Gostaríamos de reconhecer que esta técnica foi descrita originalmente por Sparta et al., 2012 e foi facilmente adaptado para uso em nosso laboratório.

* Todos os materiais, juntamente com respectivos fabricantes e / ou fornecedores estão listados a seguir o protocolo. 1. Assembleia de Implante <ol><li> Prepara-se uma mistura de calor epoxi curável de fibra óptica através da adição de 100 mg de endurecedor a 1 g de resina. </li><li> Medir e cortar aproximadamente 35 mm de 125 fibra óptica com 100 mM mM núcleo marcando-lo com um escriba carboneto cunha ponta. Posicione o escriba perpendicular à fibra óptica e pontuação em um movimento único unidirecional. Cortando a fibra completamente irá danificar o núcleo da fibra. </li><li> Insira uma cerâmica LC ponteira com um 127 mM levavam para o vice, lado convexo apontou para baixo. </li><li> Insira o de fibra óptica no ponteira. A fibra óptica deve deslizar suavemente e marginalmente se projetam além do final convexa da ponteira (Figura 1a). </li><li> Aplique uma gota de calor curável epóxi fibra óptica para a extremidade plana e calor com a arma de fogo até epóxi fica preta. O epóxi deveencher a virola como ele é aquecido e antes da cura. O epóxi deve curar dentro de ~ 1 min de aplicação de calor constante. </li><li> Limpar qualquer epoxi ao longo dos lados da manga, uma vez que irá dificultar a interface com o acoplador. </li><li> Polir a extremidade convexa da virola com um disco de polimento LC fibra óptica (FOPD) em folhas de alumínio óxido de polimento sobre a almofada de polimento (Figura 1b). Fazer padrões circulares de rotação e polonês em quatro graus, na seguinte ordem: 5, 3, 1 grão mM 0,3. </li><li> Cortar a fibra óptica na extremidade plana com o comprimento adequado de tal forma que tem como alvo a região de interesse. O comprimento pode ser determinado utilizando o atlas estereotáxico. </li><li> Testar o implante, ligando-a a laser, através do cabo de acoplamento descrito abaixo. A extremidade polida do implante é inserido na manga do dispositivo de acoplamento e deve entrar directamente em contacto com a virola de oposição. O implante deve ser capaz de manter a 10 mW de saída de luz, medida na extremidade do thfibra implante e. Um implante mau terá um ponto fraco focal próximo da ponta da fibra óptica. </li><li> Armazenar os implantes acabados (Figura 1c) de espuma, até utilização. </li></ol> 2. Assembleia de Cabo Acoplador de fibra óptica <ol><li> Prepara-se uma mistura de calor epoxi curável de fibra óptica como descrito acima. </li><li> Meça e corte um comprimento adequado de 220 fibra óptica com 200 mM mM núcleo marcando-lo com um escriba carboneto de cunha ponta. O comprimento da fibra deve permitir que o rato se mover livremente em torno da caixa, mas não permitem que o rato para mastigar através da fibra. </li><li> Inserir a fibra óptica para um comprimento de tubagem de furca ligeiramente mais longo do que o comprimento da fibra óptica. O tubo deve ter um diâmetro interior ligeiramente maior do que a da fibra óptica. </li><li> Faixa ~ 25mm em uma das extremidades da fibra óptica e inseri-la na extremidade de metal de um MM FC Multimode virola Assembly com 230 uM furo até que pare. A fibra óptica deve ficar fora através da ferrule final (Figura 2a). </li><li> Assegurar a ligação com o cianoacrilato (super-cola) na extremidade de metal. Cubra a conexão com um conector de inicialização e polir a final com uma ponteira FOPD FC. Fazer padrões circulares de rotação e polimento em quatro graus na seguinte ordem: 5, 3, 1, 0,3 mM grão (Figura 2b). </li><li> Tira e insira a outra extremidade da fibra óptica para uma cerâmica LC virola (230 uM ID furo) com a extremidade distal convexa. Aplicar uma gota de epóxido para a extremidade plana e calor até a cura. </li><li> Polir a extremidade convexa da