Os autores agradecem Linda Turner para obter ajuda com a preparação microbiológica. RZ e LBV foram financiados pelo Instituto Rowland em Harvard e CGB foi financiado como um estudioso da Fundação CAPES, Ciência sem Fronteiras Programa, Brasil (Processo n º 7340-11-7)

1. Configuração e Aquisição de Dados <ol><li> Crescer uma cultura de Streptococcus tensão V4051-197 (natação liso) células em meio KTY do estoque congelado 22. Incubar em um agitador rotativo, durante a noite a 35 ° C e 150 rpm, até à saturação. </li><li> Inocular 10 ml de meio fresco com KTY 500 ul de cultura saturada. Incubar durante mais 3,5 horas a 35 ° C e 150 rpm até as células atingirem uma densidade óptica de cerca de 1,0 a λ = 600 nm (aproximadamente 5 x 10 8 células / ml). </li><li> Dilui-se 1:400 em meio fresco para obter a concentração final de células móveis. </li><li> Em uma lâmina de microscópio, fazer um anel de lubrificação (por exemplo, a partir de uma seringa cheia de vaselina) a cerca de 1 mm de altura e de colocar uma gota da solução de amostra no centro. Coloque uma tampa de vidro em cima e pressione levemente nas bordas para selar, garantindo que o líquido está em contato com os dois slides e tampa de vidro. A câmara da amostra resultante deve ser arouª 100-200 mM em profundidade. </li><li> Coloque a câmara de amostras no microscópio com a tampa de vidro virada para baixo, e com cuidado, para evitar a formação de bolhas de ar no óleo entre o vidro e lente. </li><li> Concentre-se ao microscópio sobre a superfície inferior da câmara da amostra, e trazer o condensador para o foco. </li><li> Desligue a iluminação padrão e colocar a cabeça do LED por trás da abertura do condensador do microscópio. Definir a fonte de alimentação do diodo emissor de potência máxima. </li><li> Feche a abertura do condensador ao máximo e, se necessário, deslocar o LED em sua montagem até a iluminação é centrado na abertura da lente objetiva. </li><li> Ligue o computador e câmera, e redirecionar toda a luz de porta da câmera do microscópio. Ajustar a taxa de quadros eo tamanho da imagem no software de aquisição de imagem. </li><li> Faça o tempo de exposição quadro tão curto quanto possível, mantendo um bom contraste. Verificar uma imagem do histograma da intensidade de assegurar que a imagem não é saturaçãoted ou subexposta. </li><li> Se for necessário, reorientar o microscópio a fim de que objeto de interesse é ligeiramente desfocado (normalmente por 10-30 mm). O objecto e o plano focal deve estar no mesmo meio (isto é, o plano focal deve situar-se dentro da câmara de amostras). </li></ol> 2. Reconstrução A primeira etapa do processamento de dados é de reorientar numericamente um quadro de vídeo em uma série de diferentes profundidades, produzindo uma pilha de imagens. Software de fácil utilização para fazer isso podem ser encontradas aqui: <a href="http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html">http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html</a> juntamente com exemplos de imagens (adquiridos usando um microscópio invertido, e uma imersão em óleo lente objetiva 60X) e um arquivo de cena para ray rastreada renderização. <ol><li> Insira o quadro de interesse e seu respectivo fundo como arquivos de imagem separados, nas caixas relevantes sobre a interface. A imagem de fundo é um quadro que fairly representa o fundo do vídeo, na ausência do holograma, e irá ser utilizado para suprimir o ruído de padrão fixo que poderia interferir com o holograma de localização e análise. </li><li> Digite os valores para as configurações globais caixas do lado esquerdo da tela antes de executar o programa. Os três primeiros são parâmetros pilha de saída: posição axial do primeiro enquadramento (&#39;Start foco&#39;); número de fatias na pilha reconstruído (&#39;Número de passos&#39;); distância axial entre cada fatia na pilha (&quot;Tamanho do passo &#39;) . </li><li> A fim de reconstituir os objectos com as proporções correctas, o tamanho do passo deve ser do mesmo tamanho que o espaçamento do pixel lateral. Digite frequência de amostragem laterais da câmara (espaçamento 1/pixel) na caixa &#39;Pixel / mícron &quot;, o comprimento de onda de