この作品、として2,10を挙げて 、のための資金は、老化研究、エドワード·P.スタイルズ信託基金とノースウエストルイジアナ州の医学研究財団のためのアメリカ連合からMFサルバトーレの研究助成賞を受賞することによって、部分的には、提供されていましたとBSプルエットにアイクMuslow博士号を取得する前のフェローシップ、LSUの健康科学センターシュリーブポートから。

<ol>
	<li>Trevitt, J. T., Carlson, B. B., Nowend, K., Salamone, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substantia+nigra+pars+reticulate+is+a+highly+potent+site+of+action+for+the+behavioral+effects+of+the+D1+antagonist+SCH23390+in+rat.">Substantia nigra pars reticulate is a highly potent site of action for the behavioral effects of the D1 antagonist SCH23390 in rat.</a> Psychopharmacology. 156, 32-41 (2001).</li><li>Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Spann, S. L., Dempsey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+reveals+a+role+for+nigral+tyrosine+hydroxylase+ser31+phosphorylation+in+locomotor+activity+generation.">Aging reveals a role for nigral tyrosine hydroxylase ser31 phosphorylation in locomotor activity generation.</a> PLoS ONE. 4, e8466 (2009).</li><li>Rossato, J. L., Bevilaqua, L. R. M., Izquierdo, I., Medina, J. H., Cammarota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+controls+persistence+of+long-term+memory+storage.">Dopamine controls persistence of long-term memory storage.</a> Science. 325, 1017-1020 (2009).</li><li>Keller, C. M., Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Guerdin, G. F., Goeders, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+dopamine+regulation+in+mesoaccumbens+pathway+in+response+to+non-contigent+binge+and+escalating+methamphetamine+regimens+in+the+Wistar+rat.">Biphasic dopamine regulation in mesoaccumbens pathway in response to non-contigent binge and escalating methamphetamine regimens in the Wistar rat.</a> Psychopharmacology. 215, 513-526 (2011).</li><li>Lu, L., Dempsey, J., Liu, S. Y., Bossert, J. M., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+infusion+of+brain-derived+neurotrophic+factor+into+the+ventral+tegmental+area+induces+long-lasting+potentiation+of+cocaine+seeking+after+withdrawal.">A single infusion of brain-derived neurotrophic factor into the ventral tegmental area induces long-lasting potentiation of cocaine seeking after withdrawal.</a> J. Neurosci. 24, 1604-1611 (2004).</li><li>Hoffer, B. J., Hoffman, A., Bowenkamp, K., Huettl, P., Hudson, J., Martin, D., Lin, L. F., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+reverses+toxin-induced+injury+to+midbrain+dopaminergic+neurons+in+vivo.">Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo.</a> Neurosci. Lett. 182, 107-111 (1994).</li><li>Salvatore, M. F., Zhang, J. L., Large, D. M., Wilson, P. E., Gash, C. R., Thomas, T. C., Haycock, J. W., Bing, G., Stanford, J. A., Gash, D. M., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+GDNF+administration+increases+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+in+the+rat+striatum+and+substantia+nigra.">Striatal GDNF administration increases tyrosine hydroxylase phosphorylation in the rat striatum and substantia nigra.</a> J. Neurochem. 90, 245-254 (2004).</li><li>Lu, L., Wang, X., Wu, P., Xu, C., Zhao, M., Morales, M., Harvey, B. K., Hoffer, B. J., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+ventral+tegmental+area+glial+cell-line+derived+neurotrophic+factor+in+incubation+of+cocaine+craving.">Role of ventral tegmental area glial cell-line derived neurotrophic factor in incubation of cocaine craving.</a> Biol. Psychiatry. 66, 137-145 (2009).</li><li>Lavicky, J., Dunn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticotropin-releasing+factor+stimulates+catecholamine+release+in+hypothalamus+and+prefrontal+cortex+in+freely+moving+rats+as+assessed+by+microdialysis.">Corticotropin-releasing factor stimulates catecholamine release in hypothalamus and prefrontal cortex in freely moving rats as assessed by microdialysis.</a> J. Neurochem. 60, 602-612 (1993).</li><li>Salvatore, M. F., Pruett, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichotomy+of+tyrosine+hydroxylase+and+dopamine+regulation+between+somatodendritic+and+terminal+field+areas+of+nigrostriatal+and+mesoaccumbens+pathways.">Dichotomy of tyrosine hydroxylase and dopamine regulation between somatodendritic and terminal field areas of nigrostriatal and mesoaccumbens pathways.</a> PLoS ONE. 7, e29867 (2012).</li><li>Salvatore, M. F., Garcia-Espana, A., Goldstein, M., Deutch, A. Y., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+in+the+nigrostriatal+and+mesolimbic+systems+in+vivo:+Effects+of+acute+haloperidol+and+related+compounds.">Stoichiometry of tyrosine hydroxylase phosphorylation in the nigrostriatal and mesolimbic systems in vivo: Effects of acute haloperidol and related compounds.</a> J. Neurochem. 75, 225-232 (2000).</li><li>Salvatore, M. F., Waymire, J. C., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depolarization-stimulated+catecholamine+biosynthesis:+involvement+of+protein+kinases+and+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+sites+in+situ.">Depolarization-stimulated catecholamine biosynthesis: involvement of protein kinases and tyrosine hydroxylase phosphorylation sites in situ.</a> J. Neurochem. 79, 349-360 (2001).</li><li>Haycock, J. W., Lew, J. Y., Garcia-Espana, A., Lee, K. Y., Harada, K., Meller, E., Goldstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+serine-19+phosphorylation+in+regulating+tyrosine+hydroxylase+studied+with+site-+and+phosphospecific+antibodies+and+site-directed+mutagenesis.">Role of serine-19 phosphorylation in regulating tyrosine hydroxylase studied with site- and phosphospecific antibodies and site-directed mutagenesis.</a> J. Neurochem. 71, 1670-1675 (1998).</li><li>Lindgren, N., Xu, Z. Q., Linskog, M., Herrera-Marschitz, M., Goiny, M., Haycock, J. W., Goldstein, M., Hokfelt, T., Fisone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+tyrosine+hydroxylase+activity+and+phosphorylation+at+ser19+and+ser40+via+activation+of+glutamate+NMDA+receptors+in+rat+striatum.">Regulation of tyrosine hydroxylase activity and phosphorylation at ser19 and ser40 via activation of glutamate NMDA receptors in rat striatum.</a> J. Neurochem. 74, 2470-2477 (2000).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

