Este trabalho foi financiado pela Defense Advanced Research Projects Agency EUA contrato N66001-12-C-4039 a YS, uma bolsa da Fundação Alfred P. Sloan para RSL, e Nacional dos EUA Institutos de bolsas de Saúde HG003224 R01 e R21 CA130266 para FPRFPR foi também apoiado por uma bolsa de estudos do Instituto Canadense de Pesquisas Avançadas e pelo programa de Excelência de Pesquisa do Canadá Cadeiras.

1. Geração de ProMonsters <ol><li> Prepare a cassete de substituição universal GFP, amplificando um tetO 2-GFP marcador e o marcador URA3 a partir do plasmídeo pYOGM012 (resistência à ampicilina), utilizando iniciadores com sequências: GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCC CAAGCTCCTCGAGTAATTCG e GGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC GTACCGGGTAATAACTGATATAAT (regiões negrito proporcionar homologia com as regiões flanqueadoras do cassete KanMX4 permitindo a substituição segmentada). A reacção de PCR deve ser efectuada com a polimerase Phusion, tampão HF, e 3% de dimetilsulfóxido (New England Biolabs), a partir da concentração de DNA modelo de 0,5 ng / uL. O programa de PCR é de 98 ° C durante 30 seg e 35 ciclos de 98 ° C durante 10 seg, 49 ° C durante 30 seg e 72 ° C durante 1,5 min. O volume de reacção deve ser&gt; 50 ul de ADN suficiente para fornecer, para cada experiência de transformação. Nós purificaro produto utilizando um kit de purificação PCR QIAquick (Qiagen) com ~ 50 uL da reacção de PCR processado por coluna, mas saltando a etapa de purificação pode aumentar o rendimento de transformantes. Alternativamente, libertar um fragmento contendo a tetO 2-GFP e marcadores URA3, bem como homólogas regiões para KanMX4 direccionamento, por digestão do plasmídeo pYOGM057 (resistência à ampicilina), utilizando a enzima de restrição EcoRI (New England Biolabs). A concentração de DNA nesta reacção deve ser ~ 30 ng / ul. O volume de reacção deve ser&gt; 34 ul. Para integrar a cassete GFP em uma região diferente de KanMX4, ajuste a região de homologia de iniciadores de PCR acima para as sequências homólogas necessárias. </li><li> Transformar uma tensão a-haplóide da coleção KanMX4 levedura nocaute 12 com a cassete universal GFP exclusão. Seguindo o protocolo por ul 13 Woods e Gietz 0,34 doAmostra de ADN purificado (produto de PCR ou não purificada digestão de restrição) deverá ser utilizado para cada experiência de transformação. Placa de um quinto da mistura de transformação em uma placa CAA-Ura (base de azoto de 0,67% de levedura, 2% de glucose, 0,6% de ácido casaminico, hemi-sulfato de adenina de 0,0025%, 0,005% de triptofano, e 2% de agar). </li><li> Streak fora dos transformantes numa placa de CAA-Ura fresco para se obter colónias isoladas. </li><li> Transferir as células de uma colónia numa placa de YPDA contendo 200 ug / ml de G418 para confirmar a ausência de crescimento. Para confirmar a integração bem sucedida da GFP, seguir os passos de (1.5) - (1.9) para efectuar PCR colónia. </li><li> Adicionar células retiradas de uma colónia em 2 ul de tampão de lise (fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,4, 1 unidade de Zymolyase ZymoResearch) num tubo de PCR de 0,2 ml ou de um poço de uma placa de 96 poços. Misturar por pipetagem da solução para dentro e para fora da ponta de uma pipeta. </li><li> Overlay com uma gota (aproximadamente 20 ul) de óleo mineral utilizando um Pipetman P200 (Gilson). </li><li> Incubar a mistura a 37 °C durante 20 min e em seguida a 95 ° C durante 10 min. </li><li> Diluir o lisado com 50 ul de água. Misturar por pipetagem da solução para dentro e para fora de dez vezes. </li><li> Analise 1 ul do ligado utilizando reacções de 10 ul de PCR com (A) um iniciador para a frente, que hibridiza para a região a montante flanqueando emparelhado com um iniciador da sequência CCTGAGAAAGCAACCTGACC (285 pb a partir do início da cassete), (B) um reverso primer que hibridiza para a região a jusante emparelhada com um iniciador do GCATTGGGTCAACAGTATAG sequência (375 pb a partir da extremidade), (C) dois iniciadores que se ligam ao KanMX4 com as sequências CGTACTCCTGATGATGCATG e GACGAAATACGCGATCGCTG (181 pb), e (D) dois iniciadores que emparelham com a sequência do tipo selvagem do gene alvo (figura 4). (D) é importante porque a cerca de 8% das estirpes nas colecções de deleção