Die Finanzierung des dieser Arbeit, und zitiert als 2,10 wurde zur Verfügung gestellt, zum Teil durch ein Forschungsstipendium ausgezeichnet zu MF Salvatore von der American Federation for Aging Research, The Edward P. Stiles Trust Fund und des Biomedical Research Foundation Nordwesten von Louisiana, und nach BS Pruett von der Ike Muslow Promotionsstipendium, LSU Health Sciences Center-Shreveport.

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	<li>Trevitt, J. T., Carlson, B. B., Nowend, K., Salamone, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substantia+nigra+pars+reticulate+is+a+highly+potent+site+of+action+for+the+behavioral+effects+of+the+D1+antagonist+SCH23390+in+rat.">Substantia nigra pars reticulate is a highly potent site of action for the behavioral effects of the D1 antagonist SCH23390 in rat.</a> Psychopharmacology. 156, 32-41 (2001).</li><li>Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Spann, S. L., Dempsey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+reveals+a+role+for+nigral+tyrosine+hydroxylase+ser31+phosphorylation+in+locomotor+activity+generation.">Aging reveals a role for nigral tyrosine hydroxylase ser31 phosphorylation in locomotor activity generation.</a> PLoS ONE. 4, e8466 (2009).</li><li>Rossato, J. L., Bevilaqua, L. R. M., Izquierdo, I., Medina, J. H., Cammarota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+controls+persistence+of+long-term+memory+storage.">Dopamine controls persistence of long-term memory storage.</a> Science. 325, 1017-1020 (2009).</li><li>Keller, C. M., Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Guerdin, G. F., Goeders, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+dopamine+regulation+in+mesoaccumbens+pathway+in+response+to+non-contigent+binge+and+escalating+methamphetamine+regimens+in+the+Wistar+rat.">Biphasic dopamine regulation in mesoaccumbens pathway in response to non-contigent binge and escalating methamphetamine regimens in the Wistar rat.</a> Psychopharmacology. 215, 513-526 (2011).</li><li>Lu, L., Dempsey, J., Liu, S. Y., Bossert, J. M., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+infusion+of+brain-derived+neurotrophic+factor+into+the+ventral+tegmental+area+induces+long-lasting+potentiation+of+cocaine+seeking+after+withdrawal.">A single infusion of brain-derived neurotrophic factor into the ventral tegmental area induces long-lasting potentiation of cocaine seeking after withdrawal.</a> J. Neurosci. 24, 1604-1611 (2004).</li><li>Hoffer, B. J., Hoffman, A., Bowenkamp, K., Huettl, P., Hudson, J., Martin, D., Lin, L. F., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+reverses+toxin-induced+injury+to+midbrain+dopaminergic+neurons+in+vivo.">Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo.</a> Neurosci. Lett. 182, 107-111 (1994).</li><li>Salvatore, M. F., Zhang, J. L., Large, D. M., Wilson, P. E., Gash, C. R., Thomas, T. C., Haycock, J. W., Bing, G., Stanford, J. A., Gash, D. M., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+GDNF+administration+increases+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+in+the+rat+striatum+and+substantia+nigra.">Striatal GDNF administration increases tyrosine hydroxylase phosphorylation in the rat striatum and substantia nigra.</a> J. Neurochem. 90, 245-254 (2004).</li><li>Lu, L., Wang, X., Wu, P., Xu, C., Zhao, M., Morales, M., Harvey, B. K., Hoffer, B. J., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+ventral+tegmental+area+glial+cell-line+derived+neurotrophic+factor+in+incubation+of+cocaine+craving.">Role of ventral tegmental area glial cell-line derived neurotrophic factor in incubation of cocaine craving.