virola com um FOPD FC em folhas de alumínio óxido de polimento como descrito acima. </li><li> Deslizar a manga LC virola sobre a extremidade convexa do casquilho até ao ponto médio da manga. </li><li> Lugar tubo termorretráctil sobre o tubo de bifurcação e manga e calor para fixar e proteger a ligação (Figura 2c). </li><li> Testar o acoplador, ligando-a à fonte de laser e de medição da luz output através do acoplador com um espectrofotómetro. A perda de luz entre a saída do laser e o acoplador de saída medido não deve exceder 30%. </li></ol> 3. Implantação cirúrgica * Este é um procedimento pontas apenas. Instrumentos são estéreis mas as luvas não precisam ser devido a manipulação constante entre os instrumentos e equipamentos. <ol><li> Anestesiar o rato com uma injecção intraperitoneal mistura ketamina / xilazina 100 e 10 mg / kg, respectivamente, utilizando uma agulha de calibre 30. </li><li> Raspar o couro cabeludo com clippers. Limpar o couro cabeludo, com 70% de álcool isopropílico seguida de Betasept limpar (solução de clorexidina a 4%) durante dois minutos, repetindo-se uma vez. </li><li> Posicione o mouse na plataforma sterotaxic e proteger a cabeça, garantindo que o crânio é de nível. Aplicar pomada oftálmica nos olhos para evitar a secura e dor pós-operatória. Manter a anestesia usando% isoflurano (1-3 volatilizados diluído com o oxigênio, dependendo do estado fisiológico do mouse, o qual deve ser continuamente monitorizado por resposta a uma pitada de cauda). </li><li> Fazer uma incisão pela linha média do couro cabeludo, expondo o crânio das órbitas oculares de lambda. Afastar do tecido conjuntivo, como necessário. </li><li> Use grampos Serafin para segurar a pele e manter um acesso ao crânio (Figura 3a). </li><li> Um padrão quadriculado Etch toda a superfície do crânio com uma palheta dental. Lave os detritos com uma solução salina estéril. Seque bem. </li><li> Aplicar o peróxido de hidrogénio (3%) ao crânio exposta com uma mecha de algodão para ~ 2-3 segundos para criar microporos. Lave várias vezes e seque bem. Alternativamente, as âncoras pode ser aparafusado na cavidade craniana, como descrito em Sparta et al. (2012). </li><li> Novamente, um padrão xadrez etch todo o crânio com uma picareta dental e lavar os detritos com solução salina. Seque bem. </li><li> Usando uma ferramenta rotativa, fazer um pequeno orifício de trepanação craniotomia (&lt;1 mm de diâmetro) com uma broca estéril(Autoclavado) acima da região de interesse, determinada pelo atlas estereotáxico calibrado para bregma e lambda. Tenha cuidado para não quebrar a dura ou danificar qualquer tecido. Lave e seque bem os detritos. </li><li> Insira a ponteira de fibra óptica (implante) para o suporte da sonda e ligar para o braço estereotáxico. </li><li> Posicionar o implante no local directamente acima da região de interesse, utilizando o braço estereotáxico (Figura 3b). Se a inserção da fibra óptica no tecido cerebral, a fibra deve ser avançada lentamente, a uma taxa de ~ 2 mm / min. A ponteira deve descansar no crânio restante. </li><li> Prepara-se uma mistura de cimento dentário. A mistura deve ter uma viscosidade suficientemente baixa para aplicar facilmente através do crânio. Mistura será utilizável para 2-4 min. </li><li> Utilizando um palito estéril, aplicar uma camada fina e uniforme de cimento dentário através do crânio e para a porção inferior do implante. A camada de base de cimento dental deve cobrir área de superfície, tanto no crânio comopossível. Não deixe que o cimento dental entrar em contacto com a pele do rato. Isto levará a dificuldade acrescida de sutura, bem como irritação para o rato. Se o cimento dental não entrar em contacto com a pele, permitir a secar parcialmente de tal forma que toda a camada de cimento pode ser retirada antes do ajuste. </li><li> Deixe-a