Nosso protocolo é um método in vivo para investigar as funções autônomas celulares da FMRP durante o desenvolvimento. Isso pode ajudar a entender a fisiopatologia específica do tipo celular da síndrome do X frágil. Este método emprega eletroporação específica de estágio, local e direção de um sistema vetorial induzível por droga contendo RNA de grampo de cabelo pequeno Fmr1.
Com este método, consegue-se o knockdown seletivo da FMRP no circuito auditivo. Este método também pode ser aplicado para investigar a função de outros genes no circuito auditivo ou no sistema vestibular. Comece colocando os ovos horizontalmente para posicionar o embrião na parte superior do óvulo para facilitar a manipulação.
Incubar a 38 graus Celsius por 46 a 48 horas até Hamburger e Hamilton, ou HH estágio 12, para transfecção do tubo neural ou por 54 a 56 horas até HH 13 para transfecção de otocistos. Retire os ovos da incubadora, uma dúzia de ovos de cada vez. Manter os ovos fora de sua incubadora por mais de uma hora introduz variações de desenvolvimento e reduz a viabilidade.
Use uma lanterna para lançar luz do fundo do ovo. A localização do embrião aparece como uma área escura na casca do ovo. Marque a localização do embrião na casca do ovo com um lápis.
Limpe os ovos com gaze contendo etanol a 75% e faça um furo na extremidade pontiaguda dos ovos usando a ponta da tesoura. Em seguida, remova dois mililitros de albumina com uma seringa de agulha de calibre 18. Certifique-se de que o orifício seja grande o suficiente para permitir a inserção da agulha.
Limpe qualquer vazamento de albumina com gaze e sele o orifício com fita adesiva. Cubra a parte superior dos ovos com fita adesiva, centrando-se na área escura marcada com lápis para minimizar rachaduras e evitar a queda de detritos de casca durante a janela. Limpe todas as ferramentas de cirurgia com gaze contendo etanol a 75% e limpe a área coberta de fita com etanol a 75%.
Use um pequeno par de tesouras para cortar uma janela de um a dois centímetros quadrados ao redor da circunferência da marca de lápis. Segure a tesoura plana para evitar danificar o embrião por baixo. Coloque o ovo em janela sob um estereomicroscópio com uma ocular de 10X e zoom de 2X.
Encha uma seringa de um mililitro com a solução de tinta e, em seguida, encaixe uma agulha de calibre 27. Dobre a agulha para um ângulo de 45 graus com pinças. Sob o microscópio, cutuque cuidadosamente a borda da área opaqua e insira a agulha sob o embrião.
Injete cerca de 50 microlitros de tinta, que se difundirão abaixo da área pelúcida, para visualização embrionária. A tinta formará um fundo escuro para a visualização clara do embrião. Puxe os capilares de vidro para as pipetas usando um puxador de pipetas.
Sob um microscópio de dissecação, abra cuidadosamente a ponta da agulha capilar a 10 a 20 micrômetros de diâmetro com pinça. Armazene as pipetas em uma caixa de armazenamento até o uso. Em seguida, encha uma pipeta capilar com 0,5 a 1 microlitros da mistura plasmídica aplicando pressão negativa através de um tubo de borracha no final da pipeta com uma seringa.
Coloque o ovo sob o microscópio para que o embrião seja orientado verticalmente com a cauda perto de você. Segure a pipeta capilar com uma mão ou com o manipulador de três eixos e conduza a ponta da pipeta até ao rombómero 5 a 6. em uma direção da cauda à cabeça.
Cutuque suavemente a ponta através da membrana vitelina e no tubo neural dorsal e, em seguida, retire a pipeta um pouco para que a ponta esteja no lúmen do tubo neural. Injetar a mistura plasmídica aplicando pressão de ar até que o plasmídeo colorido se difunda totalmente em rombômero 5 a 6 e se estenda para o rombômero 3 e o rombomere 4. Verifique se há injeção bem-sucedida, o que é conseguido quando a solução de plasmídeo azul se difunde rapidamente pelo tubo neural sem vazar.
Quando ocorre vazamento, o azul desaparece rapidamente. Imediatamente após a injeção, coloque um eletrodo bipolar de platina em ambos os lados do tubo neural. Forneça dois pulsos de 12 volts e 50 milissegundos de duração com um eletroporador.