são conhecidos por conterem aneuploidia 14. Um transformante correcta deve ser positiva com (A) e (B), e negativa com (C) e (D). </li><li> Para introduzir umGMToolkit no transformante, adicionar cerca de 250.000 células da estirpe transformada e 250.000 células ou de RY0146 (contendo GMToolkit-a) ou RY0148 (contendo GMToolkit-α) para um tubo Eppendorf de 1,6 ml. Vortex. Os genótipos de RY0146 e RY0148 são MATa lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 can1Δ :: GMToolkit-a [CMVpr-rtTA KanMX4 STE2pr-Sp-his5] e MATa lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 can1Δ :: GMToolkit-α [CMVpr-rtTA NatMX4 STE3pr- LEU2], respectivamente. pr denota promotor. O número de células deve ser calculado a partir da densidade óptica da cultura precedente. </li><li> Centrifugar a 800 xg durante 2 min. </li><li> Remover o sobrenadante. </li><li> Para permitir a troca de ar, fazer um furo na tampa usando um pino tratado com etanol a 70%. </li><li> Adicionar 50 ul de meio YPDA (extrato de levedura 1%, peptona a 2%, glicose a 2%, e 0,003% de adenina hemisulfate). Vortex. </li><li> Centrifugar a 800 xg durante 5 min. </li><li> Colocar o tubo em uma caixa húmido. Isto pode ser criado com uma caixa vazia ponta, uma banca de pequena ponta, e uma toalha de papel molhado. </li><li> Incubar a caixa durante a noite a 30 ° C. </li><li> Selecione diplóides acasaladas pela primeira listando as células em uma placa CAA-Ura. Incubar a placa a 30 ° C durante um dia. </li><li> Tomando as células a partir da área de volume, raia-las para se colónias isoladas em placas de YPDA (extrato de levedura 1%, peptona a 2%, glicose a 2%, 0,003%, hemi-sulfato de adenina e 2% de agar) contendo 200 ug / ml de G418 para seleccionar diplóides contendo um ou GMToolkit-100 ug / ml nourseothricin (Nat) 15 para seleccionar diplóides contendo GMToolkit-α. </li><li> Incubar a placa a 30 ° C durante 3 dias. </li><li> A partir de uma colónia isolada, transferir a maior parte das células de 500 ul de meio de agar sem GNA (extrato de levedura 1%, 3% de caldo nutriente Disco e glucose a 5%, glicose autoclave e no resto do tele componentes separadamente como duas soluções para evitar a caramelização ×) num tubo de cultura de 5 ml com a tampa solta. </li><li> Girar o tubo horizontalmente durante cinco horas a 30 ° C. O eixo de rotação tem de ser paralelo ao eixo longitudinal do tubo. </li><li> Confirmam que as colónias usadas em (1.21) são Ura + listando-os em uma placa CAA-Ura. </li><li> Centrifuga-se o tubo a 800 xg durante 2 min. Descartar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 500 ul de meio de esporulação mínima (acetato de potássio a 1%, acetato de zinco a 0,005%; filtro-esterilizar). Vortex. </li><li> Centrifuga-se o tubo a 800 xg durante 2 min. Descartar o sobrenadante. </li><li> Repita (1,25) - (1,26) duas vezes. </li><li> Adicionar 1 ml de meio de esporulação mínimo suplementado com 7,5 ug / ml de lisina, 7,5 ug / ml de leucina, histidina 5 ug / ml, 5 ug / ml de metionina, e 1,25 uracil ug / ml (para aumentar a taxa de esporulação das estirpes auxotróficas) . Vortex. </li><li> Girar o tubo à temperatura ambiente durante um dia. </li><li> Girar o tubo a 30 ° C durante 2 dias. </li><li> Centrifugar 125 ul desta mistura num tubo de Eppendorf de 1,6 ml a 800 xg durante 2 min. Descartar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 50 ul de solução de Zymolyase (100 mM de tampão de fosfato de sódio, pH 7,4, 1 M de sorbitol, e 2 unidades de Zymolyase ZymoResearch). Misturar por pipetagem da solução para dentro e para fora da ponta de uma pipeta. </li><li> Incubar a 30 ° C durante 1 h. </li><li> Adicionar 50 ul de 0,02% de NP-40. Misturar por pipetagem da solução para dentro e para fora da ponta de uma pipeta. </li><li> Deixar o tubo à temperatura ambiente durante cinco minutos. </li><li> Adicionar 500 uL de água. </li><li> Colocar o tubo em gelo. </li><li> Sonicar a mistura duas vezes com a configuração de saída de 1 (fraco ambiente) durante 15 segundos utilizando uma microtip de 3,2 mm com Sonifier 450 (Branson). Entre os dois ciclos de sonicação, colocar o tubo em gelo para voltar a temperatura a ~ 0 ° C. </li><li> Centrifugar os tubos a 800 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 200 ul de His-SC-Ura(A) ou SC-Ura-Leu médio (α), dependendo