Finanziamenti per il questo lavoro, e come citato 2,10, è stato fornito, in parte, da un premi per la ricerca di sovvenzioni a MF Salvatore dalla Federazione americana per la ricerca sull&#39;invecchiamento, The Edward P. Stiles Trust Fund e Biomedical Research Foundation di Northwest Louisiana, e BS Pruett dalla Compagnia Ike Muslow Predoctoral, LSU Health Sciences Center-Shreveport.

<ol>
	<li>Trevitt, J. T., Carlson, B. B., Nowend, K., Salamone, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substantia+nigra+pars+reticulate+is+a+highly+potent+site+of+action+for+the+behavioral+effects+of+the+D1+antagonist+SCH23390+in+rat.">Substantia nigra pars reticulate is a highly potent site of action for the behavioral effects of the D1 antagonist SCH23390 in rat.</a> Psychopharmacology. 156, 32-41 (2001).</li><li>Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Spann, S. L., Dempsey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+reveals+a+role+for+nigral+tyrosine+hydroxylase+ser31+phosphorylation+in+locomotor+activity+generation.">Aging reveals a role for nigral tyrosine hydroxylase ser31 phosphorylation in locomotor activity generation.</a> PLoS ONE. 4, e8466 (2009).</li><li>Rossato, J. L., Bevilaqua, L. R. M., Izquierdo, I., Medina, J. H., Cammarota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+controls+persistence+of+long-term+memory+storage.">Dopamine controls persistence of long-term memory storage.</a> Science. 325, 1017-1020 (2009).</li><li>Keller, C. M., Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Guerdin, G. F., Goeders, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+dopamine+regulation+in+mesoaccumbens+pathway+in+response+to+non-contigent+binge+and+escalating+methamphetamine+regimens+in+the+Wistar+rat.">Biphasic dopamine regulation in mesoaccumbens pathway in response to non-contigent binge and escalating methamphetamine regimens in the Wistar rat.</a> Psychopharmacology. 215, 513-526 (2011).</li><li>Lu, L., Dempsey, J., Liu, S. Y., Bossert, J. M., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+infusion+of+brain-derived+neurotrophic+factor+into+the+ventral+tegmental+area+induces+long-lasting+potentiation+of+cocaine+seeking+after+withdrawal.">A single infusion of brain-derived neurotrophic factor into the ventral tegmental area induces long-lasting potentiation of cocaine seeking after withdrawal.</a> J. Neurosci. 24, 1604-1611 (2004).</li><li>Hoffer, B. J., Hoffman, A., Bowenkamp, K., Huettl, P., Hudson, J., Martin, D., Lin, L. F., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+reverses+toxin-induced+injury+to+midbrain+dopaminergic+neurons+in+vivo.">Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo.</a> Neurosci. Lett. 182, 107-111 (1994).</li><li>Salvatore, M. F., Zhang, J. L., Large, D. M., Wilson, P. E., Gash, C. R., Thomas, T. C., Haycock, J. W., Bing, G., Stanford, J. A., Gash, D. M., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+GDNF+administration+increases+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+in+the+rat+striatum+and+substantia+nigra.">Striatal GDNF administration increases tyrosine hydroxylase phosphorylation in the rat striatum and substantia nigra.</a> J. Neurochem. 90, 245-254 (2004).</li><li>Lu, L., Wang, X., Wu, P., Xu, C., Zhao, M., Morales, M., Harvey, B. K., Hoffer, B. J., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+ventral+tegmental+area+glial+cell-line+derived+neurotrophic+factor+in+incubation+of+cocaine+craving.">Role of ventral tegmental area glial cell-line derived neurotrophic factor in incubation of cocaine craving.</a> Biol. Psychiatry. 66, 137-145 (2009).</li><li>Lavicky, J., Dunn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticotropin-releasing+factor+stimulates+catecholamine+release+in+hypothalamus+and+prefrontal+cortex+in+freely+moving+rats+as+assessed+by+microdialysis.">Corticotropin-releasing factor stimulates catecholamine release in hypothalamus and prefrontal cortex in freely moving rats as assessed by microdialysis.</a> J. Neurochem. 60, 602-612 (1993).</li><li>Salvatore, M. F., Pruett, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichotomy+of+tyrosine+hydroxylase+and+dopamine+regulation+between+somatodendritic+and+terminal+field+areas+of+nigrostriatal+and+mesoaccumbens+pathways.">Dichotomy of tyrosine hydroxylase and dopamine regulation between somatodendritic and terminal field areas of nigrostriatal and mesoaccumbens pathways.</a> PLoS ONE. 7, e29867 (2012).</li><li>Salvatore, M. F., Garcia-Espana, A., Goldstein, M., Deutch, A. Y., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+in+the+nigrostriatal+and+mesolimbic+systems+in+vivo:+Effects+of+acute+haloperidol+and+related+compounds.">Stoichiometry of tyrosine hydroxylase phosphorylation in the nigrostriatal and mesolimbic systems in vivo: Effects of acute haloperidol and related compounds.</a> J. Neurochem. 75, 225-232 (2000).</li><li>Salvatore, M. F., Waymire, J. C., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depolarization-stimulated+catecholamine+biosynthesis:+involvement+of+protein+kinases+and+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+sites+in+situ.">Depolarization-stimulated catecholamine biosynthesis: involvement of protein kinases and tyrosine hydroxylase phosphorylation sites in situ.</a> J. Neurochem. 79, 349-360 (2001).</li><li>Haycock, J. W., Lew, J. Y., Garcia-Espana, A., Lee, K. Y., Harada, K., Meller, E., Goldstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+serine-19+phosphorylation+in+regulating+tyrosine+hydroxylase+studied+with+site-+and+phosphospecific+antibodies+and+site-directed+mutagenesis.">Role of serine-19 phosphorylation in regulating tyrosine hydroxylase studied with site- and phosphospecific antibodies and site-directed mutagenesis.</a> J. Neurochem. 71, 1670-1675 (1998).</li><li>Lindgren, N., Xu, Z. Q., Linskog, M., Herrera-Marschitz, M., Goiny, M., Haycock, J. W., Goldstein, M., Hokfelt, T., Fisone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+tyrosine+hydroxylase+activity+and+phosphorylation+at+ser19+and+ser40+via+activation+of+glutamate+NMDA+receptors+in+rat+striatum.">Regulation of tyrosine hydroxylase activity and phosphorylation at ser19 and ser40 via activation of glutamate NMDA receptors in rat striatum.</a> J. Neurochem. 74, 2470-2477 (2000).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Come illustrato nella figura 1, i metodi descritti sopra dovrebbe produrre letture multiple di dopamina e della sua TH proteine ​​che regolano, DAT, e VMAT2 da un campione di SN o VTA ottenuti dal ratto o topo. Anche in questo caso, i benefici di realizzare questo protocollo è che il ricercatore può ottenere letture operativamente trovati di come dopamina è regolata in vivo in virtualmente qualsiasi paradigma sperimentale e, così facendo, risparmiare notevoli risorse sperimentali riducendo il numero di ...