iluminação e índice de refração médio nos últimos dois caixas. Valores padrão do programa são adequados para reconstruir os dados de exemplo. </li><li> Pressione o botão &#39;Flip Z-gradiente&#39; se o centro do object é escuro no holograma (ver exemplo quadro de 2005 ea seção de discussão para mais detalhes). </li><li> Verifique o filtro de banda em estado / off (o padrão é ativado). Este filtro de banda opcional, localizado em uma caixa abaixo do interruptor gradiente-flip, é responsável pela supressão da contribuição a partir de pixels ruidosos. O filtro passa-banda é aplicado a cada fatia de imagem imediatamente após geração. </li><li> Verifique o interruptor de saída intermediária on / off estados (padrão é ligado). Etapas de análise Intermediate são escritos em dois vídeos de saída, como descompactado avi:. A primeira é a pilha reorientada (nome do arquivo que termina em &#39;_stack.avi&#39;), o segundo é a pilha após a operação inclinação axial (nome do arquivo que termina em &#39; _gradient.avi &#39;). Idealmente, esta segunda pilha conterá o objeto de interesse destacado como um objeto brilhante contra um fundo escuro. </li><li> Depois de definir todos os parâmetros, pressione &#39;Run&#39; na janela principal. O quadro selecionado irá aparecer na caixa principal do software. </li><li> Use oampliação ferramenta de vidro encontrado na barra de ferramentas à esquerda da imagem para aumentar o zoom (botão esquerdo) e zoom out (shift + clique esquerdo). Use a ferramenta retângulo na barra de ferramentas para selecionar uma região de interesse (ROI). Capturar o maior número de franjas do holograma possível dentro do retângulo, pois isso irá otimizar a reconstrução. </li><li> Pressione o botão &quot;processo&quot; para gerar as duas pilhas de imagens. Inspecione as pilhas resultantes usando ImageJ (que pode ser obtido gratuitamente no <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ). Se o objeto de interesse pode ser visto claramente na pilha de gradiente, siga para o passo seguinte para extrair as coordenadas de objetos. </li></ol> 3. Representação <ol><li> Além quadro reorientação, este programa pode localizar as coordenadas x, y, z para cada voxel no objeto de interesse. Pressione o botão &#39;Feature Extraction &quot;para activar esta função. </li><li> Digite um caminho, incluindo a extensão (por exemplo: c: home output.inc), para asaída coordena arquivo. Selecione &quot;estilo POV-Ray &#39;na caixa&#39; saída coordenar estilo &#39;. Isso faz com que o programa para gravar um arquivo de objeto que pode ser visualizada usando o pacote de software livre raytracing POV-Ray (que pode ser obtido a partir de <a href="http://www.povray.org/">http://www.povray.org/</a> ). </li><li> Reprocessar as imagens como na seção 2 acima. O programa irá fornecer uma série de (x, y, z) coordena no ROI selecionado, escrito para o nome do arquivo no &#39;Output coordenar&#39; caixa. Extração de coordenadas de objetos leva muito mais tempo do que a geração de pilha. </li><li> Certifique-se de que o arquivo POV-Ray amostra (fornecido com o código de reconstrução) está na mesma pasta que as coordenadas do arquivo apenas gerado. Edite o arquivo pov amostra. E substituir o nome do arquivo entre aspas na linha # Include &quot;MYFILE.inc&quot; com o nome do ficheiro de dados gerados pelo código de reconstrução. </li><li> Clique no botão &quot;Executar&quot; no POV-Ray para renderizar uma imagem bitmap. Tele a posição da câmera, iluminação e opções de textura são apenas algumas das personalizações possíveis no POV-Ray, consulte a documentação on-line para obter mais informações. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O passo mais importante neste protocolo experimental é a captação precisa das imagens de uma instalação experimental estável. Com pobres dados de fundo, alta fidelidade de reconstrução é quase impossível. Também é importante para evitar as lentes objectivas com um elemento interno de contraste de fase (visíveis como um anel escuro quando se olha através da parte de trás do objectivo), como este pode degradar a imagem reconstruída. O objeto de interesse deve ser longe o suficiente do plano focal que algun...

