nós preferimos retirar a agulha da siliconada capilares de vidro (GC-100-10, de Harvard), utilizando o flamejante / marrom micropipeta extrator (Instrumento Sutter, Modelo: P-97) com os parâmetros: calor = 600, puxe = 90, vel = 70 , del = 150. </li><li> Aterrar a agulha com 1-2 ml de uma concentração apropriada do reagente em tampão de injecção utilizando uma ponta de carregamento fina (20 lote Eppendorf uL: W215818J). </li><li> Montar a agulha na agulha holder no microscópio com o tubo de pressão ligado ao sistema de controlo de injecção Eppendorf. </li><li> Encontrar um embrião sob a objectiva de 40x e encontrar a sombra agulha sem alterar o plano focal, movendo a agulha no centro do campo de vista e, gradualmente, reduzindo-a para o plano focal direita. </li><li> Mover o embrião fora suavemente para encontrar o pequeno quadrado da lamela quebrada pré-montado numa extremidade da tira de cola. Muito gentilmente mover a ponta da agulha até atingir a borda da lamínula quadrado pequeno e delicadamente quebra-lo aberto. </li><li> Mova os embriões de volta em exibição e selecione o embrião da idade certa para injeção. Eu normalmente injetar o embrião no ciclo de divisão nuclear em 5-7 como este é antes de os núcleos migram para o exterior para o córtex. As fases do ciclo de divisão nuclear pode ser determinada por uma análise rápida dos sinais de fluorescência da GFP-Cdc20 ou o sinal nuclear do 2B RFP-Histona antes da injecção 9. </li><li> Mover cuidadosamente o EmbryO próximo da agulha e reajustar o plano focal para ambos o embrião e da agulha. Mova o embrião para a agulha e injetar uma gota do reagente para a posição desejada e mova o embrião de distância (ou siga as instruções para o sistema de microinjeção). O embrião pode ser injectado a partir da sua posterior ou a partir do lado, dependendo da finalidade da experiência. </li><li> Uma vez injetado o embrião está pronto para ser trabalhada no momento apropriado. (Veja a Figura 2F &amp; G) </li></ol> 8. Os resultados representativos <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig1.jpg" /> Figura 1. Materiais necessários: a. escova de caneta fina, b. pequeno recipiente quebrados óculos quadrado, c. 22 x 50 mm lamela, d. lâmina de microscópio, e. fita dupla face adesiva, f. pó de levedura seca, em tubo de ensaio com orifícios na tampa, g. leveduragrânulo usado para a manutenção da mosca, h. voar frasco de alimentos, i. uma metade de uma pinça utilizados para embriões dechorionate, j. uma pinça par, k. heptano recipiente de líquido de cola (balão volumétrico). <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig2.jpg" /> Figura 2. Os diagramas mostram a preparação de as lamelas e slides no passo 4, dechorionation embrião no passo 5 e preparações de agulhas para microinjecção no passo 7. Uma. A imagem acima mostra uma lamela com uma tira de cola heptano em toda a sua média e uma pequena praça de uma lamela quebrado preso a uma extremidade. A imagem inferior mostra uma lâmina de microscópio com uma fina camada de água nos seus quatro cantos para segurar uma lamela. A razão para usar uma lâmina para segurar a lamela é manter mais ou menos a mesma distância focal como a encontrada quando você tem fita dupla face nos slides e evitando assim a recentragem do microscópio enquanto você are dissecando e transferindo os embriões entre fita e lamela. B. Um slide com um pequeno pedaço de fita dupla face Scotch aplicado antes de descascar seu papel da capa usada para dechorionating o embrião. C. A imagem da esquerda mostra embriões com conchas intactas córion com marcados extremidades anterior e posterior; a imagem à direita mostra os embriões nas cascas córion quebrados antes de serem transferidos para a lamela com a tira cola D &amp; E Diagramas mostrando dois.. formas de transferência, colocação e alinhamento dos embriões dechorionated em tiras de cola. Os embriões foram cobertos por óleo 10S após um período de dessecação apropriado. F e G. diagramas mostrando como para