図1に概説され、上記詳述した方法は、ドーパミンの複数の読み出しおよびラットまたはマウスから得られたSNまたはVTAの1つのサンプルから、その調節タンパク質TH、DAT、およびVMA​​T2を生成する必要があります。再び、このプロトコルを実施する利点は、研究者はドーパミンが実質的にすべての実験的なパラダイムの下でin vivoでの規制と、そうすることで、いずれかに必要な動物数?...

HPLCシステム： 基本的なシステムは島津LC10-ADvp HPLCポンプ、ウォーターズWISP 717自動サンプルインジェクター、250 X 4.4ミリメートル、5ミクロンSpherosorb ODS-1 C18逆相カラム（Waters）、バイオ分析システム（BAS）TL12デュアルガラスで構成されています炭素電極、2 BAS LC4B電気化学検出器、およびウォーターズは、2のデータ収集およびデータの統合システムに力を与える。 列は30から45°C（BAS LC22Aカラムヒーター）に維持されています。移動相は0.1 Mリン酸ナトリウム液（pH3.0）、0.1mMのEDTA、0.2から0.4 mMの1 - オクタンスルホン酸（イーストマンコダック - ）、および0.35％0.45ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリル（v / v）である。流量は1.2 ml /分である。移動相の4リットルのバッチは、pH、オクタンスルホン酸およびカラム温度を調整することにより、分離のために最適化されています。移動相はリサイクルされており、継続的に溶存酸素を除去するためにヘリウムガスでパージされています。移動相のリサイクル合理的な期間のために良好な分解能を維持するためにほとんど不可欠である。移動相の貯蔵寿命は、各実行の最初の2から7分を無駄にそらすために、フロースイッチ（積分器によって制御される）を使用することによって維持されています。 電極はAg/AgC1参照電極に対して約0.78と0.95Vの電位で維持されています。より高い電位での電極は、トリプトファン（およびNMDA内部標準）を決定するために排他的に使用されます。 0.78 Vの電位はトリプトファン以外のモノアミン及びその化合物の検出のための雑音比に優れた信号を提供します。クロマトグラムをエンパワーワークステーションのハードドライブに保存され、その後、処理され、データは代謝産物の量およびグループのデータのコンパイルを計算するためのExcelスプレッドシートに直接転送されます。 ポンプ：島津LC-10AD 細胞：BASクロスフロー。 0.780および0.9で作用電極グラッシーカーボン50 Vの可能性。 検出器：BAS LC-4Bは、デュアルチャネルモードで動作する。 データACQ。システム：ウォーターズはPro 2をエンパワー。 インジェクター：ウォーターズWISP 717 カラム：ウォーターズSpherosorb ODS-1、5μm粒子、4.4ミリメートルX 250ミリメートル。 <table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム（SDS） </td><td> - JTベーカー</td><td> 4095から02 </td></tr><tr><td> Trizmaベース</td><td>シグマ</td><td> T1503-1KG </td></tr><tr><td> Trizma HClを</td><td>シグマ</td><td> T3253-1KG </td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマ</td><td> G8773-500 mLの</td></tr><tr><td> PVP-40 </td><td>シグマ</td><td> PVP40-1KG </td></tr><tr><td> DPBS </td><td>ギブコ</td><td> 21600-069 </td></tr><tr><td> Tween20を</td><td>シグマ</td><td> P1379-500 mLの</td></tr><tr><td>グリシン</td><td>シグマ</td><td> G8898-1KG</td></tr><tr><td>ポンソーS </td><td>フルカ</td><td> 81460 </td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>シグマ</td><td> B8026-5G </td></tr><tr><td>ジチオスレイトール</td><td>シグマ</td><td> D-9163 </td></tr><tr><td>タンパク質標準2mgのBSA </td><td>シグマ</td><td> P5619-25VL </td></tr><tr><td>ピアスBCAタンパク質アッセイ試薬</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 23223 </td></tr><tr><td>プレシジョンプラスプロテインスタンダード</td><td>バイオラッド社</td><td> 161-0373 </td></tr><tr><td> [125] - 蛋白質、特定のアクティビティ</td><td>パーキンエルマー</td><td></td></tr></tbody></table> 表2特定の試薬 ​​が含まれています。 <table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 式 </td></tr><tr><td> 10％SDS </td><td> 10グラムSDS、100 mLのDI H 2 0 </td></tr><tr><td> 1％SDS液（pH〜8.2） </td><td><ol><li> 10 mLの10％SDS </li><li> 60.5 mgのTrizmaベース</li><li> 37.22 mgのEDTA </li><li> 90mLのDI H 2 0 </li></ol></td></tr><tr><td>銅II硫酸溶液</td><td><ol><li> 1グラムの銅II硫酸</li><li> 25mLのDI H 2 0 </li></ol></td></tr><tr><td> 3Xサンプルバッファー</td><td><ol><li> Trizmaベース2.27グラム</li><li> SDS 6グラム</li><li>ジチオスレイトール0.463グラム</li><li>グリセロール30グラム</li><li>ブロモフェノールブルー10mgを</li><li> DIH 2 0（最初にメスシリンダーにH 2 O 40 mLに上記の試薬 ​​を加える;体積を100 mLに達するまで、その後H 2 0を追加） </li><li>塩酸（6.85のpHに到達するために、必要に応じて追加） </li><li> 50 2.0 mLチューブ内の溶液を凍結する。 </li></ol> （100 mLを行う）：3Xサンプルバッファーのボリュームは、サンプルで使用されているSDSの=½のボリュームを必要としていました。 </td></tr><tr><td> 1Xサンプルバッファー</td><td> DI H 2 0を使用して1Xサンプルバッファーに3Xサンプルバッファーを希釈する</td></tr><tr><td> 10X<html>ランニング緩衝液（4 Lになります） </td><td><ol><li> Trizmaベース121.1グラム</li><li>グリシン577グラム</li><li> SDS 40グラム</li></ol></td></tr><tr><td> 10X転送バッファ（4 Lになります） </td><td><ol><li>グリシン360グラム</li><li> Trizmaベース96グラム</li></ol></td></tr><tr><td>ポンソー</td><td><ol><li>ポンソーS·0.5グラム</li><li>酢酸5 mLを</li><li> DI H 2 0〜95 mLの</li></ol></td></tr><tr><td> 0.2パーセントのHCl溶液</td><td> DI H 2 O 500mlを5.2 mLの塩酸</td></tr><tr><td> PVP-T20はSolnをブロックします。 （4 Lになります） </td><td><ol><li> PVP-40 40グラム</li><li> DPBS 38.2グラム</li><li> Tween20を2グラム</li><li> Thimerisol 0.4グラム</li><li> 1MトリスpHは7.6（60.6グラムトリスHCl + 500mlのDI H 2 0 13.9グラムトリスベース） - 50 mLの</li></ol></td></tr><tr><td> 10Xブロット緩衝液（4 Lになります） </td><td><ol><li> Tween 20を20グラム</li><li>トリスベース14グラム</li><li>トリスHCl 61グラム</li></ol></td></tr></tbody></table>ontent &quot;&gt; 表3。タンパク質アッセイおよびウェスタンブロッティング式。 チロシン水酸化酵素の基準：この研究室で使用されるキャリブレーションTH蛋白質およびリンの基準は、最終的にドクター·ジョン干し草の山11の研究室に由来する以前にキャリブレーションTH規格に対してTHタンパク質含有量とリン化学量論を分析したPC12細胞抽出物から誘導される。

comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area

ドーパミンは中枢神経系で精力的に研究神経伝達物質である。確かに、その自発運動への関与と報酬に関連する動作は、ドーパミン調節に関連する分子の不備にお問い合わせの五十年を促進しています。線条体および側坐核、黒質線条体とmesoaccumbens経路のターミナルフィールド領域におけるその調節の分子基盤に応じて脳フォーカスのドーパミン調節のこれらの問い合わせが多数。さらに、このような研究が唯一のウェットティッシュの重量に正規化とドーパミン組織含有量の分析に集中している。そのようなチロシンヒドロキシラーゼ（TH）タンパク質、THのリン酸化、ドーパミントランスポーター（DAT）、および小胞モノアミン輸送体2（VMAT2）タンパク質として、ドーパミン調節するタンパク質の研究は、しばしば同一のサンプルにおけるドーパミン組織含有量の分析が含まれていません。ドーパミン組織のコンテンツとその調節タンパク質（ポスト-TRAを含む両方を分析する能力nslational変更）TH、DATのタンパク質レベルと機能とドーパミンの関係を解釈する固有の力を与える、またはVMAT2だけでなく、サンプルの経済を拡張するだけでなく。この低コストに変換し、さらには研究者の選択の事実上すべてのパラダイムにおけるドーパミンの分子制御への洞察を生成します。 我々は中脳での分析の焦点を合わせる。 SNとVTAは、通常、ドーパミン調節のほとんどの研究では無視されていますが、これらの核は簡単に実践して解剖されています。包括的なドーパミン組織のコンテンツとTHの読み出し、DAT、またはVMAT2を行うことができる。そこに行動上のSNとVTAのドーパミン機能の影響に関する文献を急成長し、そこに1から5外因性物質または疾患過程のimpingementsされています。さらに、成長因子などの化合物は、SNまたはVTAで比較的大きい程度に、ドーパミンやドーパミン調節蛋白質に大きな影響を持っている<sup&gt; 6-8したがって、この方法論は、特定の治療法は行動とドーパミンの調節を調節する方法でそれらの照会を拡張する研究室への参照のために提示されています。ここでは、マルチステップ法がげっ歯類の脳から黒質およびVTAドーパミン組織からコンテンツの分析、THのタンパク質レベル、DAT、またはVMAT2、およびTHリン酸化のために提示されています。 THリン酸化の解析だけではなく、TH活性が調節されている方法ではなく、与えられたパラダイムの細胞体核に影響を受けたシグナル伝達カスケードに重要な洞察を得ることができます。 我々は、これらの2つの核とそれぞれの原子核（図1）の特定のin vivoでのドーパミン調節の分子機構を明らかにプロファイルを生成し、解剖組織サンプル処理を分離するために解剖の手法を説明します。

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Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

ドーパミンは、はっきりとドーパミンニューロンの細胞体と樹状突起を含む脳核、で規制されています。ここでは黒質（SN）とげっ歯類では腹側被蓋野（VTA）の中​​脳核のドーパミン調節では、結果を最大化するために解剖し、サンプル処理のアプローチを説明し、その結果、結論と洞察力。

黒質や腹側被蓋野のドーパミン規制の包括的なプロファイリング

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

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JoVE Journal

Neuroscience

25.6K ビュー.  Louisiana State University Health Sciences Center. ドーパミンは、はっきりとドーパミンニューロンの細胞体と樹状突起を含む脳核、で規制されています。ここでは黒質（SN）とげっ歯類では腹側被蓋野（VTA）の中​​脳核のドーパミン調節では、結果を最大化するために解剖し、サンプル処理のアプローチを説明し、その結果、結論と洞察力。