se a cruz é para incorporar um ou GMToolkit-GMToolkit-α. Para preparar os meios de comunicação, fazer SC-Ura-His-Leu suporte (base de azoto de 0,67% de levedura, 2% de glucose, 0,01% de arginina, 0,01% de ácido aspártico, ácido glutâmico 0,01%, 0,01% de isoleucina, 0,01% de lisina, 0,01% de metionina , 0,01%, fenilalanina, serina 0,08%, 0,04% de treonina, tirosina 0,002%, 0,03%, valina, adenina 0,0025%, 0,005% de triptofano, adenina 0,003% e 0,005% de triptofano) e completá-la com histidina leucina ou estéril antes da sua utilização para o concentração final de 0,01%. </li><li> Fazer um furo na tampa usando um pino tratado com etanol a 70%. </li><li> Girar o tubo horizontalmente a 30 ° C durante 2 dias. O eixo de rotação tem de ser paralelo ao eixo longitudinal do tubo. </li><li> Streak as células em uma placa de agar SC-Ura-His ou SC-Ura-Leu (os mesmos ingredientes como acima, mais de 2% de agar, ácido aspártico e treonina deve ser adicionado depois de umutoclaving; adicionar histidina ou leucina antes de derramar) para fazer colônias isoladas para as amostras ProMonster. </li></ol> 2. Ciclismo sexual <ol><li> Rodar uma cultura de uma estirpe de deleção estabelecido GFP em 100 ul de SC-His (a) ou SC-Leu (α) dependendo do tipo de acasalamento, a 30 ° C durante a noite utilizando um tubo de 1,6 ml de Eppendorf. Para a troca de ar, fazer um buraco com um alfinete tratado com etanol a 70%. Gire o tubo horizontalmente. O eixo de rotação tem de ser paralelo ao eixo longitudinal do tubo. É possível cruzar várias cepas através de acasalamento en masse. Quando uma amostra é classificada directamente utilizado para este fim, a cultura das células em 200 uL a 30 ° C durante 2 dias. Para preparar o meio, adiciona-uracilo (concentração final: 0,0025%) e histidina (0,01%) ou a leucina (0,01%) para SC-Ura-His-Leu médio. </li><li> Misture a-haplóides 250.000 células e 250.000 células α-haplóides de estirpes de deleção GFP em um Eppe 1,6 mltubo ndorf. Vortex. </li><li> Una destas células por passos seguintes (1,11) - (1,17). </li><li> Transferem-se 10 ul da mistura de acoplamento a 500 ul de meio de GNA contendo 200 ug / ml de G418 e 100 ng / ml Nat num tubo de cultura de 5 ml com uma tampa solta. O OD 600 é mais ou menos a partir de 0,1. </li><li> Girar a cultura a 30 ° C durante 24 h. Isto permite a selecção de diplóides diplóides porque apenas contém tanto KanMX4 em GMToolkit-a e NatMX4 em GMToolkit-α pode crescer na presença de G418 e Nat (Figura 3). </li><li> Transferir 20 uL da cultura de um dia para 500 ul de GNA fresco contendo G418 e Nat. O OD 600 é aproximadamente de partida de 0,2. </li><li> Girar o tubo a 30 ° C durante 5 horas para levar as células à fase log (OD 600 de ~ 1). </li><li> Siga os passos (1,24) - (1,38) para esporular os diplóides e isolar esporos. </li><li> Dividir a suspensão de células em duas esporulados de 300 ulpeças e colocar cada um em uma separada tubo Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Centrifugar os tubos a 800 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante. </li><li> Para a pastilha de um tubo, adicionar 100 uL de meio SC-His para seleccionar uma haplóides-. Para o pellet do outro tubo, adicionar 100 uL de meio SC-Leu para seleccionar α-haplóides. </li><li> Rodar os tubos a 30 ° C durante a noite. O OD 600 final, deve ser inferior a 0,5. Se OD 600 tende a ser demasiado alto, tente de cultura à temperatura ambiente. </li><li> Para induzir a GFP, adicionar 100 ul de fresco SC-His (a) ou SC-Leu médio (α) contendo 20 ug / ml de doxiciclina. A concentração final de doxiciclina é de 10 ug / ml. Vortex. </li><li> Rodar os tubos a 30 ° C durante 2 dias. </li></ol> 3. Citometria de Fluxo <ol><li> Adicionar 900 uL de pré-filtrada tampão TE (pH 7,5) contendo 10 ug de doxiciclina / ml para um tubo de polipropileno de 5 ml (BD Falcon # 352063) com o tampão trocado com uma célula-filtro tampa de um tubo de poliestireno de 5 ml (BD Falcon # 352235). Tubos de polipropileno são adequados para a citometria de fluxo. A tampa do filtro é desejado para a remoção de partículas grandes. </li><li> Delicadamente, coloque 75 ul de tampão TE com doxiciclina sobre a tampa do filtro de células. </li><li> Adicionam-se 25 ul das células induzidas para a solução na tampa. </li><li> Enquanto pressiona a ponta