abrir a ponta da agulha e posicioná-lo de modo a injectar. Imagens individuais ou lapso de tempo obtidos a partir das experiências descritas acima podem ser diretamente analisados ​​usando o software Leica ou salvos em arquivos TIF como fo abertormat disponíveis para a quantificação mais ou análises usando outros programas de edição de imagem comuns de análise, tais como Imagem J, Photoshop e etc MetaMorph Dois exemplos para ilustrar isso são discutidos abaixo: Exemplo 1: Um filme de lapso de tempo (Figura 3) mostra o recrutamento cinetocoro dinâmica da GFP Cdc20 e movimento cromossomo em viver embriões de Drosophila sinciciais. A região de interesse a partir de imagens originais do lapso de tempo foi determinada seqüência / editado e convertido de lote automatizado utilizando o software Photoshop. O filme foi montado utilizando o software QuickTime. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig3.jpg" /> Figura 3. Um filme de lapso de tempo mostra o recrutamento cinetocoro dinâmica da GFP Cdc20 e movimento cromossomo em viver embriões de Drosophila sinciciais. (A) lapso de tempo as imagens foram retiradas de um embrião transgênico sincicial co-expressando GFP-Cdc20 (em verde)e RFP-histona 2B (em vermelho) e proteínas de fusão foram gravados usando uma Leica TCS sistema SP2 confocal a 18 ° C durante os ciclos de divisão nuclear 7-8. Quadros foram realizadas a cada 10 segundos. O quadro com as células já em prófase é tratada como o ponto de tempo zero 10. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3763/3763movie3A.mov" target="_blank">Clique aqui para ver filme para Figura 3A</a> . (B) GFP-Cdc20 pode ser facilmente observada na prófase e cinetócoros prometáfase (B3 e 4, setas brancas) e persiste em metáfase e anáfase cinetócoros (B5 e 6, setas brancas). GFP-Cdc20 é excluído da interfase núcleo (seta branca), entrar no núcleo por prófase. Morfologias de cromatina foram determinados usando co-expressa His2BmRFP como marcadores (B8-14). Bares = 5mm. Exemplo 2: funções do SAC pode ser estudada através da manipulação dos embriões por anticorpos, proteínas microinjecting fluorescente etiquetado ou chemical compostos de interesse que, potencialmente, desencadear o SAC. Para a colchicina exemplo injecção para despolimerizar os microtúbulos de modo a provocar o SAC, tal como indicado na Figura 4 10. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig4.jpg" /> Figura 4. Mad2 é essencial para colchicina-invocado função SAC 10. GFP-cdc20; Mad2 + / +, GFP-cdc20; Mad2 EY (Mad2 - / - nula mutante) e GFP-Mad2; Mad2 embriões EY foram tratados com colchicina por microinjecção. Lapso de tempo imagens confocal foram tomadas antes (01, 07 e 13) ou após a injeção (02-06, painéis de topo; 08-12, painéis de média; 14-18, painéis de fundo). GFP-Cdc20 (painéis superior e meio) ou GFP-Mad2 (painel inferior) sinais de cinetocoro foram utilizados como marcadores de células a progressão do ciclo. Painel superior, as setas indicam os cinetócoros presos em 02-06. A área marcada por uma seta em 01 indica que antes do tratamento colchicina, GFP-CDC20 está excluído do núcleo interfase tarde. Painel do meio, na ausência de Mad2 endógena, GFP-Cdc20 sinais continuar a oscilar para dentro e para fora do núcleo, e ligado e desligado os cinetócoros, embora citocinese parece ser defeituoso, como seria de esperar em embriões que faltam os microtúbulos, na presença de colchicina (indicado pelas setas na 07-12), sugerindo uma função SAC falhou em prender as células em resposta ao tratamento colchicina. Separação do núcleo filha não na imagem 10. Painel de fundo, pontas de seta em 14-18 indicam cinetócoros presos com GFP-Mad2 acumulado proteínas de fusão para sugerir a funcional GFP-Mad2 no resgate do fenótipo defeito SAC em Mad2 embrião mutante. Arrowhead em 13 indica GFP-Mad2 acumulação em um núcleo interfásico tarde. Bar = 5mm. Os embriões foram microinjeção com ~ volume de ovo de 1% de uma solução de 100mg/ml colchicina estoque em 1 x PBS.