secar completamente. </li><li> Aplicar até mesmo camadas de cimento dentário para formar um pequeno monte por cima do crânio e em torno do implante, permitindo que cada camada secar completamente (Figura 3c). Deixar ~ 3-5 mm da extremidade convexa da ponteira limpa de cimento para permitir uma ligação suave e desobstruído. </li><li> Suturar o couro cabeludo sobre o monte de cimento dentário e em torno do implante usando suturas estéreis, de uso único de seda entrançada (6-0) com uma agulha de C22. Remover após 7 dias. Opcional: Bond Vet Uso para ligação adicional após a sutura. Certifique-se de usar de Bond Vet mínimo. O excesso pode levar a danos na pele graves devido a arranhões. </li><li> Immediately após a cirurgia, o rato deve ser injectado por via subcutânea com Ketprophen (5 mg / kg) para diminuir a dor no pós-operatório. Isto deve ser repetido 24 horas depois. Aplicar analgésicos tópicos (Bupivicaine) e antibióticos (Neosporin) para a pele suturada e em torno da base do implante. </li><li> Posicione o mouse em uma gaiola sobre uma manta de aquecimento para a recuperação da anestesia. Posicione o mouse em uma gaiola estéril, recuperação pós-operatória. A gaiola de recuperação não deve conter qualquer cama a fim de manter a temperatura e evitar a asfixia. O rato pode ser devolvida à gaiola original ou uma nova gaiola uma vez acordado. </li></ol> Montagem adequada do implante de fibra óptica e os resultados do acoplador na perda de fotões mínima entre a fonte de luz e a extremidade da fibra óptica na região de interesse. Ótica bem polidas fibra devem transmitir a luz em um uniforme, círculo concêntrico (Figura 2d). Com a implantação cuidadosa e sutura, o implante não causa irritação visívelo rato e pode permanecer no lugar por estudos de longo prazo (Figura 3D,&gt; 1 mês, observações não publicadas), sem qualquer degradação significativa da fibra óptica ou da quantidade de luz transmitida. Implantação inadequada ou sutura pode causar irritação e pode resultar no rato arranhões através do seu couro cabeludo, expondo o cimento dentário, ou quebra da ponteira do cimento dental devido à manipulação persistente. Um diagrama esquemático do sistema montado pode ser visto na Figura 4. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig1.jpg" /> Figura 1. Assembleia da fibra óptica implantáveis. (A) A fibra óptica é inserido na manga, ligeiramente saliente para além da extremidade convexa indicada pela seta. (B) A extremidade convexa da virola é polida utilizando um FOPD em graus progressivamente mais finos de folhas de polimento. (C) O opt fibra acabado implantávelIC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50004/50004fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig2.jpg" /> Figura 2. Montagem do acoplador de fibra óptica utilizado para amarrar o conjunto rotativo de fibra óptica para o implante. (A) a aderência fibra óptica através do conjunto ponteira. (B) O lado da virola do conjunto é inserido nos graus FOPD e polidas usando progressivamente mais finas de papel de lustro. (C) A manga ponteira é colocada sobre a manga e fixada com um tubo de retracção térmica. (D) O acoplador de fibra óptica deve terminar produzem uma luz concêntrico com perda mínima de fotões. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig3.jpg" /> Figura 3. Implante cirúrgico das fibras ópticas. (A) A superfície total do cranium é exposta e o tecido conjuntivo é apagada. (B) O implante de fibra óptica é mantida em posição com o braço estereotáxico. (C) de cimento dental é aplicado fixação do implante de fibra óptica ao crânio. (D)&gt; 1 mês após a implantação, a pele tenha cicatrizado em torno do implante e não existem sinais de irritação. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig4.jpg" /> Figura 4. Diagrama esquemático do sistema funcional