do Pipetman contra a malha, dispara a totalidade da solução combinada através do filtro. </li><li> Pressione para baixo a tampa do filtro e vórtice do tubo. </li><li> Preparar os tubos de recolha (tubos de Eppendorf de 1,6 ml) contendo 200 ul de SC-His-Leu ou SC. </li><li> Comece o seleccionador de células e ajustar as configurações de acordo com o manual do fabricante. </li><li> Vortex tanto o tubo de recolha (para o revestimento da parede com o meio) e o tubo contendo as células antes de a colocar sobre o separador de células. </li><li> Aquisição de dados de citometria de fluxo da amostra. A estirpe não contendo GFP pode ser um controlo negativo. </li><li> Desenhe portas para a classificação. (A)Para evitar agregados celulares, o que poderia exibem intensidade GFP alta, descarte de outliers com largura de pulso desproporcionalmente grande para dispersão frontal (FSC), utilizando uma curva de largura de pulso e altura de pulso para MoFlo classificador ou desproporcionalmente pequena altura FSC usando um lote de altura FSC e FSC área para FACSAria classificador (Figura 5, painel superior esquerdo). (B) Uma vez que o FSC grande (área) é esperado para agregados de células, apenas retirar células na parte inferior a 20% no FSC, evitando regiões com o menor dispersão FSC e lateral (SSC) valores onde os detritos celulares são frequentemente encontrados (Figura 5, superior direito do painel). (C) SSC (área) e GFP sinal (área) muitas vezes são positivamente correlacionados. Porque simplesmente tomando as células brilhantes dadas as portas acima também enriquecer por células com um valor alto do CCD, desenhe uma porta ao longo da periferia da população, utilizando uma curva de intensidade de GFP e SSC a ter uma percentagem semelhante dos mais brilhantes as células a partir de cada ponto do eixo SSC (Figura 5, bottom-esquerdo diagrama). A população seleccionada em (C) deverá ser 0,1-1% da população seleccionada em (B). </li><li> Classificar 200 células no tubo de coleta de dados os critérios de (3.10). Para um processo de massa en ou para outros projetos que requerem uma população mais complexo, classificar mais células quando necessário. </li><li> Vortex do tubo de recolha para cobrir as células seleccionadas com meio. </li><li> Placa um subconjunto de células (por exemplo, a 50 células) em uma placa de YPDA para genotipagem. </li><li> Incubar a placa a 30 ° C durante 2 dias. </li><li> Fazer um lisado para ~ 12 colónias, seguindo os passos de (1.5) - (1.8). </li><li> Transferir as células residuais na ponta utilizada em (1.5) para um ponto sobre uma placa de YPDA contendo G418 e Nat por tocar suavemente a placa com a ponta. Haplóides selecionados não deve crescer nesta placa. Diplóides podem ter mais cópias GFP e pode, portanto, ser mais brilhante. Este teste pode mostrar a eficiência da seleção haplóide. </li><li> Para genotipagem, analisam 1 ul do ligado utilizando um 10-ul de PCR reaction com um iniciador directo que hibridiza para a região a montante de flanco de cada gene suprimido emparelhado com um iniciador da CCTGAGAAAGCAACCTGACC sequência. As reacções de PCR multiplex, se possível (condições podem ser determinadas usando lisados ​​de mutantes simples). A PCR pode ser feito de um 96 - ou formato de 384 poços. Este último formato é adequado para o volume de reacção de tão pouco como 5 ul. Arraying de PCR master mixes diferindo em primers e adição de lisados ​​celulares para estas misturas podem ser levadas a cabo utilizando uma pipeta multi-canal ou um robot de manuseamento de líquidos. Dica mudanças são opcionais ao adicionar o lisado mesmo para diferentes misturas de PCR. </li><li> Analisar os produtos de PCR. O Gel XL Ultra sistema V-2 de electroforese (Labnet) é compatível com a carga de amostra usando pipetas multicanal. </li><li> Com base em informações a partir de (3.16) e (3.18), identificar prováveis ​​haplóides que desejadas genótipos. </li><li> Estabelecer essas cepas em um prato fresco (YPDA, CAA-Ura, ou SC-Ura-His/Leu). Além disso, congelá-los em25% de glicerol a -80 ° C. Testes adicionais, tais como confirmação da ausência de sequências de tipo selvagem para os genes suprimidos e de campo pulsado de electroforese em gel são recomendados. </li><li> Repita ciclismo sexual a partir de (2.1) com cepas úteis. </li></ol>

