O financiamento para a esse trabalho, e como citado 2,10, foi fornecido, em parte, por uma premiação de pesquisa para concessão MF Salvatore da Federação Americana para Pesquisas sobre o Envelhecimento, Edward P. A Stiles Trust Fund e da Fundação de Pesquisa Biomédica da Northwest Louisiana, e BS Pruett da Sociedade Muslow Ike predoctoral, LSU Health Sciences Center-Shreveport.

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	<li>Trevitt, J. T., Carlson, B. B., Nowend, K., Salamone, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substantia+nigra+pars+reticulate+is+a+highly+potent+site+of+action+for+the+behavioral+effects+of+the+D1+antagonist+SCH23390+in+rat.">Substantia nigra pars reticulate is a highly potent site of action for the behavioral effects of the D1 antagonist SCH23390 in rat.</a> Psychopharmacology. 156, 32-41 (2001).</li><li>Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Spann, S. L., Dempsey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+reveals+a+role+for+nigral+tyrosine+hydroxylase+ser31+phosphorylation+in+locomotor+activity+generation.">Aging reveals a role for nigral tyrosine hydroxylase ser31 phosphorylation in locomotor activity generation.</a> PLoS ONE. 4, e8466 (2009).</li><li>Rossato, J. L., Bevilaqua, L. R. M., Izquierdo, I., Medina, J. H., Cammarota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+controls+persistence+of+long-term+memory+storage.">Dopamine controls persistence of long-term memory storage.</a> Science. 325, 1017-1020 (2009).</li><li>Keller, C. M., Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Guerdin, G. F., Goeders, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+dopamine+regulation+in+mesoaccumbens+pathway+in+response+to+non-contigent+binge+and+escalating+methamphetamine+regimens+in+the+Wistar+rat.">Biphasic dopamine regulation in mesoaccumbens pathway in response to non-contigent binge and escalating methamphetamine regimens in the Wistar rat.</a> Psychopharmacology. 215, 513-526 (2011).</li><li>Lu, L., Dempsey, J., Liu, S. Y., Bossert, J. M., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+infusion+of+brain-derived+neurotrophic+factor+into+the+ventral+tegmental+area+induces+long-lasting+potentiation+of+cocaine+seeking+after+withdrawal.">A single infusion of brain-derived neurotrophic factor into the ventral tegmental area induces long-lasting potentiation of cocaine seeking after withdrawal.</a> J. Neurosci. 24, 1604-1611 (2004).</li><li>Hoffer, B. J., Hoffman, A., Bowenkamp, K., Huettl, P., Hudson, J., Martin, D., Lin, L. F., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+reverses+toxin-induced+injury+to+midbrain+dopaminergic+neurons+in+vivo.">Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo.</a> Neurosci. Lett. 182, 107-111 (1994).</li><li>Salvatore, M. F., Zhang, J. L., Large, D. M., Wilson, P. E., Gash, C. R., Thomas, T. C., Haycock, J. W., Bing, G., Stanford, J. A., Gash, D. M., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+GDNF+administration+increases+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+in+the+rat+striatum+and+substantia+nigra.">Striatal GDNF administration increases tyrosine hydroxylase phosphorylation in the rat striatum and substantia nigra.</a> J. Neurochem. 90, 245-254 (2004).</li><li>Lu, L., Wang, X., Wu, P., Xu, C., Zhao, M., Morales, M., Harvey, B. K., Hoffer, B. J., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+ventral+tegmental+area+glial+cell-line+derived+neurotrophic+factor+in+incubation+of+cocaine+craving.">Role of ventral tegmental area glial cell-line derived neurotrophic factor in incubation of cocaine craving.</a> Biol. Psychiatry. 66, 137-145 (2009).</li><li>Lavicky, J., Dunn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticotropin-releasing+factor+stimulates+catecholamine+release+in+hypothalamus+and+prefrontal+cortex+in+freely+moving+rats+as+assessed+by+microdialysis.">Corticotropin-releasing factor stimulates catecholamine release in hypothalamus and prefrontal cortex in freely moving rats as assessed by microdialysis.</a> J. Neurochem. 60, 602-612 (1993).</li><li>Salvatore, M. F., Pruett, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichotomy+of+tyrosine+hydroxylase+and+dopamine+regulation+between+somatodendritic+and+terminal+field+areas+of+nigrostriatal+and+mesoaccumbens+pathways.">Dichotomy of tyrosine hydroxylase and dopamine regulation between somatodendritic and terminal field areas of nigrostriatal and mesoaccumbens pathways.</a> PLoS ONE. 7, e29867 (2012).</li><li>Salvatore, M. F., Garcia-Espana, A., Goldstein, M., Deutch, A. Y., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+in+the+nigrostriatal+and+mesolimbic+systems+in+vivo:+Effects+of+acute+haloperidol+and+related+compounds.">Stoichiometry of tyrosine hydroxylase phosphorylation in the nigrostriatal and mesolimbic systems in vivo: Effects of acute haloperidol and related compounds.</a> J. Neurochem. 75, 225-232 (2000).</li><li>Salvatore, M. F., Waymire, J. C., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depolarization-stimulated+catecholamine+biosynthesis:+involvement+of+protein+kinases+and+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+sites+in+situ.">Depolarization-stimulated catecholamine biosynthesis: involvement of protein kinases and tyrosine hydroxylase phosphorylation sites in situ.</a> J. Neurochem. 79, 349-360 (2001).</li><li>Haycock, J. W., Lew, J. Y., Garcia-Espana, A., Lee, K. Y., Harada, K., Meller, E., Goldstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+serine-19+phosphorylation+in+regulating+tyrosine+hydroxylase+studied+with+site-+and+phosphospecific+antibodies+and+site-directed+mutagenesis.">Role of serine-19 phosphorylation in regulating tyrosine hydroxylase studied with site- and phosphospecific antibodies and site-directed mutagenesis.</a> J. Neurochem. 71, 1670-1675 (1998).</li><li>Lindgren, N., Xu, Z. Q., Linskog, M., Herrera-Marschitz, M., Goiny, M., Haycock, J. W., Goldstein, M., Hokfelt, T., Fisone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+tyrosine+hydroxylase+activity+and+phosphorylation+at+ser19+and+ser40+via+activation+of+glutamate+NMDA+receptors+in+rat+striatum.">Regulation of tyrosine hydroxylase activity and phosphorylation at ser19 and ser40 via activation of glutamate NMDA receptors in rat striatum.</a> J. Neurochem. 74, 2470-2477 (2000).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Conforme descrito na Figura 1, os métodos descritos acima devem produzir leituras múltiplas de dopamina e da sua regulação TH proteínas, DAT e VMAT2 a partir de uma amostra de SN ou VTA obtido a partir de qualquer um rato ou ratinho. Novamente, os benefícios de levar a cabo este protocolo são que o investigador pode obter leituras operacionalmente-combinados de como a dopamina é regulada in vivo sob virtualmente qualquer paradigma experimental e, ao fazê-lo, salvo significativas meios experimentais, re...