</a> Biol. Psychiatry. 66, 137-145 (2009).</li><li>Lavicky, J., Dunn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticotropin-releasing+factor+stimulates+catecholamine+release+in+hypothalamus+and+prefrontal+cortex+in+freely+moving+rats+as+assessed+by+microdialysis.">Corticotropin-releasing factor stimulates catecholamine release in hypothalamus and prefrontal cortex in freely moving rats as assessed by microdialysis.</a> J. Neurochem. 60, 602-612 (1993).</li><li>Salvatore, M. F., Pruett, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichotomy+of+tyrosine+hydroxylase+and+dopamine+regulation+between+somatodendritic+and+terminal+field+areas+of+nigrostriatal+and+mesoaccumbens+pathways.">Dichotomy of tyrosine hydroxylase and dopamine regulation between somatodendritic and terminal field areas of nigrostriatal and mesoaccumbens pathways.</a> PLoS ONE. 7, e29867 (2012).</li><li>Salvatore, M. F., Garcia-Espana, A., Goldstein, M., Deutch, A. Y., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+in+the+nigrostriatal+and+mesolimbic+systems+in+vivo:+Effects+of+acute+haloperidol+and+related+compounds.">Stoichiometry of tyrosine hydroxylase phosphorylation in the nigrostriatal and mesolimbic systems in vivo: Effects of acute haloperidol and related compounds.</a> J. Neurochem. 75, 225-232 (2000).</li><li>Salvatore, M. F., Waymire, J. C., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depolarization-stimulated+catecholamine+biosynthesis:+involvement+of+protein+kinases+and+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+sites+in+situ.">Depolarization-stimulated catecholamine biosynthesis: involvement of protein kinases and tyrosine hydroxylase phosphorylation sites in situ.</a> J. Neurochem. 79, 349-360 (2001).</li><li>Haycock, J. W., Lew, J. Y., Garcia-Espana, A., Lee, K. Y., Harada, K., Meller, E., Goldstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+serine-19+phosphorylation+in+regulating+tyrosine+hydroxylase+studied+with+site-+and+phosphospecific+antibodies+and+site-directed+mutagenesis.">Role of serine-19 phosphorylation in regulating tyrosine hydroxylase studied with site- and phosphospecific antibodies and site-directed mutagenesis.</a> J. Neurochem. 71, 1670-1675 (1998).</li><li>Lindgren, N., Xu, Z. Q., Linskog, M., Herrera-Marschitz, M., Goiny, M., Haycock, J. W., Goldstein, M., Hokfelt, T., Fisone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+tyrosine+hydroxylase+activity+and+phosphorylation+at+ser19+and+ser40+via+activation+of+glutamate+NMDA+receptors+in+rat+striatum.">Regulation of tyrosine hydroxylase activity and phosphorylation at ser19 and ser40 via activation of glutamate NMDA receptors in rat striatum.</a> J. Neurochem. 74, 2470-2477 (2000).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wie in Abbildung 1 dargestellt, sollten die oben genannten Methoden liefern mehrfache Auslesen von Dopamin und dessen regulierende Proteine ​​TH, DAT, und VMAT2 aus einer Probe von SN oder VTA entweder aus der Ratte oder der Maus gewonnen. Auch hier sind die Vorteile der Durchführung dieses Protokoll, dass der Prüfer kann operativ abgestimmt, wie die Messwerte von Dopamin in vivo unter nahezu allen experimentellen Paradigma geregelt und dabei sparen erhebliche experimentellen Ressourcen durch Reduzierung ...