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Não há conflitos de interesse declarados.

Como se desenvolveu a abordagem monstro verde, estávamos preocupados com a possibilidade de recombinação entre cassetes de substituição diferentes GFP, levando ao rearranjo do genoma. Mitigação contra esta possibilidade é a nossa seleção para as células que resistiram várias rodadas de acasalamento e meiose. Células portadoras de genomas rearranjados se espera que sejam menos aptos após o acasalamento para células sem um rearranjo idênticos. Na verdade, não observamos qualquer instabilidade do genoma re...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente ou instrumento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1720 </td><td> Dissolver em água e esterilizar por filtração (0,2-nm). Concentração de Stock: 200 mg / ml. Armazenar a 4 ° C. </td></tr><tr><td> ClonNAT (nourseothricin) </td><td> WERNER Bioagentes </td><td> 5001000 </td><td> Dissolver em água e esterilizar por filtração (0,2-nm). Concentração de Stock: 100 mg / ml. Armazenar a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Doxiciclina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9891 </td><td> Dissolve-se em etanol a 50% e filtrar-esterilizar (0,2-nm). Concentração de Stock: 10 mg / ml. Fazer fresco a cada quatro semanas. Escudo de luz, utilizando uma folha de alumínio e armazenar a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Zymolyase </td><td> ZymoResearch </td><td> E1005 </td><td></td></tr><tr><td> Base de azoto de levedura Disco com / sem aminoácidos </td><td> BD </td><td> 291940 </td><td></td></tr><tr><td> (Rotator para tubos) Revolver </td><td> Labnet </td><td> H5600 </td><td></td></tr><tr><td> Enduro Gel eletroforese XL </td><td> Labnet </td><td> E0160 </td><td></td></tr><tr><td> Sonifier 450 </td><td> Branson </td><td> 101-063-198 </td><td></td></tr><tr><td> Microtip para Sonifier 450 </td><td> Branson </td><td> 101-148-062 </td><td></td></tr><tr><td> FACSAria seleccionador de células </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MoFlo seleccionador de células </td><td> Beckman-Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX ou equivalente robô </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td> Opcional. Para a criação de PCRs de genotipagem. </td></tr></tbody> &lt;/ Table&gt;