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Não temos nada a divulgar.

O protocolo aqui descrito é um método genérico para imagiologia voar embriões sinciciais utilizando uma Leica TCS SP2 microscópio confocal de laser e pode ser modificada para se adequar sistemas de microscópio e outros podem também ser adaptados para estudar as funções de outros genes, utilizando embriões de Drosophila sinciciais. Nós temos usado esse protocolo para estudar vários aspectos do checkpoint do fuso, dinâmica de proteínas e proteólise da proteína usando moscas transgénicas ou anticorpos policlonais para visualizar a localização de proteínas em amostras vivas ou fixo 4,6,12-14. É mais simples para manter as moscas em frascos de alimentos frescos mosca aquando da recolha números pequenos (~ 10 - 100) de ovos. Isso reduz o incômodo de fazer e preparar adicionais maçã placas de ágar suco e câmaras de coleta de ovos, conforme descrito em outras publicações 15,16. A adição de um pequeno quadrado de vidro quebrado lamela em uma extremidade da tira de cola sobre a lamela torna muito mais fácilpara abrir a agulha e determinar o volume de injecção, ajustando as configurações do sistema microinjecção, enquanto a agulha é imersão no óleo 10S. O grau de dessecação do embrião é importante para o sucesso da injecção em evitar fugas e manter a viabilidade dos embriões especialmente para aquelas experiências que requerem um longo período de tempo ou quando elevar transformantes após a injecção. No entanto, não existe uma regra de ouro para exactamente quanto tempo a dessecação é necessária. Isto varia de experiência para experiência e depende da quantidade da solução injectada ea humidade do ambiente de trabalho. As funções de uma proteína específica de interesse pode ser manipulado por microinjecting inibidores da proteína específicas, mono ou poli-clonais anticorpos contra uma proteína específica, o RNA mensageiro ou péptidos marcados fluorescentemente sob tipo selvagem ou fundos mutação genética. Muitas dessas linhagens mutantes ou GFP linhagens transgênicas são publicamente avdisponív eis de Drosophila estoque centros ea maioria deles estão listados no Flybase ( <a href="http://flybase.org/" target="_blank">http://flybase.org/~~V</a> ) e podem ser pesquisados ​​on-line.

Equipamento essencial e reagentes: Sistema de imagem confocal: O sistema de imagem descritos neste protocolo é uma Leica TCS SP2 sistema de varredura a laser microscópio confocal invertido. O método descrito é também adequado talvez com algumas pequenas modificações para sistemas de imagens outros. Microscópio de dissecção: Usamos um SZX7 Olympus com DF PLAPO 1X-4 lente. Agulha extrator: Flaming / marrom micropipeta puxador (de Instrumento Sutter, modelo: P-97). Sistema de microinjecção: Um sistema de microinjecção Eppendorf é descrito, mas qualquer outro sistema adequado pode ser usado. Fly distribuidora de alimentos: Jencons Scientific Ltd bomba peristáltica. Reagentes: <table border="1"><tbody><tr><td> Ingredientes </td><td> Pesos </td><td> Recursos </td><td> N. º de Lote </td></tr><tr><td> Farinha de milho </td><td> 100,0 g </td><td> SUMA, Reino Unido </td><td></td></tr><tr><td> Açúcar mascavo </td><td> 50,0 g </td><td> Billington, UK </td><td></td></tr><tr><td> A levedura seca </td><td> 25,0 g </td><td> DCL LEVEDURA Ltd. do Reino Unido </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> 12,5 g </td><td> Fisher Scientific </td><td> 106556 </td></tr><tr><td> O ácido sórbico </td><td> 0,4 g </td><td> BDH, VWR International Ltd. no Reino Unido </td><td> 8829310 </td></tr><tr><td> O ácido benzóico </td><td> 2,9 g </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1019599 </td></tr><tr><td> Nipagin (Metil-4-Hidro xybenzoate) </td><td> 0,9 g </td><td> BDH, VWR International Ltd. no Reino Unido </td><td> K35969015 </td></tr><tr><td colspan="3"> H 2 O até 1L </td><td></td></tr></tbody></table><pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Tabela 1. Fly ingredientes alimentares. Holocarbon 700 e 27 óleos adquiridos de Sigma. A levedura seca: Thomas Allison, Reino Unido. Preparar a cola heptano: Pegue cerca de 1,5 metros de fita dupla face Scotch, colocá-lo em um tubo Falcon 15ml com 5 ml de heptano e rodar por 3-5 horas ou durante a noite. Após esse tempo dividido em 4 alíquotas iguais em 1,5 ml tubos de centrífuga eppendorf e girar durante 5 min a uma velocidade rápida numa centrífuga de bancada para remover todos os detritos. Armazenar a solução de cola de heptano num balão volumétrico de 10 ml e manter para utilização. A força de cola irá variar de acordo com a concentração e as quantidades de a cola utilizada. Normalmente, a mais fina de cola produz menor ruído de fundo quando verificado pelo microscópio confocal. <ul><li> Lamela: BDH, VWR International Ltd. no Reino Unido </li><li> Lâmina de microscópio: BDH, VWR International Ltd. no Reino Unido &lt;/ Li&gt; <li> Siliconizado capilares de vidro: GC-100-10, Harvard </li><li> Ponta de carga Fina: 20 uL muito eppendorf: W215818J </li><li> Pinça </li><li> Escova caneta fina </li></ul>

studying mitotic checkpoint by illustrating dynamic kinetochore protein behavior and chromosome motion in living drosophila syncytial embryos