Linha Digital microscopia holográfica (Dihm) permite rápido imagens tridimensionais de amostras microscópicas, tais como microorganismos natação 1,2 e sistemas de matéria mole 3,4, com modificações mínimas para uma configuração de microscópio padrão. Neste trabalho uma demonstração pedagógica da Dihm é fornecido, centrada em torno de um software desenvolvido em nosso laboratório. Este trabalho inclui uma descrição de como configurar o microscópio, otimizar a aquisição de dados e processar as imagens gravadas para reconstruir dados tridimensionais. O software (baseado em parte no software desenvolvido pela DG Grier e outros 5) e imagens de exemplo estão disponíveis gratuitamente em nosso site. A descrição é fornecida dos passos necessários para configurar o microscópio, reconstruir volumes tridimensionais a partir de hologramas e tornam os volumes resultantes de interesse usando um raio livre rastreamento pacote de software. O artigo conclui com uma discussão sobre os fatores que afetam a qualidade da reconstrução, E uma comparação com os métodos de Dihm concorrentes. Embora Dihm foi descrito há algum tempo (para uma revisão geral de seus princípios e de desenvolvimento, ver Kim 6), o poder de computação necessário e imagem perícia processamento até então muito restrito o seu uso para grupos de pesquisa especializados com foco no desenvolvimento de instrumentos. Esta situação está mudando à luz dos recentes avanços na computação e tecnologia de câmera. Computadores modernos podem facilmente lidar com o processamento e os requisitos de armazenamento de dados; CCD ou CMOS câmeras estão presentes na maioria dos laboratórios de microscopia, eo software necessário está sendo disponibilizado gratuitamente na internet por grupos que investiram tempo no desenvolvimento da técnica. Vários esquemas têm sido propostos para a imagem da configuração de objectos microscópicos em um volume de amostra tridimensional. Muitos destes são digitalizando técnicas 7,8, em que uma pilha de imagens é gravada por mechanically traduzindo o plano de imagem através da amostra. Microscopia de fluorescência confocal é talvez o exemplo mais conhecido. Tipicamente, um corante fluorescente é adicionado a um objecto de fase, a fim de alcançar um nível aceitável de contraste da amostra, e a disposição confocal utilizados para localizar espacialmente emissão fluorescente. Este método tem levado a avanços significativos, como por exemplo na ciência coloidal onde tem permissão para acessar a dinâmica tridimensional de sistemas lotados 9-11. O uso de rotulagem é uma importante diferença entre a microscopia de fluorescência confocal e Dihm, mas outras características das duas técnicas podem ser comparados. Dihm tem uma vantagem significante na velocidade em que o aparelho não tem partes móveis. Os espelhos de varredura mecânica em sistemas confocal colocar um limite superior para a taxa de aquisição de dados - geralmente cerca de 30 frames / seg a imagem de pixel 512 x 512 para. Uma pilha de tais imagens em diferentes planos focais pode ser obtido por fisicamente translAting o estágio da amostra ou lente objetiva entre os quadros, o que leva a uma taxa de captura final de cerca de um volume por segundo para um quadro de pilha 30. Em comparação, um sistema holográfico com base em uma câmara moderna CMOS pode capturar 2000 quadros / seg para o mesmo tamanho e a resolução da imagem, cada imagem é processada `off-line&quot; para dar um instantâneo independente do volume de amostra. Para reiterar: amostras fluorescentes não são necessários para Dihm, embora o sistema foi desenvolvido que executa a reconstrução holográfica de um objecto fluorescente 12. , Bem como informações sobre o volume tridimensional, Dihm também pode ser utilizado para obter imagens de contraste de fase quantitativos 13, mas que está fora do âmbito da discussão aqui. Imagens de dados Raw Dihm são bidimensionais e, em alguns aspectos parecido com imagens de microscópio padrão, ainda que fora de foco. A principal diferença entre Dihm e microscopia de campo claro padrão encontra-se em anéis de difração que cercam objetos in o campo de visão, que são devido à natureza da iluminação. Dihm requer uma fonte mais coerente do campo claro - geralmente um LED ou laser. Os anéis de difração do holograma contém a informação necessária para reconstruir uma imagem tridimensional. Existem duas abordagens principais para interpretar os dados Dihm; reorientar montagem e numérica direta. A primeira abordagem é aplicável nos casos em que a forma matemática do padrão de difração é conhecido com antecedência 3,4; esta condição é satisfeita por um pequeno punhado de objetos simples, como esferas, cilindros e obstáculos semi-plano. Montagem direta também é aplicável nos casos em que posição axial do objeto é conhecido, ea imagem pode ser equipado com uma tabela look-up de modelos de imagem 14. A segunda abordagem (reorientação numérico) é um pouco mais geral e se baseia na utilização dos anéis de difracção na imagem de holograma bidimensional para numericamente reconstruir o campo óptico deum número de (arbitrariamente) espaçados planos focais ao longo do volume da amostra. Existem vários métodos relacionados para fazer isto 6, o trabalho utiliza o Rayleigh-Sommerfeld para trás técnica de propagação, como descrito por Lee e Grier 5. O resultado deste procedimento é uma pilha de imagens que reproduzem o efeito de mudar manualmente o plano focal microscópio (daí o nome `reorientação numérica&quot;). Depois de uma pilha de imagens tiver sido gerada, a posição do objecto do volume focal deve ser obtida. Uma série de heurísticas de análise