the green monster process for the generation of yeast strains carrying multiple gene deletions

Fenótipos de uma deleção do gene são frequentemente revela apenas quando a mutação é testado em um fundo genético particular ou 1,2 condição ambiental. Há exemplos em que muitos genes precisam ser apagados para desmascarar funções de genes ocultos 3,4. Apesar do potencial de descobertas importantes, interações genéticas envolvendo três ou mais genes são largamente inexplorado. Buscas exaustivas de multi-mutantes interações seria inviável devido ao grande número de combinações possíveis de exclusões. No entanto, os estudos de conjuntos de genes seleccionados, tais como conjuntos de parálogos com maior probabilidade a priori de uma partilha uma função comum, seria informativo. Na levedura Saccharomyces cerevisiae, knockout do gene é realizada por substituição de um gene com um marcador seleccionável através de recombinação homóloga. Devido ao número de marcadores é limitada, foram desenvolvidos métodos para a remoção e reutilização do sam<html> e marcador 5,6,7,8,9,10. No entanto, as mutações de engenharia sequencialmente múltiplas usando esses métodos é demorado porque o tempo necessário escalas linearmente com o número de deleções a ser gerado. Aqui descrevemos o método monstro verde para rotineiramente a engenharia de exclusões múltiplas na levedura 11. Neste método, a proteína verde fluorescente repórter (GFP) integrado deleções é usado para estirpes quantitativamente etiquetas de acordo com o número de deleções contidos em cada estirpe (Figura 1). Ciclos repetidos de sortimento de GFP-marcados através de deleções de acasalamento de levedura e meiose acoplado com fluxo de citometria de enriquecimento de estirpes que transportem mais dessas supressões levar à acumulação de deleções em estirpes (Figura 2). Realizando vários processos em paralelo, com cada processo de incorporação de um ou mais deleções por rodada, reduz o tempo necessário para a construção da estirpe. conteúdo &quot;&gt; O primeiro passo consiste em preparar um único mutantes haplóides denominado« ProMonsters &#39;, cada um dos quais transporta um repórter GFP em um locus suprimido e um dos &quot;kit de ferramentas&quot; loci-ou-GMToolkit um monstro verde ou GMToolkit-α no . can1Δ locus (Figura 3) usando as estirpes de levedura a supressão recolha 12, GFP marcadas deleções pode ser convenientemente gerado pela substituição da cassete KanMX4 comum existente nessas estirpes com uma GFP universal - URA3 Cada fragmento GMToolkit contém:. quer a um - ou α-acasalamento tipo específico de marca de selecção haplóide 1 e exatamente um dos dois marcadores que, quando ambos estão presentes GMToolkits, coletivamente permitem a selecção de diplóides. O segundo passo é fazer o ciclo sexual por meio do qual loci deleção podem ser combinados dentro de uma única célula, a distribuição aleatória e / ou recomb meióticaminação que acompanha cada ciclo de acasalamento e esporulação.

