Financement pour le travail cela, et comme cité 2,10, a été fourni, en partie, par un octroi de subventions de recherche à MF Salvatore de la Fédération américaine de recherche sur le vieillissement, Edward P. Le Fonds d&#39;affectation spéciale et Stiles Biomedical Research Foundation du Nord-Ouest en Louisiane, et à la norme BS Pruett de la Bourse Muslow Ike prédoctoral, LSU Health Sciences Center-Shreveport.

<ol>
	<li>Trevitt, J. T., Carlson, B. B., Nowend, K., Salamone, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substantia+nigra+pars+reticulate+is+a+highly+potent+site+of+action+for+the+behavioral+effects+of+the+D1+antagonist+SCH23390+in+rat.">Substantia nigra pars reticulate is a highly potent site of action for the behavioral effects of the D1 antagonist SCH23390 in rat.</a> Psychopharmacology. 156, 32-41 (2001).</li><li>Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Spann, S. L., Dempsey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+reveals+a+role+for+nigral+tyrosine+hydroxylase+ser31+phosphorylation+in+locomotor+activity+generation.">Aging reveals a role for nigral tyrosine hydroxylase ser31 phosphorylation in locomotor activity generation.</a> PLoS ONE. 4, e8466 (2009).</li><li>Rossato, J. L., Bevilaqua, L. R. M., Izquierdo, I., Medina, J. H., Cammarota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+controls+persistence+of+long-term+memory+storage.">Dopamine controls persistence of long-term memory storage.</a> Science. 325, 1017-1020 (2009).</li><li>Keller, C. M., Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Guerdin, G. F., Goeders, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+dopamine+regulation+in+mesoaccumbens+pathway+in+response+to+non-contigent+binge+and+escalating+methamphetamine+regimens+in+the+Wistar+rat.">Biphasic dopamine regulation in mesoaccumbens pathway in response to non-contigent binge and escalating methamphetamine regimens in the Wistar rat.</a> Psychopharmacology. 215, 513-526 (2011).</li><li>Lu, L., Dempsey, J., Liu, S. Y., Bossert, J. M., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+infusion+of+brain-derived+neurotrophic+factor+into+the+ventral+tegmental+area+induces+long-lasting+potentiation+of+cocaine+seeking+after+withdrawal.">A single infusion of brain-derived neurotrophic factor into the ventral tegmental area induces long-lasting potentiation of cocaine seeking after withdrawal.</a> J. Neurosci. 24, 1604-1611 (2004).</li><li>Hoffer, B. J., Hoffman, A., Bowenkamp, K., Huettl, P., Hudson, J., Martin, D., Lin, L. F., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+reverses+toxin-induced+injury+to+midbrain+dopaminergic+neurons+in+vivo.">Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo.</a> Neurosci. Lett. 182, 107-111 (1994).</li><li>Salvatore, M. F., Zhang, J. L., Large, D. M., Wilson, P. E., Gash, C. R., Thomas, T. C., Haycock, J. W., Bing, G., Stanford, J. A., Gash, D. M., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+GDNF+administration+increases+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+in+the+rat+striatum+and+substantia+nigra.">Striatal GDNF administration increases tyrosine hydroxylase phosphorylation in the rat striatum and substantia nigra.</a> J. Neurochem. 90, 245-254 (2004).</li><li>Lu, L., Wang, X., Wu, P., Xu, C., Zhao, M., Morales, M., Harvey, B. K., Hoffer, B. J., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+ventral+tegmental+area+glial+cell-line+derived+neurotrophic+factor+in+incubation+of+cocaine+craving.">Role of ventral tegmental area glial cell-line derived neurotrophic factor in incubation of cocaine craving.</a> Biol. Psychiatry. 66, 137-145 (2009).</li><li>Lavicky, J., Dunn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticotropin-releasing+factor+stimulates+catecholamine+release+in+hypothalamus+and+prefrontal+cortex+in+freely+moving+rats+as+assessed+by+microdialysis.">Corticotropin-releasing factor stimulates catecholamine release in hypothalamus and prefrontal cortex in freely moving rats as assessed by microdialysis.</a> J. Neurochem. 60, 602-612 (1993).</li><li>Salvatore, M. F., Pruett, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichotomy+of+tyrosine+hydroxylase+and+dopamine+regulation+between+somatodendritic+and+terminal+field+areas+of+nigrostriatal+and+mesoaccumbens+pathways.">Dichotomy of tyrosine hydroxylase and dopamine regulation between somatodendritic and terminal field areas of nigrostriatal and mesoaccumbens pathways.</a> PLoS ONE. 7, e29867 (2012).</li><li>Salvatore, M. F., Garcia-Espana, A., Goldstein, M., Deutch, A. Y., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+in+the+nigrostriatal+and+mesolimbic+systems+in+vivo:+Effects+of+acute+haloperidol+and+related+compounds.">Stoichiometry of tyrosine hydroxylase phosphorylation in the nigrostriatal and mesolimbic systems in vivo: Effects of acute haloperidol and related compounds.</a> J. Neurochem. 75, 225-232 (2000).</li><li>Salvatore, M. F., Waymire, J. C., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depolarization-stimulated+catecholamine+biosynthesis:+involvement+of+protein+kinases+and+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+sites+in+situ.">Depolarization-stimulated catecholamine biosynthesis: involvement of protein kinases and tyrosine hydroxylase phosphorylation sites in situ.</a> J. Neurochem. 79, 349-360 (2001).</li><li>Haycock, J. W., Lew, J. Y., Garcia-Espana, A., Lee, K. Y., Harada, K., Meller, E., Goldstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+serine-19+phosphorylation+in+regulating+tyrosine+hydroxylase+studied+with+site-+and+phosphospecific+antibodies+and+site-directed+mutagenesis.">Role of serine-19 phosphorylation in regulating tyrosine hydroxylase studied with site- and phosphospecific antibodies and site-directed mutagenesis.</a> J. Neurochem. 71, 1670-1675 (1998).</li><li>Lindgren, N., Xu, Z. Q., Linskog, M., Herrera-Marschitz, M., Goiny, M., Haycock, J. W., Goldstein, M., Hokfelt, T., Fisone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+tyrosine+hydroxylase+activity+and+phosphorylation+at+ser19+and+ser40+via+activation+of+glutamate+NMDA+receptors+in+rat+striatum.">Regulation of tyrosine hydroxylase activity and phosphorylation at ser19 and ser40 via activation of glutamate NMDA receptors in rat striatum.</a> J. Neurochem. 74, 2470-2477 (2000).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Comme il est indiqué dans la figure 1, les méthodes décrites ci-dessus devrait produire plusieurs lectures de la dopamine et son TH régulation des protéines, DAT, et VMAT2 d&#39;un échantillon de SN ou VTA obtenu à partir de chez le rat ou la souris. Encore une fois, les avantages de la réalisation de ce protocole sont que l&#39;enquêteur peut obtenir un indicateur de vue opérationnel appariés de la façon dont la dopamine est régulée in vivo dans pratiquement n&#39;importe quel paradigme ...