de imagem, como a variação da intensidade local ou conteúdo de freqüência espacial, foram apresentados para quantificar a nitidez de foco em diferentes pontos na amostra 15. Em cada caso, quando uma determinada imagem métrica é maximizada (ou minimizado), o objecto é considerado como estando em foco. Ao contrário de outros sistemas que procuram identificar um plano focal especial quando um objeto está &quot;em foco&quot;, o método neste trabalho escolhe pontos que se encontram no interior do objeto de interesse, que podem se estender através de uma ampla gama de planos focais. Esta abordagem é aplicável a uma ampla gama de sujeitos e é particularmente adequado para a estendida, amostras fracamente espalhamento (objectos de fase), tais como coloides de forma cilíndrica, as cadeias de bactérias ou flagelos eucariótica. Nestas amostras o contraste de imagem muda quando o objecto passa através do plano focal, uma imagem desfocada tem um centro de luz, se o objecto é, por um lado do plano focal e um centro escuro, se for por outro. Objetos puros têm pouco ou nenhum contraste quando mentem exatamente no plano focal. Este fenômeno de inversão de contraste tem sido discutido por outros autores 16,17 e é em última análise, devido à fase de Gouy anomalia 18. Este foi colocado em uma posição mais rigorosa no contexto da holografia em outros lugares, onde os limites da técnica são avaliados, a incerteza típica posição é da ordem de 150 nm (cerca de um pixel) em each Direcção 19. O método anomalia fase Gouy é um dos poucos sistemas Dihm bem definidos para determinar a estrutura de objetos estendidos em três dimensões, mas, no entanto, alguns objetos são problemáticas para reconstruir. Objetos que estão diretamente ao longo do eixo óptico (apontando para a câmera) são difíceis de reconstruir com precisão; incertezas no comprimento e posição do objeto se tornam grandes. Essa limitação é, em parte, devido à profundidade pouco restrito dos pixels de gravação do holograma (o número de níveis de cinza distintos que a câmera pode gravar). Outra configuração problemática ocorre quando o objeto de interesse é muito próximo do plano focal. Neste caso, as imagens reais e virtuais do objecto são reconstruídos em grande proximidade, dando origem a campos ópticos complicadas que são difíceis de interpretar. Uma segunda preocupação ligeiramente menos importante aqui é que as franjas de difracção resultantes ocupam menos do sensor de imagem, e deste inf granulação mais grossaormação conduz a uma reconstrução de pior qualidade. Na prática, um filtro simples gradiente é aplicado a volumes tridimensionais reconstruídos para detectar fortes inversões de intensidade ao longo da direcção de iluminação. Regiões onde a intensidade muda rapidamente do claro ao escuro, ou vice-versa, são, então, associada a regiões de dispersão. Objetos fracamente espalhamento são bem descrito como uma coleção de tais elementos não interagem 20; estes soma as contribuições individuais para dar ao campo espalhado total que pode ser facilmente invertida com o Rayleigh-Sommerfeld volta método de propagação. Neste papel, a intensidade da técnica de gradiente axial é aplicada a uma cadeia de células de Streptococcus. Os corpos celulares são objectos de fase (a espécie de E. coli tem um índice de refracção medido 21 a ser 1,384 a um comprimento de onda λ = 589 nm, a estirpe de Streptococcus é provável que seja semelhante) e aparecem como uma corrente de alta intensidade de bolhas ligados entre si em ºvolume da amostra e depois do filtro de gradiente de ter sido aplicada. Limiar e da característica de métodos padrão de extracção aplicados a este volume filtrado permitir a extracção de pixels volumétricos (voxels) que correspondem à região no interior das células. Uma vantagem particular deste método é que ele permite a reconstrução não ambígua da posição de um objecto, na direcção axial. Métodos similares (pelo menos, os que registram hologramas perto do objeto, fotografada através de uma objetiva de microscópio) sofrem de ser incapaz de determinar o sinal deste deslocamento. Embora o método de reconstrução de Rayleigh-Sommerfeld é também independente de sinal neste sentido, a operação de gradiente permite discriminar entre fracas objectos de fase acima e abaixo do plano focal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="780">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:180px;">Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope</td>
			<td style="width:187px;">Nikon Corp.</td>
			<td style="width:147px;"> </td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:180px;">LED</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">M660L3</td>
			<td style="width:267px;">emission wavelength &#955;=660 nm, linewidth approximately 20 nm </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">LED power supply</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">LEDD1B</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:180px;">Thread Adapter</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">SM2T2</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">Thread Adapter</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">SM1A2</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">Frame Grabber board</td>
			<td style="width:187px;">EPIX </td>
			<td style="width:147px;">PIXCI E4 </td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">High-Speed CMOS camera</td>
			<td style="width:187px;">Mikrotron</td>
			<td style="width:147px;">MC-1362</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital inline holographic microscopy (dihm) of weakly-scattering subjects