HPLC-System: Das Basissystem besteht aus einem Shimadzu LC10-ADVP HPLC-Pumpe, einem Waters WISP 717 automatischen Probengeber, eine 250 x 4,4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 Reverse-Phase-Säule (Waters), einem Bioanalytical Systems (BAS) TL12 Dual glasigen Kohlenstoff-Elektrode, zwei BAS LC4B elektrochemische Detektoren und einem Waters Empower 2 Datenerhebung und-Integration-System. Die Kolonne wird bei 30-45 ° C gehalten (BAS LC22A Säulenheizung). Die mobile Phase ist 0,1 M Natriumphosphat (pH 3,0), 0,1 mM EDTA, 0,2-0,4 mM 1-Octansulfonsäure (Eastman-Kodak) und 0,35% Acetonitril (v / v), durch einen 0,45 Mikrometer-Filter filtriert. Durchfluss ist von 1,2 ml / min. Vier-Liter-Chargen der mobilen Phase zur Separation durch Einstellen des pH, Octansulfonsäure und Säulentemperatur optimiert. Die mobile Phase zurückgeführt wird, und wird kontinuierlich mit Heliumgas gespült, um gelösten Sauerstoff zu entfernen. Das Recycling der mobilen Phaseist fast unerlässlich für eine gute Auflösung für einen angemessenen Zeitraum aufrechtzuerhalten. Die mobile Phase Haltbarkeit wird unter Verwendung eines Strömungsschalters (gesteuert durch den Integrator) umgeleitet werden, um den ersten 2-7 min jedes Laufs Abfälle gehalten. Die Elektroden sind bei Potentialen von etwa 0,78 und 0,95 V in Bezug auf eine Referenzelektrode Ag/AgC1 gehalten. Die Elektrode an der höheren Potentialseite ist ausschließlich für die Bestimmung von Tryptophan (und der NMDA-interner Standard) verwendet. Der 0,78-V-Potential bietet eine überlegene Signal-Rausch-Verhältnis für den Nachweis der Monoamine und Verbindungen, andere als Tryptophan. Die Chromatogramme werden auf der Festplatte des Empower-Workstation gespeichert und anschließend bearbeitet und die Daten direkt in eine Excel-Tabelle zur Berechnung der Metabolit Mengen und Zusammenstellung der Gruppe Daten übertragen. Pumpe: Shimadzu LC-10AD Cell: BAS Cross Flow. Glassy-Carbon-Arbeitselektrode bei 0,780 und 0,950 V Potential. Detektor: BAS LC-4B betrieben im Dual Channel Modus. DATA ACQ. System: Waters Empower Pro 2. Injektor: Waters WISP 717 Säule: Waters Spherosorb ODS-1, 5 um Partikel, 4,4 mm x 250 mm. <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfat (SDS) </td><td> - JT Baker </td><td> 4095-02 </td></tr><tr><td> Trizma Base </td><td> Sigma </td><td> T1503-1KG </td></tr><tr><td> Trizma HCl </td><td> Sigma </td><td> T3253-1KG </td></tr><tr><td> Glycerin </td><td> Sigma </td><td> G8773-500 ml </td></tr><tr><td> PVP-40 </td><td> Sigma </td><td> PVP40-1KG </td></tr><tr><td> dPBS </td><td> Gibco </td><td> 21600-069 </td></tr><tr><td> Tween20 </td><td> Sigma </td><td> P1379-500 ml </td></tr><tr><td> Glycine </td><td> Sigma </td><td> G8898-1KG</td></tr><tr><td> Ponceau S </td><td> Fluka </td><td> 81460 </td></tr><tr><td> Bromphenolblau </td><td> Sigma </td><td> B8026-5G </td></tr><tr><td> Dithiothreitol </td><td> Sigma </td><td> D-9163 </td></tr><tr><td> Protein Standard 2 mg BSA </td><td> Sigma </td><td> P5619-25VL </td></tr><tr><td> Pierce BCA Protein Assay Reagent A </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 23223 </td></tr><tr><td> Precision Plus Protein Standard </td><td> Bio Rad </td><td> 161-0373 </td></tr><tr><td> [125I]-Protein A, spezifische Aktivität </td><td> Perkin-Elmer </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Spezifische Reagenzien. <table border="1"><tbody><tr><td> Reagenzien </td><td> Formeln </td></tr><tr><td> 10% SDS </td><td> 10 g SDS, 100 ml DI H 2 0 </td></tr><tr><td> 1% SDS (pH 8,2) </td><td><ol><li> 10 ml10% SDS </li><li> 60,5 mg Trizma Base </li><li> 37,22 mg EDTA </li><li> 90 ml DI H 2 0 </li></ol></td></tr><tr><td> Kupfer-II-Sulfat-Lösung </td><td><ol><li> 1 g Kupfer-II-Sulfat </li><li> 25 ml DI H 2 0 </li></ol></td></tr><tr><td> 3X Sample Buffer </td><td><ol><li> Trizma Base 2,27 g </li><li> SDS 6 g </li><li> Dithiothreitol 0,463 g </li><li> Glycerin 30 g </li><li> Bromphenolblau 10 mg </li><li> DIH 2 0 (anfänglich über Reagenzien hinzufügen, um 40 ml H 2 0 in einem Messzylinder; fügen Sie dann H 2 0 bis Volumen erreicht 100 ml) </li><li> HCl (je nach Bedarf hinzufügen, um pH-Wert von 6,85 zu erreichen) </li><li> Freeze-Lösung in 50 2,0 ml Röhrchen. </li></ol> (Macht 100 ml): Volumen von 3X Sample Buffer benötigt = ½ Volumen des SDS in Probe verwendet. </td></tr><tr><td> 1x Probenpuffer </td><td> Verdünnen Sie 3X Sample Buffer nach unten auf den 1x Probenpuffer mit DI H 2 0 </td></tr><tr><td> 10X<html> Laufpuffer (Ergibt 4 L) </td><td><ol><li> Trizma Base 121,1 g </li><li> Glycine 577 g </li><li> SDS 40 g </li></ol></td></tr><tr><td> 10X Transfer-Puffer: (Ergibt 4 L) </td><td><ol><li> Glycine 360 ​​g </li><li> Trizma Base 96 g </li></ol></td></tr><tr><td> Ponceau </td><td><ol><li> Ponceau S 0,5 g </li><li> Essigsäure 5 ml </li><li> DI H 2 0 95 mL </li></ol></td></tr><tr><td> 0,2% HCl-Lösung </td><td> 5,2 ml HCl in 500 ml DI H 2 0 </td></tr><tr><td> PVP-T20 Blocking-Lsg. (Ergibt 4 L) </td><td><ol><li> PVP-40 40 g </li><li> dPBS 38,2 g </li><li> Tween20 2 g </li><li> Thimerisol 0,4 g </li><li> 1 M Tris pH 7,6 (60,6 g Tris HCl + 13,9 g Tris-Base in 500 ml DI H 2 0) - 50 ml </li></ol></td></tr><tr><td> 10X-Blot-Puffer (Ergibt 4 L) </td><td><ol><li> Tween 20 20 g </li><li> Tris Base 14 g </li><li> Tris HCl 61 g </li></ol></td></tr></tbody></table>NHALT &quot;&gt; Tabelle 3. Protein Assay und Western Blot Formeln. Tyrosinhydroxylase Standards: Die kalibrierten TH-Protein-Phosphorylierung und Standards, die von diesem Labor verwendet werden, von PC12-Zellextrakten, die für TH Proteingehalt und Phosphorylierung Stöchiometrien gegen eines zuvor kalibrierten TH-Standards, die letztlich ihren Ursprung aus dem Labor von Dr. John Haycock 11 analysiert wurden abgeleitet .

comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area

Dopamin ist ein kräftig studierte Neurotransmitter im ZNS. In der Tat hat sein Engagement in der Bewegungsaktivität und Lohn-bezogenen Verhalten fünf Jahrzehnten zur Untersuchung der molekularen Mängel, die Dopamin-Regelung verbundenen gefördert. Die meisten dieser Anfragen von Dopamin im Gehirn Verordnung Fokus auf die molekulare Grundlage für die Regulierung in den Terminal-Bereich Regionen der nigrostriatalen und mesoaccumbens Wege; Striatum und Nucleus accumbens. Darüber hinaus haben solche Studien auf der Analyse der Dopamin-Gehalt Gewebe mit einer Normalisierung auf nur feuchten Tuch Gewicht konzentriert. Die Untersuchung der Proteine, die Dopamin regulieren, wie zB Tyrosin-Hydroxylase (TH) Protein, TH-Phosphorylierung, Dopamin-Transporter (DAT), und vesikulären Monoamin-Transporter 2 (VMAT2) Protein oft nicht, eine Analyse der Dopamin-Gehalt im Gewebe der gleichen Probe. Die Fähigkeit, sowohl Dopamin Gewebe Inhalte und deren regulierende Proteine ​​(einschließlich Post-tra analysierennslational Modifikationen) gibt nicht nur innewohnende Kraft der Interpretation der Beziehung von Dopamin mit der Protein-Ebene und die Funktion der TH, DAT oder VMAT2, sondern erstreckt sich auch Probe Wirtschaft. Dies schlägt sich in geringeren Kosten, und doch produziert Einblicke in die molekulare Regulation von Dopamin in praktisch jedem Paradigma der Ermittler Wahl. Wir fokussieren die Analysen im Mittelhirn. Obwohl die SN und VTA in der Regel in den meisten Studien der Dopamin-Regulierung vernachlässigt werden, werden diese Kerne leicht mit etwas Übung seziert. Eine umfassende Auslesen von Dopamin Gewebe Inhalt und TH-, DAT oder VMAT2 durchgeführt werden kann. Es wird aufkeimende Literatur über die Auswirkungen der Dopamin-Funktion in der SN und VTA auf das Verhalten und die Beeinträchtigungen von körperfremden Substanzen oder Krankheitsprozesse darin 1-5. Darüber hinaus haben Verbindungen, wie zB Wachstumsfaktoren eine tiefgreifende Wirkung auf Dopamin-und Dopamin-regulierende Proteine, zu einer vergleichsweise größeren Ausmaß in der SN oder VTA <sup&gt; 6-8. Daher wird diese Methode für die Referenz auf Labors, die auf ihre Anfragen auf, wie bestimmte Behandlungen Verhalten modulieren und Dopamin-Regulierung erweitern möchten vorgestellt. Hier wird ein mehrstufiges Verfahren für die Analyse von Gewebe Dopamin-Gehalt, die Proteinexpression von TH, DAT oder VMAT2 und TH-Phosphorylierung aus der Substantia nigra und VTA von Nagetier Mittelhirn vorgestellt. Die Analyse der TH-Phosphorylierung kann wichtige Erkenntnisse über nicht nur, wie TH-Aktivität reguliert wird, sondern auch der Signalkaskaden im somatodendritischen Kerne in einem bestimmten Paradigma beeinflusst zu ergeben. Wir zeigen die Dissektion Technik, um diese zwei Kerne und die Probe Verarbeitung von präparierten Gewebe, das ein Profil enthüllen molekulare Mechanismen der Dopamin-Regulation in vivo, spezifisch für jede Kerne (Abbildung 1) erzeugt zu trennen.

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Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

Dopamin wird deutlich im Mittelhirn Kerne, die den Zellkörper und Dendriten der Dopamin-Neuronen enthalten geregelt. Hier beschreiben wir eine Dissektion und Probe-Handling-Ansatz, um Ergebnisse zu maximieren, und damit Schlussfolgerungen und Erkenntnisse, auf die Dopamin-Regulierung im Mittelhirn Kerne der Substantia nigra (SN) und ventralen Tegmentum (VTA) bei Nagern.

Umfassende Profilierung der Verordnung Dopamin in der Substantia nigra und ventralen Tegmentum

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

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Neuroscience

25.6K Aufrufe.  Louisiana State University Health Sciences Center. Dopamin wird deutlich im Mittelhirn Kerne, die den Zellkörper und Dendriten der Dopamin-Neuronen enthalten geregelt. Hier beschreiben wir eine Dissektion und Probe-Handling-Ansatz, um Ergebnisse zu maximieren, und damit Schlussfolgerungen und Erkenntnisse, auf die Dopamin-Regulierung im Mittelhirn Kerne der Substantia nigra (SN) und ventralen Tegmentum (VTA) bei Nagern.