HPLC sistema: Il sistema base è costituito da un LC10-ADvp pompa HPLC Shimadzu, uno Waters WISP 717 campione iniettore automatico, da 250 x 4,4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 colonna a fase inversa (Waters), alcuni sistemi bioanalitici (BAS) TL12 dual vetroso elettrodo di carbone, due BAS LC4B rivelatori elettrochimici, e un Waters Empower 2 raccolta dei dati e system integration. La colonna viene mantenuta a 30-45 ° C (BAS riscaldatore colonna LC22A). La fase mobile è di 0,1 M fosfato di sodio (pH 3,0), 0,1 mM EDTA, 0.2-0.4 mm Octane 1-solfonico (Eastman Kodak-), e 0,35% acetonitrile (v / v), filtrata attraverso un filtro da 0,45 micron. La portata è di 1,2 ml / min. Quattro lotti litro di fase mobile sono ottimizzati per separazioni regolando il pH, Octane acido solfonico e temperatura della colonna. La fase mobile viene riciclato, e viene continuamente spurgato con gas elio per eliminare l&#39;ossigeno disciolto. Riciclaggio della fase mobileè quasi essenziale per mantenere una buona risoluzione per un periodo di tempo ragionevole. La fase mobile shelf-life è mantenuta mediante un interruttore di flusso (controllata dal integratore) per deviare a sprecare il 2-7 min prima di ogni esecuzione. Gli elettrodi sono mantenuti a potenziali di circa 0,78 e 0.95V rispetto ad un elettrodo di riferimento Ag/AgC1. L&#39;elettrodo a potenziale elevato viene utilizzato esclusivamente per la determinazione del triptofano (NMDA e lo standard interno). Il potenziale V 0,78 fornisce un segnale superiore di rumore per il rilevamento delle monoammine e composti, diversi triptofano. I cromatogrammi vengono memorizzati sul disco rigido del Empower workstation, e successivamente trattati e trasferiti i dati direttamente in un foglio di calcolo Excel per il calcolo degli importi metabolita e la compilazione dei dati del gruppo. Pompa: Shimadzu LC-10AD Cell: BAS Cross Flow. Carbonio vetroso elettrodo di lavoro a 0,780 e 0,9Potenziale V 50. Detector: BAS LC-4B funzionare in modalità dual channel. Dati Acq. Sistema: Waters Empower Pro 2. Injector: Waters WISP 717 Colonna: Waters Spherosorb ODS-1, 5 particella mM, 4.4 mm X 250 mm. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Di sodio dodecil solfato (SDS) </td><td> - JT Baker </td><td> 4095-02 </td></tr><tr><td> Trizma Base </td><td> Sigma </td><td> T1503-1KG </td></tr><tr><td> Trizma HCl </td><td> Sigma </td><td> T3253-1KG </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Sigma </td><td> G8773-500 mL </td></tr><tr><td> PVP-40 </td><td> Sigma </td><td> PVP40-1KG </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 21600-069 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P1379-500 mL </td></tr><tr><td> Glycine </td><td> Sigma </td><td> G8898-1KG</td></tr><tr><td> Ponceau S </td><td> Fluka </td><td> 81460 </td></tr><tr><td> Blu di bromofenolo </td><td> Sigma </td><td> B8026-5G </td></tr><tr><td> Ditiotreitolo </td><td> Sigma </td><td> D-9163 </td></tr><tr><td> Protein Standard 2 mg di BSA </td><td> Sigma </td><td> P5619-25VL </td></tr><tr><td> Pierce BCA Protein Assay Reagente A </td><td> Thermo Fisher Scientific- </td><td> 23223 </td></tr><tr><td> Più di precisione standard Protein </td><td> Bio Rad </td><td> 161-0373 </td></tr><tr><td> [125I]-proteina A, specifica attività </td><td> Perkin-Elmer </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 2. Reagenti specifici. <table border="1"><tbody><tr><td> Reagenti </td><td> Formule </td></tr><tr><td> 10% SDS </td><td> 10 g SDS, 100 ml di H 2 0 </td></tr><tr><td> 1% SDS (a pH 8,2) </td><td><ol><li> 10 mL10% SDS </li><li> 60,5 mg Trizma Base </li><li> 37,22 mg EDTA </li><li> 90 ml di H 2 0 </li></ol></td></tr><tr><td> Solfato di rame Solution II </td><td><ol><li> 1 g di solfato di rame II </li><li> 25 ml di H 2 0 </li></ol></td></tr><tr><td> Sample Buffer 3X </td><td><ol><li> Trizma Base 2,27 g </li><li> SDS 6 g </li><li> Ditiotreitolo 0,463 g </li><li> 30 g di glicerina </li><li> Blu di bromofenolo 10 mg </li><li> DIH 2 0 (inizialmente aggiungere sopra i reagenti a 40 mL di H 2 0 in un cilindro graduato; quindi aggiungere H 2 0 fino a volume raggiunge 100 mL) </li><li> HCl (aggiungere quanto necessario per raggiungere pH 6,85) </li><li> Congelare la soluzione in 50 tubi di 2.0 ml. </li></ol> (Fa 100 mL): Volume di tampone campione 3X necessario ½ = volume di SDS nel campione utilizzato. </td></tr><tr><td> 1X Sample Buffer </td><td> Diluire il tampone 3X campione fino a 1X tampone del campione utilizzando DI H 2 0 </td></tr><tr><td> 10X<html> Il tampone di corsa (Fa 4 L) </td><td><ol><li> Trizma Base 121,1 g </li><li> Glycine 577 g </li><li> SDS 40 g </li></ol></td></tr><tr><td> Buffer 10X Transfer: (Per 4 L) </td><td><ol><li> Glycine 360 ​​g </li><li> Trizma base 96 g </li></ol></td></tr><tr><td> Ponceau </td><td><ol><li> Ponceau S. 0,5 g </li><li> Acido acetico 5 mL </li><li> DI H 2 0 95 ml </li></ol></td></tr><tr><td> 0,2% soluzione di HCl </td><td> 5,2 ml di HCl in 500mL di DI H 2 0 </td></tr><tr><td> PVP-T20 blocco Soln. (Fa 4 L) </td><td><ol><li> PVP-40 40 g </li><li> DPBS 38,2 g </li><li> Tween 20 2 g </li><li> Thimerisol 0,4 g </li><li> 1M Tris pH 7,6 (60,6 g Tris HCl + 13,9 g di Tris base in 500 ml di H 2 0) - 50 mL </li></ol></td></tr><tr><td> Buffer 10X Blot (Fa 4 L) </td><td><ol><li> Tween 20 20 g </li><li> Tris base 14 g </li><li> Tris HCl 61 g </li></ol></td></tr></tbody></table>ONTENUTO &quot;&gt; Tabella 3. test delle proteine ​​e Western blotting formule. Standard Tirosina idrossilasi: I TH calibrati gli standard e la fosforilazione delle proteine ​​utilizzate da questo laboratorio sono derivati ​​da estratti di cellule PC12, che sono stati analizzati per il contenuto di proteine ​​e TH stechiometrie fosforilazione contro uno standard di TH precedentemente tarato, che in ultima analisi, originati dal laboratorio del Dr. John Haycock 11 .

comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area

Dopamina è un neurotrasmettitore vigorosamente studiato nel SNC. Infatti, il suo coinvolgimento in attività locomotoria e la ricompensa comportamento correlato ha favorito cinque decenni di inchiesta sulle carenze molecolari associati con regolazione della dopamina. La maggior parte di queste indagini di regolazione della dopamina nel cervello, la messa a fuoco sulla base molecolare per la sua regolamentazione nel campo delle regioni terminali dei percorsi nigrostriatali e mesoaccumbens, striato e nel nucleo accumbens. Inoltre, tali studi si sono concentrati sull&#39;analisi del tenore di tessuto dopamina con normalizzazione a un solo peso del tessuto bagnato. Indagine delle proteine ​​che regolano la dopamina, come la tirosina idrossilasi (TH) di proteine, fosforilazione TH, trasportatore della dopamina (DAT), e vescicolari trasportatore monoamine 2 (VMAT2) proteina spesso non includono l&#39;analisi del tenore di tessuto dopamina nello stesso campione. La capacità di analizzare sia il contenuto della dopamina dei tessuti e delle sue proteine ​​di regolazione (compresa la post-tramodifiche nslational) non solo dà potere intrinseco di interpretare il rapporto della dopamina con il livello di proteine ​​e la funzione dei TH, DAT, o VMAT2, ma si estende anche all&#39;economia del campione. Ciò si traduce in un costo minore, e tuttavia produce approfondimenti nel regolamento molecolare di dopamina in qualsiasi paradigma di scelta degli investigatori. Ci concentriamo le analisi nel mesencefalo. Anche se il SN e VTA sono in genere trascurati nella maggior parte degli studi di regolazione della dopamina, questi nuclei sono facilmente sezionato con la pratica. Una lettura completa di tenore di tessuto dopamina e TH, DAT, o VMAT2 può essere condotto. Vi è fiorente letteratura sull&#39;impatto della funzione della dopamina nel SN e VTA sul comportamento, e le impingements di sostanze esogene o di processi di malattia ivi 1-5. Inoltre, i composti come fattori di crescita hanno un effetto profondo sulla proteine ​​dopamina e dopamina-regolazione, in misura relativamente maggiore nella SN o VTA <sup&gt; 6-8. Pertanto, questo metodo viene presentato come riferimento per i laboratori che vogliono estendere le loro indagini su come trattamenti specifici modulano il comportamento e la regolazione della dopamina. Qui, un multi-step metodo viene presentato per le analisi del tenore di tessuto dopamina, i livelli proteici di TH, DAT o VMAT2 e fosforilazione TH dalla substantia nigra e VTA dal mesencefalo roditori. L&#39;analisi della fosforilazione TH può dare spunti significativi in ​​non solo come l&#39;attività TH è regolata, ma anche le cascate di segnalazione colpiti nei nuclei somatodendritic in un paradigma dato. Si illustrerà la tecnica di dissezione per separare questi due nuclei e il trattamento del campione di tessuto sezionato che produce un profilo rivelando meccanismi molecolari di regolazione dopamina in vivo, specifici per ogni nuclei (Figura 1).

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area at JoVE.com

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

La dopamina è distintamente regolata nel mesencefalo nuclei, che contengono la cella corpi e dendriti dei neuroni dopaminergici. Qui si descrive un approccio di dissezione e di manipolazione dei campioni per massimizzare i risultati e, quindi, le conclusioni e le intuizioni, sulla regolamentazione dopamina nel mesencefalo nuclei della substantia nigra (SN) e la zona ventrale tegmentale (VTA) in roditori.

Profiling completa del regolamento dopamina nel substantia nigra e ventrale tegmentale Area

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

comprehensive-profiling-dopamine-regulation-substantia-nigra-ventral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

25.6K Views.  Louisiana State University Health Sciences Center. La dopamina è distintamente regolata nel mesencefalo nuclei, che contengono la cella corpi e dendriti dei neuroni dopaminergici. Qui si descrive un approccio di dissezione e di manipolazione dei campioni per massimizzare i risultati e, quindi, le conclusioni e le intuizioni, sulla regolamentazione dopamina nel mesencefalo nuclei della substantia nigra (SN) e la zona ventrale tegmentale (VTA) in roditori.