HPLC sistema: O sistema de base é constituído por uma bomba Shimadzu HPLC LC10-ADvp, um Waters WISP 717 automático amostra injector, um 250 x 4,4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 coluna de fase inversa C18 (Waters), uma Bioanalytical Systems (BAS) TL12 vítreo dupla eletrodo de carbono, dois detectores de BAS LC4B eletroquímicos, e um Empower Waters 2 de coleta de dados e integração de sistemas. A coluna é mantida a 30-45 ° C (BAS aquecedor de coluna LC22A). A fase móvel é fosfato de sódio 0,1 M (pH 3,0), EDTA 0,1 mM, 0,2-0,4 mM 1-octano sulfónico (Eastman-Kodak), e acetonitrilo 0,35% (v / v), filtrada através de um filtro de 0,45 micron. Taxa de fluxo é de 1,2 ml / min. Quatro lotes litro de fase móvel são optimizados para separações por ajuste do pH, ácido sulfónico octano e temperatura da coluna. A fase móvel é reciclado, e é continuamente purgado com gás hélio para remover o oxigénio dissolvido. A reciclagem da fase móvelé quase essencial para manter uma boa resolução por um período de tempo razoável. A fase móvel vida de prateleira é mantida por meio de um interruptor de fluxo (controlado pelo integrador) para desviar a perder a 2-7 min antes de cada ensaio. Os eléctrodos são mantidas em potenciais de cerca de 0,78 e 0.95V com respeito a um eléctrodo de referência Ag/AgC1. O eléctrodo na maior potencial é utilizada exclusivamente para a determinação do triptofano (eo NMDA padrão interno). O potencial 0,78 V fornece um sinal superior à relação de ruído para a detecção das monoaminas e compostos, com excepção do triptofano. Os cromatogramas são armazenados no disco rígido da estação de trabalho Empower, e, posteriormente, processado e os dados transferidos diretamente para uma planilha Excel para o cálculo das quantidades de metabolitos e compilação de dados do grupo. Bomba: Shimadzu LC-10AD Cell: BAS Cross Flow. Carbono vítreo eletrodo de trabalho em 0,780 e 0,950 potencial V. Detector: BAS LC-4B operado em modo dual channel. Dados Acq. Sistema: Águas Empower Pro 2. Injector: Waters WISP 717 Coluna: Waters Spherosorb ODS-1, 5 mM de partícula, 4,4 mm x 250 mm. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Dodecil sulfato de sódio (SDS) </td><td> - JT Baker </td><td> 4095-02 </td></tr><tr><td> Trizma Base de Dados </td><td> Sigma </td><td> T1503-1KG </td></tr><tr><td> Trizma HCl </td><td> Sigma </td><td> T3253-1KG </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Sigma </td><td> G8773-500 mL </td></tr><tr><td> PVP-40 </td><td> Sigma </td><td> PVP40-1KG </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 21600-069 </td></tr><tr><td> Tween20 </td><td> Sigma </td><td> P1379-500 mL </td></tr><tr><td> Glycine </td><td> Sigma </td><td> G8898-1KG</td></tr><tr><td> Ponceau S </td><td> Fluka </td><td> 81460 </td></tr><tr><td> Azul de Bromofenol </td><td> Sigma </td><td> B8026-5G </td></tr><tr><td> Ditiotreitol </td><td> Sigma </td><td> D-9163 </td></tr><tr><td> Proteína padrão 