Objetos fracamente dispersão, tais como pequenas partículas coloidais ea maioria das células biológicas, são encontrados com freqüência em microscopia. Na verdade, uma série de técnicas têm sido desenvolvidas para melhor visualizar esses objetos de fase; contraste de fase e DIC estão entre os métodos mais populares para melhorar o contraste. No entanto, a posição de gravação e forma na direção out-of-imaging-plano continua sendo um desafio. Este relatório apresenta um método experimental simples para determinar com precisão a localização e geometria dos objetos em três dimensões, utilizando linha digitais microscopia holográfica (Dihm). De um modo geral, o volume da amostra é definido acessíveis por o tamanho do sensor de câmara na direcção lateral, e a coerência de iluminação na direcção axial. Volumes de amostras típicas variam de 200 um x 200 um x 200 fim usando iluminação por LED, para5 mm x 5 mm x 5 mm ou maior usando iluminação por laser. Esta luz de iluminação está configurado de tal modo que as ondas planas são incidente sobre a amostra. Objetos no volume da amostra, em seguida, dispersam a luz, o que interfere com a luz unscattered para formar padrões de interferência perpendicular à direção de iluminação. Esta imagem (holograma) contém a informação de profundidade necessária para a reconstrução tridimensional, e pode ser capturada num dispositivo de imagem padrão tais como CMOS ou CCD. O Rayleigh-Sommerfeld método propagação de volta é empregada para reorientar numericamente imagens de microscópio, e uma heurística de imagens simples, baseada na fase Gouy anomalia é utilizado para identificar espalhando objetos dentro do volume reconstruído. Este método simples, mas robusto resulta em uma medida inequívoca, sem modelo de localização e forma dos objetos em amostras microscópicas.