Observe bolhas de ar nas extremidades do eletrodo bipolar, com mais no lado negativo. Verifique se há eletroporação bem-sucedida, que é alcançada quando a mistura de plasmídeos coloridos entra no tecido do tubo neural perto do lado positivo do eletrodo. Após a eletroporação, remova cuidadosamente o eletrodo bipolar.
Cubra a janela na casca do ovo com um pedaço de filme transparente pré-cortado em quadrados de duas polegadas e pulverizado com etanol a 75%. Coloque o ovo de volta em sua incubadora. Limpe o eletrodo bipolar entregando 10 a 20 pulsos de 12 volts e 50 milissegundos de duração em solução salina antes de prosseguir para o próximo ovo.
Sob o microscópio, coloque o ovo de tal forma que o embrião seja vertical com a cauda perto de você. Segure a pipeta capilar e cutuque suavemente o otocisto direito na direção dorsolateral. Injete a mistura plasmídica com pressão de ar até que o otocisto seja preenchido com solução azul.
Verifique se há uma injeção bem-sucedida, que é alcançada quando a mistura de plasmídeo azul está confinada dentro do otocisto e não vaza. Imediatamente após a injeção, coloque o eletrodo bipolar no otocisto e posicione os lados positivo e negativo anterior e posterior ao otocisto, respectivamente. Forneça dois pulsos de 12 volts e 50 milissegundos de duração com o eletroporador.
Verifique se há eletroporação bem-sucedida, que é alcançada quando a mistura de plasmídeo azul entra no tecido do otocisto perto do lado positivo do eletrodo. Após a eletroporação, remova cuidadosamente o eletrodo bipolar e cubra a janela na casca do ovo com um filme transparente. Finalmente, devolva o ovo à incubadora.
A imagem representativa mostra um exemplo de embrionário do terceiro dia, ou E3, após transfecção de tubo neuro e tratamento dox no segundo dia embrionário, ou E2. Células transfectadas com fmr1 shRNA e EGFP na seção transversal são mostradas aqui. As células que expressam EGFP foram confinadas a um lado do tubo neural e do tronco encefálico. Uma seção transversal em E15 com núcleo magnocelular que expressa EGFP, ou neurônios NM, no lado transfectado é mostrada aqui.
No lado contralateral, axônios contendo EGFP foram observados na porção ventral do núcleo laminar, ou NL. O efeito knockdown do shRNA Fmr1 foi validado por reduções acentuadas na imunorreatividade da FMRP em neurônios NM transfectados em comparação com neurônios vizinhos não transfectados. O gânglio auditivo em E19 com imunorreatividade da FMRP é mostrado aqui. Os neurônios ganglionares auditivos não foram transfectados.
Algumas células gliais derivadas das células da crista neural craniana foram transfectadas. As imagens representativas mostram o knock-down da FMRP no ducto auditivo após a transfecção do otocisto. Os ductos auditivos em E9 apresentaram extensa fluorescência do EGFP.
Nos cortes transversais, as células expressas de EGFP localizavam-se na papila basilar e no gânglio auditivo. O efeito knockdown do shRNA Fmr1 foi validado pela redução da imunorreatividade da FMRP em células ciliadas transfectadas em comparação com células ciliadas vizinhas não transfectadas. Da mesma forma, a imunorreatividade da FMRP foi amplamente diminuída nos neurônios ganglionares auditivos transfectados.
A projeção central dos neurônios ganglionares auditivos transfectados foi rastreada até o tronco encefálico através do nervo auditivo com terminais de bulbo final caracterizados. Ao tentar este procedimento, o mais importante é controlar o local e a direção da eletroporação para transfecção seletiva. Após este procedimento, o preenchimento do tipo célula única, a imunocoloração, a classificação celular seguida de espectro de massa ou o sequenciamento de célula única podem ser realizados para revelar as alterações em níveis morfológicos e bioquímicos.
Essa técnica também possibilita a edição seletiva de outros genes com controle temporal e especificidade de componentes na orelha auditiva para circuitos de caule e pode ser modificada para manipular o sistema vestibular.