Système HPLC: Le système de base se compose d&#39;un Shimadzu LC10-ADVP pompe HPLC, un échantillon des eaux WISP 717 injecteur automatique, d&#39;un 250 X 4,4 mm 5 microns Spherosorb ODS-1 C18 colonne en phase inverse (Waters), un Bioanalytical Systems (BAS) TL12 vitreux double électrode de carbone, deux BAS LC4B détecteurs électrochimiques, et quelques eaux Empower 2 collecte de données et système d&#39;intégration. La colonne est maintenue à 30-45 ° C (chauffe BAS colonne LC22A). La phase mobile est de 0,1 M de phosphate de sodium (pH 3,0), EDTA 0,1 mM, 0,2-0,4 mm 1-octane acide sulfonique (Eastman Kodak-), et de l&#39;acétonitrile 0,35% (v / v), filtré à travers un filtre de 0,45 micron. Le débit est de 1,2 ml / min. Quatre lots litre de la phase mobile sont optimisés pour des séparations en ajustant le pH, d&#39;acide sulfonique et d&#39;octane température de la colonne. La phase mobile est recyclé, et est continuellement purgé avec un gaz d&#39;hélium pour éliminer l&#39;oxygène dissous. Le recyclage de la phase mobileest presque indispensable de maintenir une bonne résolution pour une période de temps raisonnable. La phase mobile durée de vie est maintenu par l&#39;aide d&#39;un détecteur de débit (contrôlé par l&#39;intégrateur) pour détourner de perdre le premier 2-7 min de chaque course. Les électrodes sont maintenues à des potentiels d&#39;environ 0,78 et 0,95 V par rapport à une électrode de référence Ag/AgC1. L&#39;électrode à la plus élevée possible est utilisé exclusivement pour la détermination de tryptophane (et de la norme interne NMDA). Le potentiel 0,78 V fournit un signal supérieure à bruit pour la détection des monoamines et des composés, autres que le tryptophane. Les chromatogrammes sont stockés sur le disque dur du poste de travail Empower, puis traitées et les données transférées directement dans un tableur Excel pour le calcul des montants de métabolites et de compilation des données du groupe. Pompe: Shimadzu LC-10AD Cellulaire: BAS Croix débit. Carbone vitreux électrode de travail à 0,780 et 0,950 potentiel V. Détecteur: BAS LC-4B fonctionnant en mode dual channel. Données Acq. Système: Waters Empower Pro 2. Injecteur: WISP Waters 717 Colonne: Waters Spherosorb ODS-1, 5 uM de particules, 4,4 mm X 250 mm. <table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Dodécylsulfate de sodium (SDS) </td><td> - JT Baker </td><td> 4095-02 </td></tr><tr><td> Base de Trizma </td><td> Sigma </td><td> T1503-1KG </td></tr><tr><td> Trizma HCl </td><td> Sigma </td><td> T3253-1KG </td></tr><tr><td> Glycérol </td><td> Sigma </td><td> G8773-500 ml </td></tr><tr><td> PVP-40 </td><td> Sigma </td><td> PVP40-1KG </td></tr><tr><td> dPBS </td><td> Gibco </td><td> 21600-069 </td></tr><tr><td> Tween20 </td><td> Sigma </td><td> P1379-500 ml </td></tr><tr><td> Glycine </td><td> Sigma </td><td> G8898-1KG</td></tr><tr><td> Ponceau S </td><td> Fluka </td><td> 81460 </td></tr><tr><td> Bleu de bromophénol </td><td> Sigma </td><td> B8026-5G </td></tr><tr><td> Dithiothreitol </td><td> Sigma </td><td> D-9163 </td></tr><tr><td> Standard Protéines 2 mg de BSA </td><td> Sigma </td><td> P5619-25VL </td></tr><tr><td> Pierce BCA Protein Assay Reagent A </td><td> Thermo Fisher Scientific- </td><td> 23223 </td></tr><tr><td> Precision Plus Protein standard </td><td> Bio Rad </td><td> 161-0373 </td></tr><tr><td> [125I]-protéine A, l&#39;activité spécifique </td><td> Perkin-Elmer </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 2. Réactifs spécifiques. <table border="1"><tbody><tr><td> Réactifs </td><td> Formules </td></tr><tr><td> SDS à 10% </td><td> 10 g de SDS, 100 ml DI H 2 0 </td></tr><tr><td> 1% (pH à 8,2) SDD </td><td><ol><li> 10 mlSDS à 10% </li><li> 60,5 mg de base Trizma </li><li> 37,22 mg d&#39;EDTA </li><li> 90 ml DI H 2 0 </li></ol></td></tr><tr><td> Solution de sulfate de cuivre II </td><td><ol><li> 1 Cuivre II sulfate de g </li><li> 25 ml DI H 2 0 </li></ol></td></tr><tr><td> Sample Buffer 3X </td><td><ol><li> Trizma Base de 2,27 g </li><li> SDS 6 g </li><li> Dithiothreitol 0,463 g </li><li> Glycérol 30 g </li><li> Le bleu de bromophénol 10 mg </li><li> DIH 2 0 (d&#39;abord ajouter ci-dessus réactifs à 40 mL de H 2 0 dans une éprouvette graduée, puis ajouter H 2 0 jusqu&#39;à ce que le volume atteint 100 ml) </li><li> HCl (ajouter au besoin pour atteindre un pH de 6,85) </li><li> Congeler solution dans des tubes de 50 ml 2.0. </li></ol> (Fait 100 ml): Volume de tampon d&#39;échantillon nécessaire 3X = volume ½ de la SDD utilisé dans l&#39;échantillon. </td></tr><tr><td> 1X tampon d&#39;échantillon </td><td> Diluer le tampon de l&#39;échantillon jusqu&#39;à 3X 1X tampon d&#39;échantillon à l&#39;aide DI H 2 0 </td></tr><tr><td> 10X<html> Exécution de tampon (Donne 4 L) </td><td><ol><li> Trizma Base de 121,1 g </li><li> Glycine 577 g </li><li> SDS 40 g </li></ol></td></tr><tr><td> Tampon de transfert 10X: (Donne 4 L) </td><td><ol><li> Glycine 360 ​​g </li><li> Trizma Base de 96 g </li></ol></td></tr><tr><td> Ponceau </td><td><ol><li> Ponceau S de 0,5 g </li><li> Acide acétique à 5 ml </li><li> DI H 2 0 95 ml </li></ol></td></tr><tr><td> 0,2% Solution HCl </td><td> 5,2 ml de HCl dans 500 ml de DI H 2 0 </td></tr><tr><td> PVP-T20 blocage Soln. (Donne 4 L) </td><td><ol><li> PVP-40 40 g </li><li> dPBS 38,2 g </li><li> Tween 20 2 g </li><li> Thimerisol 0,4 g </li><li> 1M Tris pH 7,6 (60,6 g de Tris HCl + 13,9 g de Tris base dans 500 ml H 2 0 DI) - 50 ml </li></ol></td></tr><tr><td> Tampon 10X Blot (Donne 4 L) </td><td><ol><li> Tween 20 20 g </li><li> Tris Base 14 g </li><li> Tris-HCl 61 g </li></ol></td></tr></tbody></table>ontenu &quot;Protein Assay&gt; Tableau 3. et de l&#39;Ouest Formules buvard. Normes de la tyrosine hydroxylase: Les calibrés TH normes de protéines et de la phosphorylation utilisés par ce laboratoire proviennent de PC12 extraits cellulaires, qui ont été analysés pour la teneur en protéines TH et stoechiométries phosphorylation contre un TH normes préalablement calibrées qui a finalement origine du laboratoire du Dr John Haycock 11 .

comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area

La dopamine est un neurotransmetteur vigoureusement étudiée dans le SNC. En effet, son implication dans l&#39;activité locomotrice et la récompense liée au comportement a favorisé cinq décennies d&#39;enquête sur les carences moléculaires associés à la réglementation la dopamine. La majorité de ces demandes de régulation de la dopamine dans le cerveau sur mise au point de la base moléculaire de sa réglementation dans les régions de champ terminales des voies nigrostriataux et mesoaccumbens; striatum et le noyau accumbens. En outre, ces études se sont concentrées sur l&#39;analyse du contenu des tissus de la dopamine avec la normalisation du poids des tissus seulement humide. Enquête sur les protéines qui régulent la dopamine, comme la tyrosine hydroxylase (TH) des protéines, la phosphorylation TH, transporteur de la dopamine (DAT), et vésiculaires transporteur de monoamines 2 (VMAT2) protéine souvent ne comprennent pas l&#39;analyse du contenu des tissus de la dopamine dans le même échantillon. La capacité à analyser à la fois le contenu des tissus de la dopamine et de ses protéines régulatrices (y compris post-tramodifications nslational) ne donne pas seulement le pouvoir inhérent à l&#39;interprétation de la relation de la dopamine au niveau des protéines et la fonction de TH, DAT ou VMAT2, mais s&#39;étend également l&#39;économie de l&#39;échantillon. Cela se traduit par un coût moindre, tout en produisant un aperçu de la régulation moléculaire de la dopamine dans pratiquement n&#39;importe quel paradigme de choix des enquêteurs. Nous nous concentrons les analyses dans le mésencéphale. Bien que le SN et VTA sont généralement négligé dans la plupart des études de régulation de la dopamine, ces noyaux sont facilement disséqué avec la pratique. Une lecture complète du contenu du tissu de la dopamine et TH, DAT ou VMAT2 peut être effectuée. Il est en plein essor la littérature sur l&#39;impact de la fonction de dopamine dans le SN et VTA sur le comportement, et les empiétements de substances exogènes ou des procédés qui y sont la maladie 1-5. En outre, des composés tels que les facteurs de croissance ont un effet profond sur les protéines de la dopamine et la dopamine-régulation, dans une mesure relativement plus grande dans le SN ou VTA <sup&gt; 6-8. Par conséquent, cette méthode est présentée à titre de référence aux laboratoires qui veulent étendre leurs enquêtes sur la façon dont les traitements spécifiques moduler le comportement et régulation de la dopamine. Ici, une méthode multi-étape est présentée pour les analyses de la teneur des tissus dopamine, les teneurs en protéines de TH, DAT ou VMAT2 et la phosphorylation de la TH substantia nigra et VTA de mésencéphale rongeurs. L&#39;analyse de la phosphorylation de TH peut donner des informations importantes sur la façon dont non seulement l&#39;activité TH est réglementée, mais aussi les cascades de signalisation affectées dans les noyaux somato dans un paradigme donné. Nous allons illustrer la technique de dissection de séparer ces deux noyaux et le traitement d&#39;échantillons de tissus disséqués qui produit un profil révélant les mécanismes moléculaires de régulation de la dopamine in vivo, spécifiques pour chaque noyaux (figure 1).

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Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

La dopamine est nettement réglementée dans les noyaux du mésencéphale, qui contiennent les corps cellulaires et les dendrites des neurones dopaminergiques. Nous décrivons ici une approche de dissection et manipulation d&#39;échantillons de maximiser les résultats, et donc les conclusions et les points de vue, sur la réglementation de la dopamine dans les noyaux du mésencéphale de la substantia nigra (SN) et l&#39;aire tegmentale ventrale (VTA) chez les rongeurs.

Profilage global de régulation de la dopamine dans la substance noire et aire tegmentale ventrale

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

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25.6K vues.  Louisiana State University Health Sciences Center. La dopamine est nettement réglementée dans les noyaux du mésencéphale, qui contiennent les corps cellulaires et les dendrites des neurones dopaminergiques. Nous décrivons ici une approche de dissection et manipulation d'échantillons de maximiser les résultats, et donc les conclusions et les points de vue, sur la réglementation de la dopamine dans les noyaux du mésencéphale de la substantia nigra (SN) et l'aire tegmentale ventrale (VTA) chez les rongeurs....