Para demonstrar as capacidades do Dihm, os experimentos foram realizados em uma cadeia de bactéria Streptococcus. A cadeia em si medido 10,5 milímetros de comprimento, e era composto por 6-7 células esférico-cilíndrica (duas das células na cadeia estão perto dividindo), com diâmetros na gama de 0,6-1 um. Figuras 1a e 1b mostram a interface principal da reconstrução e software de renderização. Exemplos do procedimento numérico reorientação são vistos na F...

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Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

As localizações tridimensionais dos objectos fracamente espalhamento pode ser identificada exclusivamente com linha digital de microscopia holográfica (Dihm), que envolve uma modificação menor para um microscópio padrão. Nosso software utiliza uma heurística de imagens simples juntamente com Rayleigh-Sommerfeld back-propagação para ceder a posição tridimensional e geometria de um objeto fase microscópica.

Digital em linha Holographic Microscopy (Dihm) de Assuntos Fracamente de dispersão

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

digital-inline-holographic-microscopy-dihm-weakly-scattering

Research

JoVE Journal

Biology

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

12.1K visualizações.  Harvard University.  As localizações tridimensionais dos objectos fracamente espalhamento pode ser identificada exclusivamente com linha digital de microscopia holográfica (Dihm), que envolve uma modificação menor para um microscópio padrão. Nosso software utiliza uma heurística de imagens simples juntamente com Rayleigh-Sommerfeld back-propagação para ceder a posição tridimensional e geometria de um objeto fase microscópica. 

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Determining heat and mechanical pain threshold in inflamed skin of human subjects

In a previous article in the Journal of Visualized Experiments we have demonstrated skin microdialysis techniques for the collection of tissue-specific nociceptive and inflammatory biochemicals in humans. In this article we will show pain-testing paradigms that are often used in tandem with microdialysis procedures. Combining pain tests with microdialysis provides the critical link between behavioral and biochemical data that allows identifying key biochemicals responsible for generating and propagating pain.
Two models of evoking pain in inflamed skin of human study participants are shown. The first model evokes pain with aid of heat stimuli. Heat evoked pain as described here is predominantly mediated by small, non-myelinated peripheral nociceptive nerve fibers (C-fibers). The second model evokes pain via punctuated pressure stimuli. Punctuated pressure evoked pain is predominantly mediated by small, myelinated peripheral nociceptive nerve fibers (A-delta fibers). The two models are mechanistically distinct and independently examine nociceptive processing by the two major peripheral nerve fiber populations involved in pain signaling.
Heat pain is evoked with aid of the TSA II, a commercially available thermo-sensory analyzer (Medoc Advanced Medical Systems, Durham, NC). Stimulus configuration and delivery is handled with aid of specific software. Thermodes vary in size and shape but in principle consist of a metal plate that can be heated or cooled at various rates and for different periods of time. Algorithms assessing heat-evoked pain are manifold. In the experiments shown here, study participants are asked to indicate at what point they start experiencing pain while the thermode in contact with skin is heated at a predetermined rate starting at a temperature that does not evoke pain. The thermode temperature at which a subject starts experiencing pain constitutes the heat pain threshold.
Mechanical pain is evoked with punctuated probes. Such probes are commercially available from several manufacturers (von Frey hairs). However, the accuracy of von Frey hairs has been criticized and many investigators use custom made punctuated pressure probes. In the experiments shown here eight custom-made punctuated probes of different weights are applied in consecutive order, a procedure called up-down algorithm, to identify perceptional deflection points, i.e., a change from feeling no pain to feeling pain or vice versa. The average weight causing a perceptional deflection constitutes the mechanical pain threshold.

Algorithms assessing heat and mechanical pain thresholds in experimentally inflamed skin of human study subjects are shown. The two pain testing paradigms independently examine nociceptive processing by the two major peripheral nerve fiber populations transmitting pain, i.e., non-myelinated C fibers and small myelinated A-delta fibers.

Determinar o calor e limiar de dor mecânica em pele inflamada de seres humanos

In a previous article in the Journal of Visualized Experiments we have demonstrated skin microdialysis techniques for the collection of tissue-specific ...

Biologia

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

A microfluídica digital para processamento automatizado Proteômica

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Simples massa de Leitura Digital de Ácido Nucleico Quantificação Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Magnético-ativado da pilha classificação estratégias para isolar e purificar sinovial fluidos derivados mesenquimais células-tronco de um modelo de coelho

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

Técnicas de fenotipagem mícron-escala de milho feixes vasculares, com base na tomografia computadorizada de Microcomputed de raio-x

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparação de amostras biológicas por congelamento de alta pressão, realce de contraste assistida por microondas e resina mínima incorporação para a imagem latente de Volume

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.