2 mg de BSA </td><td> Sigma </td><td> P5619-25VL </td></tr><tr><td> Pierce BCA Protein Assay Reagent Um </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 23223 </td></tr><tr><td> Precision Plus padrão de proteína </td><td> Bio Rad </td><td> 161-0373 </td></tr><tr><td> [125I] Uma proteína, atividade específica </td><td> Perkin-Elmer </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 2. Reagentes específicos. <table border="1"><tbody><tr><td> Reagentes </td><td> Fórmulas </td></tr><tr><td> 10% de SDS </td><td> 10 g de SDS, 100 mL DI H 2 0 </td></tr><tr><td> SDS a 1% (pH para 8,2) </td><td><ol><li> 10 mL10% de SDS </li><li> 60,5 mg de Trizma base </li><li> 37,22 mg de EDTA </li><li> 90 mL DI H 2 0 </li></ol></td></tr><tr><td> Cobre solução de sulfato II </td><td><ol><li> 1 g de cobre sulfato II </li><li> 25 mL DI H 2 0 </li></ol></td></tr><tr><td> Tampão de amostra 3X </td><td><ol><li> Trizma base de dados de 2,27 g </li><li> SDS 6 g </li><li> Ditiotreitol 0,463 g </li><li> Glicerol 30 g </li><li> Azul de Bromofenol 10 mg </li><li> DIH 2 0 (inicialmente adicionar acima reagentes a 40 mL de H 2 0 em um cilindro graduado, em seguida, adicionar H 2 0 até que o volume atinge 100 mL) </li><li> HCl (adicionar, conforme necessário para alcançar o pH de 6,85) </li><li> Congelar solução em 50 tubos de 2,0 mL. </li></ol> (Faz 100 mL): Volume de tampão de amostra necessário 3X = ½ volume de SDS utilizados na amostra. </td></tr><tr><td> 1X tampão de amostra </td><td> Diluir Tampão de amostra 3X para baixo para 1X tampão de amostra usando DI H 2 0 </td></tr><tr><td> 10X<html> Tampão de corrida (faz 4 L) </td><td><ol><li> Trizma Base de Dados de 121,1 g </li><li> Glycine 577 g </li><li> SDS 40 g </li></ol></td></tr><tr><td> Tampão de Transferência 10X: (Faz 4 L) </td><td><ol><li> Glicina 360 g </li><li> Trizma base de dados de 96 g </li></ol></td></tr><tr><td> Encarnado vivo </td><td><ol><li> Ponceau S. 0,5 g </li><li> Ácido Acético 5 mL </li><li> DI H 2 0 95 mL </li></ol></td></tr><tr><td> 0,2% solução de HCl </td><td> 5,2 ml de HCl em 500mL de DI H 2 0 </td></tr><tr><td> PVP-T20 de bloqueio Soln. (Faz 4 L) </td><td><ol><li> PVP-40 40 g </li><li> DPBS 38,2 g </li><li> Tween20 2 g </li><li> Thimerisol 0,4 g </li><li> 1M Tris pH 7,6 (60,6 g Tris HCl + 13,9 g Base de Dados de Tris em 500 mL DI H 2 0) - 50 mL </li></ol></td></tr><tr><td> Tampão 10X Blot (faz 4 L) </td><td><ol><li> Tween 20 20 g </li><li> Tris Base de Dados de 14 g </li><li> Tris-HCl 61 g </li></ol></td></tr></tbody></table>ONTEÚDO &quot;Protein Assay&gt; Tabela 3. e ocidentais Fórmulas Blotting. Padrões tirosina hidroxilase: Os padrões de proteína TH calibrados e fosforilação utilizados por este laboratório são derivados de extratos de células PC12, que foram analisadas para teor de proteína TH e estequiometrias fosforilação contra um TH padrões previamente calibrados que em última análise, oriundos do laboratório do Dr. John Haycock 11 .

comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area

A dopamina é um neurotransmissor vigorosamente estudada no SNC. Na verdade, o seu envolvimento na atividade locomotora e recompensa comportamentos relacionados promoveu cinco décadas de investigação sobre as deficiências moleculares associados com a regulação da dopamina. A maioria destas investigações de regulação de dopamina no cérebro o foco sobre a base molecular para a sua regulação em regiões terminais de campo das vias nigrostiatais e mesoaccumbens; estriado e nucleus accumbens. Além disso, esses estudos têm-se concentrado na análise do teor de tecido da dopamina, com normalização ao peso do tecido apenas molhado. Investigação das proteínas que regulam a dopamina, tais como tirosina hidroxilase (TH), proteína de fosforilação TH, do transportador de dopamina (DAT) e transportador monoamina vesicular 2 (VMAT2) proteína muitas vezes não incluem a análise do teor de dopamina no tecido da mesma amostra. A capacidade de analisar tanto o conteúdo do tecido da dopamina e suas proteínas de regulação (incluindo pós-tramodificações nslational) não só dá o poder inerente ao interpretar a relação da dopamina com o nível da proteína ea função de TH, DAT, ou VMAT2, mas também se estende economia amostra. Isso se traduz em menor custo, e ainda produz insights sobre a regulação molecular da dopamina em praticamente qualquer paradigma de escolha dos investigadores. Nós nos concentramos nas análises no mesencéfalo. Embora o SN e VTA são normalmente negligenciados na maioria dos estudos de regulação da dopamina, esses núcleos são facilmente dissecados com a prática. Uma leitura abrangente do conteúdo tecido dopamina e TH, DAT, ou VMAT2 pode ser realizado. Não é florescente literatura sobre o impacto da função dopaminérgica no SN e VTA sobre o comportamento, e as imposições de substâncias exógenas ou processos doença nisso 1-5. Além disso, os compostos, tais como factores de crescimento têm um efeito profundo sobre as proteínas da dopamina e da dopamina-regulador, a uma extensão comparativamente maior no SN ou VTA <sup&gt; 6-8. Portanto, esta metodologia é apresentada como referência para laboratórios que desejam estender suas investigações sobre como tratamentos específicos modular o comportamento e regulação da dopamina. Aqui, um método multi-passo é apresentado para as análises de teor de tecido de dopamina, os níveis proteicos de TH, DAT ou VMAT2 e fosforilação TH da substantia nigra e VTA do mesencéfalo de roedores. A análise da fosforilação TH pode produzir insights significativos em não só como actividade TH é regulada, mas também as cascatas de sinalização afectadas nos núcleos somatodendritic num dado paradigma. Iremos ilustrar a técnica de dissecação para segregar estes núcleos duas eo processamento da amostra de tecido dissecado que produz um perfil revelando mecanismos moleculares de regulação da dopamina in vivo, específicas para cada núcleos (Figura 1).

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Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

A dopamina é distintamente regulada nos núcleos mesencéfalo, que contêm a célula corpos e dendrites de os neurónios de dopamina. Descrevemos aqui uma abordagem dissecção e manipulação da amostra para maximizar os resultados, e, assim, conclusões e compreensão, na regulação da dopamina nos núcleos mesencéfalo da substantia nigra (SN) e área tegmental ventral (VTA) em roedores.

Profiling abrangente do Regulamento dopamina em substância negra e área tegmental ventral

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

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Neuroscience

25.6K visualizações.  Louisiana State University Health Sciences Center. A dopamina é distintamente regulada nos núcleos mesencéfalo, que contêm a célula corpos e dendrites de os neurónios de dopamina. Descrevemos aqui uma abordagem dissecção e manipulação da amostra para maximizar os resultados, e, assim, conclusões e compreensão, na regulação da dopamina nos núcleos mesencéfalo da substantia nigra (SN) e área tegmental ventral (VTA) em roedores.