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	<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neuronal+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Light-Induced+Activation+of+Neural+Circuitry+in+Trangenic+Mice+Expressing+Channelrhodopsin-2.">In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54, 205-218 (2007).</li><li>Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics.">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 165-16 (2010).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li><li>Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+and+imaging+technologies+for+circuit+based+neuroanatomy.">Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy.</a> Nature. 461, 900-907 (2009).</li><li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits:+technology+for+probing+mammalian+brain+structures.">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).</li><li>Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+of+awakening+probed+with+optogenetic+control+of+hypocretin+neurons.">Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons.</a> Nature. 450, 420-424 (2007).</li><li>Sparta, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits.">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).</li><li>Stuber, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+transmission+from+the+amygdala+to+nucleus+accumbens+facilitates+reward+seeking.">Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking.</a> Nature. 475, 377-380 (2011).</li><li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+stimulation+of+a+hippocampal+engram+activates+fear+memory+recall.">Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall.</a> Nature. 484, 381-385 (2012).</li></ol>

Optogenética é uma nova e poderosa técnica que permite o controle sem precedentes sobre subtipos específicos de neurônios. Isto pode ser explorado para modular os circuitos neurais com precisão anatómica e temporal, evitando ao mesmo tempo o tipo de célula indiscriminada e efeitos invasivas de estimulação eléctrica através de um eléctrodo. O implante de fibras ópticas permite uma estimulação consistente e crónica dos circuitos neurais mais sessões múltiplas em desperto, comportando camundongos com dan...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente ou Equipamento </td><td> Companhia </td><td> Catálogo # </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> LC Manga Ferrule </td><td> Fibra produtos de precisão (PFP) </td><td> SM-CS125S </td><td> 1,25 mm ID </td></tr><tr><td> FC MM pré-montados Conector </td><td> PFP </td><td> MM-CON2004-2300 </td><td> 230 mM Virola </td></tr><tr><td> Miller FOPD-LC Disco </td><td> PFP </td><td> M1-80754 </td><td> Para LC virolas </td></tr><tr><td> Tubulação de furca </td><td> PFP </td><td> FF9-250 </td><td> 900 ^ M od, 250 uM ID </td></tr><tr><td> MM LC Vara Virola 1,25 milímetros </td><td> PFP </td><td> MM-FER2007C-1270 </td><td> ID 127 mM Diâmetro </td></tr><tr><td> MM LC Vara Virola 1,25 milímetros </td><td> PFP </td><td> MM-FER2007C-2300 </td><td> 230 mMID Diâmetro </td></tr><tr><td> Heat-curável epóxi, resina e endurecedor </td><td> PFP </td><td> ET-353ND-16OZ </td><td></td></tr><tr><td> FC / PC e SC / PC Conector Disk Polimento </td><td> Thorlabs </td><td> D50-FC </td><td> Para o FC virolas </td></tr><tr><td> Potência óptica digital e medidor de energia </td><td> Thorlabs </td><td> PM100D </td><td> Espectrofotômetro </td></tr><tr><td> Polir </td><td> Thorlabs </td><td> NRS913 </td><td> 9 &quot;x 13&quot; 50 Durômetro </td></tr><tr><td> Óxido de alumínio lapidação (polimento) Folhas: 0,3, 1, 3, 5 grits mM </td><td> Thorlabs </td><td> LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P </td><td></td></tr><tr><td> Fibra Revestimento rígido padrão Multimodo </td><td> Thorlabs </td><td> BFL37-200 </td><td> OH baixo, 200 Núcleo uM, 0,37 NA </td></tr><tr><td> Ferramenta de descascamento da fibra </td><td> Thorlabs </td><td> T10S13 </td><td> Clad / Coem: 200 um 300 um / </td></tr><tr><td> SÍLICA / sílica de fibra óptica </td><td> Polymicro Technologies </td><td> FVP100110125 </td><td> Alta-OH, UV Enhanced, 0,22 NA </td></tr><tr><td> 1x1 Conjunto Fiberoptic Rotary </td><td> lentes dóricas </td><td> FRJ_FC-FC </td><td></td></tr><tr><td> Mono Fiberoptic Patchcord </td><td> lentes dóricas </td><td> MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC </td><td></td></tr><tr><td> Dissipadores de calor, tubos 1/8 polegada </td><td> Aliado Eletrônica </td><td> 689-0267 </td><td></td></tr><tr><td> Pistola de calor </td><td> Aliado Eletrônica </td><td> 972-6966 </td><td> 250 W; 750-800 ° F </td></tr><tr><td> Algodão derrubou aplicadores </td><td> Puritano Medical Products Company </td><td> 806-WC </td><td></td></tr><tr><td> Adesivo de tecido VetBond </td><td> Fischer Scientific </td><td> 19-027136 </td><td></td></tr><tr><td> Flash acrílica para base de prótese </td><td> Yates Motloid </td><td> ColdPourPowder + Liq </td><td></td></tr><tr><td> BONN Miniatura Iris Tesoura </td><td> Miltex Integra </td><td> 18-1392 </td><td> 3-1/2 &quot;(8,9 centímetros), em linha reta, 15 lâminas milímetros </td></tr><tr><td> Johns Hopkins Bulldog Grampo </td><td> Miltex Integra </td><td> 7-290 </td><td> 1-1/2 &quot;(3,8 cm), curvada </td></tr><tr><td> MEGA-Torque Elétrica Laboratório Motor </td><td> Vetor </td><td> EL-S </td><td></td></tr><tr><td> Pantera Burs-Bola 1 </td><td> Clarkson Laboratório </td><td> 77,1006 </td><td></td></tr><tr><td> Violet Blue Laser System </td><td> CrystaLaser </td><td> CK473-050-O </td><td> Comprimento de onda: 473 nm </td></tr><tr><td> Laser Alimentação </td><td> CrystaLaser </td><td> CL-2005 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont n º 2 Fórceps laminectomia </td><td> FFerramentas ine Ciência </td><td> 11223-20 </td><td></td></tr><tr><td> Sonda </td><td> Belas Science Tools </td><td> 10140-02 </td><td></td></tr><tr><td> 5 Hemostat &quot;Straight </td><td> Excelta </td><td> 35-PH </td><td></td></tr><tr><td> Vise com base ponderada </td><td> Altex Eletrônica </td><td> PAN381 </td><td></td></tr></tbody></table>

fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue

Elucidando padrões de conectividade neuronal tem sido um desafio para a neurociência clínica e básica. Eletrofisiologia tem sido o padrão ouro para analisar padrões de conectividade sináptica, mas emparelhados registros eletrofisiológicos pode ser tanto complicado e experimentalmente limitante. O desenvolvimento de Optogenetics introduziu um método elegante para estimular os neurónios e circuitos, tanto in vitro e in vivo 1 2,3. Ao explorar tipo de célula-atividade do promotor específico para dirigir a expressão opsina em discretos populações neuronais, pode-se precisamente estimular geneticamente definidas subtipos neuronais em circuitos distintos 4-6. Métodos bem descritos para estimular os neurônios, incluindo a estimulação elétrica e / ou manipulações farmacológicas, são muitas vezes de células do tipo indiscriminada, invasivo e pode danificar os tecidos circundantes. Estas limitações podem alterar a função sináptica normal e / ou o comportamento do circuito. Além disso, devidoa natureza da manipulação, os métodos actuais são, muitas vezes aguda e terminal. Optogenetics proporciona a capacidade de estimular os neurónios de uma maneira relativamente inócua, e em neurónios alvo geneticamente. A maioria dos estudos in vivo envolvendo em Optogenetics actualmente utilizar uma fibra óptica guiada através de uma cânula implantada 6,7, no entanto, limitações deste método incluem o tecido cerebral danificado com inserção repetida de uma fibra óptica, e quebra potencial da fibra no interior da cânula. Dada a florescente campo de optogenética, um método mais confiável de estimulação crônica é necessária para facilitar estudos de longo prazo com o mínimo de danos colaterais tecido. Aqui nós fornecemos nosso protocolo modificado tal como um artigo de vídeo para complementar o método eficaz e elegante descrito em Sparta et al. 8 para o fabrico de um implante de fibra óptica e a sua fixação permanente sobre o crânio de ratos anestesiados, assim como a montagem do fibraacoplador óptico de ligar o implante a uma fonte de luz. O implante, conectado com fibras ópticas a um laser de estado sólido, permite um método eficiente para cronicamente photostimulate circuito neuronal funcional com menos danos do tecido 9 usando pequenos destacáveis, amarras. Fixação permanente dos implantes de fibra óptica fornece consistentes, a longo prazo, em estudos in vivo optogenética de circuitos neuronais em ratos acordados, comportando 10 a uma lesão tecidual mínima.