Quando uma tensão a-haplóide com quatro eliminações GFP-marcados (ycl033cΔ yer042wΔ ykl069wΔ yol118cΔ) foi cruzado com uma tensão α-haplóide com quatro eliminações (ycl033cΔ ydl242wΔ ydl227cΔ yer042wΔ), com duas eliminações (ycl033cΔ yer042wΔ) compartilhado por duas estirpes, um representante resultado foi obtido. A mistura de acasalamento foi cultivada em meio contendo YPDA G418 e Nat para selecionar diplóides. Os diplóides resultantes foram cultivadas ...

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The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

O método permite que o monstro verde montagem rápida de exclusões múltiplas marcados com um gene que codifica a proteína verde fluorescente repórter. Este método baseia-se em estirpes de levedura de condução através de ciclos repetidos de sortimento sexual de deleções e fluorescência baseada enriquecimento de células que transportem mais deleções.

O Processo de monstro verde para a Geração de linhagens de levedura de transporte deleções de genes múltiplos

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

the-green-monster-process-for-generation-yeast-strains-carrying

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K visualizações.  J. Craig Venter Institute. O método permite que o monstro verde montagem rápida de exclusões múltiplas marcados com um gene que codifica a proteína verde fluorescente repórter. Este método baseia-se em estirpes de levedura de condução através de ciclos repetidos de sortimento sexual de deleções e fluorescência baseada enriquecimento de células que transportem mais deleções.

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A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

Uma técnica rápida para a visualização de células vivas de levedura Imobilizado

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Biologia

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

Única molécula-Imaging dos Transportes Nuclear

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Do genoma deleções de genes em<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de Alto Rendimento

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Brotando Yeast extração e purificação de proteínas para o estudo da função, interações e modificações pós-traducionais

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the plasma membrane and the Golgi. As a result the endosomal system plays a central role in maintaining cell homeostasis, and mutations in genes belonging to this network of organelles interconnected by vesicular transport, cause severe pathologies including cancer and neurobiological disorders. It is therefore of prime relevance to understand the mechanisms underlying the biogenesis and organization of the endosomal system. The yeast Saccharomyces cerevisiae has been pivotal in this task. To specifically label and analyze at the ultrastructural level the endosomal system of this model organism, we present here a detailed protocol for the positively charged nanogold uptake by spheroplasts followed by the visualization of these particles through a silver enhancement reaction. This method is also a valuable tool for the morphological examination of mutants with defects in endosomal trafficking. Moreover, it is not only applicable for ultrastructural examinations but it can also be combined with immunogold labelings for protein localization investigations.

Yeast, Saccharomyces cerevisiae, has been a key model organism to identify and study genes regulating the biogenesis and functions of the endosomal system. Here we present a detailed protocol for the specific labeling of the endosomal compartments for ultrastructural studies.

Nanogold Labeling do Sistema de levedura Endossomal de Análises ultraestruturais

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and &#945;-synuclein, implicated in Parkinson&#8217;s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and &#945;-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.

Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

Isolando potencializado Hsp104 variantes usando levedura Proteinopathy Models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

Geração de Genomic Eliminações em linhas celulares de mamíferos através CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Aplicações de pHluorin para Quantitative, Kinetic e de alta capacidade: Análise de endocitose em brotamento Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...