O eixo de montagem checkpoint mecanismo (SAC) é um sinal activo, que monitora a interação entre cinetócoros cromossômicas e microtúbulos do fuso para prevenir o surgimento anáfase até que os cromossomos estão conectados corretamente. As células usam este mecanismo para evitar a instabilidade genômica ou aneuploidia, e, portanto, cânceres e outras doenças humanas, como defeitos de nascimento e de Alzheimer 1. Um certo número de componentes, tais como SAC Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, MPS1, Zw10, Rod e Aurora B quinase têm sido identificados e são todas as proteínas cinetocoro dinâmicos 2. A evidência sugere que a cinetocoro é onde o sinal de SAC é iniciada. O SAC é o principal alvo de regulamentação Cdc20. Cdc20 é um dos essenciais APC / C (A naphase P ROMOVER C omplex ou C yclosome) activadores 3 e é também uma proteína cinetocoro dinâmica 4-6. Quando ativado, o SAC inibe a atividade da APC / C para evitar a destruição de dois substratos de chave, a ciclina B e securin, impedindo assim a metáfase para anáfase transição 7,8. Exatamente como o sinal de SAC é iniciada e montados sobre os cinetócoros e retransmitido para a APC / C para inibir a sua função ainda permanece indefinida. Drosophila é um sistema extremamente tratável experimental; um organismo muito mais simples e mais bem entendido, em comparação com o humano, mas um que partilha processos fundamentais em comum. É, talvez, um dos melhores organismos para uso de bio-imagem estudos em células vivas, especialmente para a visualização dos eventos de mitose no espaço e no tempo, como o embrião passa por 13 ciclos rápidos de divisão nuclear de forma síncrona (8-10 minutos para cada ciclo a 25 ° C) e, gradualmente, organiza os núcleos em uma monocamada único, imediatamente abaixo do córtex 9. Aqui, eu apresento um método bio-imagem usando transgênicos Drosophila expressãosing GFP (proteína verde fluorescente) ou sua variante segmentados proteínas de interesse e uma Leica TCS SP2 confocal de laser sistema de microscópio de digitalização para estudar a função SAC em moscas, mostrando imagens de proteínas de fusão GFP de alguns dos componentes SAC, Cdc20 e Mad2 , como o exemplo.

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Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

O cinetocoro é onde o SAC inicia seu sinal de monitoramento da segregação mitótica das cromátides irmãs. Um método é descrito para visualizar o recrutamento e de rotação de uma das proteínas cinetocoro e pela sua coordenação com o movimento cromossoma em<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões usando uma Leica sistema laser confocal.

Estudar checkpoint mitótico por Ilustrando comportamento dinâmico cinetocoro Proteína e Movimento de cromossomos em Viver<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões Sincicial

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

11.3K visualizações.  University of Newcastle, United Kingdom. O cinetocoro é onde o SAC inicia seu sinal de monitoramento da segregação mitótica das cromátides irmãs. Um método é descrito para visualizar o recrutamento e de rotação de uma das proteínas cinetocoro e pela sua coordenação com o movimento cromossoma em Drosophila Embriões usando uma Leica sistema laser confocal.

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Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

Aplicação de Light-resina adesivo dental para Eletrodos de montagem ou Sondas microdiálise em Experimentos crônica

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Biologia

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

De alta resolução de Medição do Comportamento Odor-Driven em larvas de Drosophila

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Técnicas de microinjeção para estudar na Mitose Drosophila melanogaster Embrião Sincicial

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In vivo Centrifugação de Embriões Drosophila

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

RNAi Interferência por injeção dsRNA em Drosophila Os embriões

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imagem Alterar Forma Celular em Viver Drosophila Os embriões

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identificando interacção proteína-proteína em<em&gt; Drosophila</em&gt; Chefes Adulto por Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

Uma In vivo A reticulação Abordagem para isolar Complexos de proteínas a partir de Drosophila Os embriões

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

Genome-wide proteína-proteína Interaction Triagem por proteína-fragmento de Complementação Assay (PCA) em células vivas

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

Estudar mitocondrial estrutura e função em<em&gt; Drosophila</em&gt; ovários

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...