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Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

O desenvolvimento de Optogenetics agora fornece os meios para estimular precisamente neurônios geneticamente definidas e circuitos, tanto<em&gt; In vitro</em&gt; E<em&gt; In vivo</em&gt;. Aqui, descrevemos a montagem e implantação de uma fibra óptica para fotoestimulação crônica do tecido cerebral.

Implantação de fibra óptica para Estimulação Crônica optogenética do Tecido Cerebral

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

fiber-optic-implantation-for-chronic-optogenetic-stimulation-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

44.4K visualizações.  Baylor College of Medicine (BCM). O desenvolvimento de Optogenetics agora fornece os meios para estimular precisamente neurônios geneticamente definidas e circuitos, tanto In vitro E In vivo. Aqui, descrevemos a montagem e implantação de uma fibra óptica para fotoestimulação crônica do tecido cerebral.

Vídeo: Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Combining Transcranial Magnetic Stimulation and fMRI to Examine the Default Mode Network

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful rest."1,2,3 It is thought the default mode network corresponds to self-referential or "internal mentation".2,3
It has been hypothesized that, in humans, activity within the default mode network is correlated with certain pathologies (for instance, hyper-activation has been linked to schizophrenia 4,5,6 and autism spectrum disorders 7 whilst hypo-activation of the network has been linked to Alzheimer's and other neurodegenerative diseases 8). As such, noninvasive modulation of this network may represent a potential therapeutic intervention for a number of neurological and psychiatric pathologies linked to abnormal network activation. One possible tool to effect this modulation is Transcranial Magnetic Stimulation: a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.9
In order to explore the default mode network's propensity towards and tolerance of modulation, we will be combining TMS (to the left inferior parietal lobe) with functional magnetic resonance imaging (fMRI). Through this article, we will examine the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools.

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the combination of TMS and fMRI to examine the effects of brain stimulation on the default network.

Combinando Estimulação Magnética Transcraniana e fMRI para o Exame da rede de modo padrão

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful ...

Neurociência

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS: Usando o protocolo Theta-Burst para Explorar Mechasnism de Plasticidade em Indivíduos com Síndrome do X Frágil e Autismo

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.1,2 Within the field of TMS, the term state dependency refers to the initial, baseline condition of the particular neural region targeted for stimulation. As can be inferred, the effects of TMS can (and do) vary according to this primary susceptibility and responsiveness of the targeted cortical area.3,4,5

In this experiment, we will examine this concept of state dependency through the elicitation and subjective experience of motive phosphenes. Phosphenes are visually perceived flashes of small lights triggered by electromagnetic pulses to the visual cortex. These small lights can assume varied characteristics depending upon which type of visual cortex is being stimulated. In this particular study, we will be targeting motive phosphenes as elicited through the stimulation of V1/V2 and the V5/MT+ complex visual regions.6

In this article, we examine the effects of visually relevant state dependency on TMS induced motive phosphenic presentations.

Estado de dependência-Efeitos sobre a TMS: Um olhar sobre Comportamento fosfeno Motive

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

The NeuroStar TMS Device: Conducting the FDA Approved Protocol for Treatment of Depression

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic fields. These rapidly alternating fields induce electrical currents within localized, targeted regions of the cortex which are associated with various physiological and functional brain changes.1,2,3
In 2007, O'Reardon et al., utilizing the NeuroStar device, published the results of an industry-sponsored, multisite, randomized, sham-stimulation controlled clinical trial in which 301 patients with major depression, who had previously failed to respond to at least one adequate antidepressant treatment trial, underwent either active or sham TMS over the left dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). The patients, who were medication-free at the time of the study, received TMS five times per week over 4-6 weeks.4
The results demonstrated that a sub-population of patients (those who were relatively less resistant to medication, having failed not more than two good pharmacologic trials) showed a statistically significant improvement on the Montgomery-Asberg Depression Scale (MADRS), the Hamilton Depression Rating Scale (HAMD), and various other outcome measures. In October 2008, supported by these and other similar results5,6,7, Neuronetics obtained the first and only Food and Drug Administration (FDA) approval for the clinical treatment of a specific form of medication-refractory depression using a TMS Therapy device (FDA approval K061053).
In this paper, we will explore the specified FDA approved NeuroStar depression treatment protocol (to be administered only under prescription and by a licensed medical profession in either an in- or outpatient setting).

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the FDA approved depression treatment protocol using the Neuronetics NeuroStar TMS device.

O dispositivo NeuroStar TMS: Conduzindo a FDA Aprovado protocolo para o tratamento da depressão

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Transdução Viral seletiva de Adultos-nascido neurônios olfativos de crônica In vivo Estímulo Optogenetic

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenética estimulação do comportamento de fuga em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

A estimulação optogenética do nervo auditivo

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Microelectrode Guided Implantation of Electrodes into the Subthalamic Nucleus of Rats for Long-term Deep Brain Stimulation

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, dystonia or tremor. DBS is based on the delivery of electrical stimuli to specific deep anatomic structures of the central nervous system. However, the mechanisms underlying the effect of DBS remain enigmatic. This has led to an interest in investigating the impact of DBS in animal models, especially in rats. As DBS is a long-term therapy, research should be focused on molecular-genetic changes of neural circuits that occur several weeks after DBS. Long-term DBS in rats is challenging because the rats move around in their cage, which causes problems in keeping in place the wire leading from the head of the animal to the stimulator. Furthermore, target structures for stimulation in the rat brain are small and therefore electrodes cannot easily be placed at the required position. Thus, a set-up for long-lasting stimulation of rats using platinum/iridium electrodes with an impedance of about 1 M&#937; was developed for this study. An electrode with these specifications allows for not only adequate stimulation but also recording of deep brain structures to identify the target area for DBS. In our set-up, an electrode with a plug for the wire was embedded in dental cement with four anchoring screws secured onto the skull. The wire from the plug to the stimulator was protected by a stainless-steel spring. A swivel was connected to the circuit to prevent the wire from becoming tangled. Overall, this stimulation set-up offers a high degree of free mobility for the rat and enables the head plug, as well as the wire connection between the plug and the stimulator, to retain long-lasting strength.

A method for implanting electrodes into the subthalamic nucleus (STN) of rats is described. Better localization of the STN was achieved by using a microrecording system. Furthermore, a stimulation set-up is presented that is characterized by long-lasting connections between the head of the animal and the stimulator.

Microeletrodos guiada implantação de eletrodos no subtalâmica Núcleo de Ratos por longo prazo Estimulação Profunda do Cérebro

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo optogenética Dissection de Circuitos medo no cérebro Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...