Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas (NIDA) concessão R01 DA24040 (DCC) da Universidade do Colorado Inovador Grant Seed (DCC), e NIDA bolsa de formação T32 DA017637 (MVB).

1. Vírus Armazenamento e Preparação <ol><li> O uso de vetores de AAV incompetente de replicação para a entrega de genes opsina para roedor cérebro é aprovado para Biossegurança Nível 1 (BSL-1) e exige uma protecção adequada e procedimentos de manuseio, conforme descrito na publicação governo dos EUA, Biossegurança em Laboratórios de Microbiologia e Biomédicas, disponível em os Centros de Controle de Doenças do site em ( <a href="http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm" target="_blank">http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm</a> ). </li><li> A fim de evitar os ciclos de congelamento e descongelamento repetidos, vírus pipeta de frasco do fabricante em menores alíquotas de trabalho em uma Classe II Biossegurança Gabinete e armazenar em um freezer -80 ° C. </li><li> Antes da injeção estereotáxica, permitir uma alíquota para descongelar em gelo e, em seguida, girar rapidamente para baixo com uma centrífuga de bancada. </li><li> Lentamente aterrar uma seringa Hamilton e uma agulha de vidro com uma pequena quantidade de óleo mineral ou de silicone.Certifique-se de que não há bolhas de ar visíveis no corpo da seringa. Insira a seringa uma bomba microinjetor e anexar a bomba diretamente para o braço estereotáxico vertical (ie manipulador estereotáxica). </li><li> Abaixar o braço estereotáxico até que a ponta da agulha atinge a parte inferior do tubo alíquota do vírus. Usar o controlador para a bomba de microinjector para retirar o volume desejado de vírus (1,5 ul de uma injecção de 1 uL). </li><li> Todo o material e as superfícies que entram em contato com o vírus devem ser descontaminados com um desinfectante, como água sanitária (10%). </li></ol> 2. Cirurgia e Vírus Injeção <ol><li> Anestesiar animais com uma mistura de cetamina (rato, e 125 mg / kg, ip) - xilazina (rato, 10 mg / kg, ip) coquetel. Para avaliar a eficácia da anestesia, verificar a existência de uma resposta reflexa a uma pitada dedo do pé e dar doses suplementares de cetamina, se necessário. Usando métodos cirúrgicos assépticas padrão, coloque animais em um aparelho estereotáxico (David Kopf Emtrumentos). </li><li> Fazer uma incisão na linha média através da pele na parte superior do crânio dos animais com pequenas tesouras cirúrgicas ou bisturi. Delicadamente separar tecido conjuntivo e limpar a parte superior do crânio com uma pequena espátula de osso. </li><li> Verifique se a cabeça do animal é o nível tal que o z coordenadas para bregma e lambda são iguais. Determinar as coordenadas estereotáxica para a área do cérebro o alvo de um atlas do cérebro, como o cérebro de um rato em estereotáxica Coordenadas (George Paxinos e Charles Watson, Academic Press, 2007) ou The Mouse Cérebro em estereotáxica Coordenadas (Keith BJ Franklin e George Paxinos, Academic Press , 2007). Marque o local pretendido de injeção com uma caneta cirúrgica. </li><li> Cuidadosamente fina do crânio sobre a área do alvo usando uma broca de mão e parar quando a broca atinge a parte inferior do crânio. Utilizando um par de pinças extra fino, remover o osso diluído a fim de expor a dura. </li><li> Posicione a agulha da seringa sobre o alvo sãoum e abaixe a agulha até que ela toque a dura-máter e usar esse ponto para calcular a coordenada z. Reduzir-se muito lentamente a agulha de injecção para dentro do cérebro até a posição correcta z é atingido. Neste protocolo, a região prelimbic do córtex pré-frontal medial (2,7 mm anterior a bregma, ± 0,5 mm lateral à linha média, e -2,2 mm da dura) ou o subiculum dorsal (-6,0 mm anterior ao bregma, ± 3,0 mm lateral com a linha média, e -2,0 mm da dura) é alvo de um adulto masculino Sprague Dawley (aprox. 275 g). </li><li> Injectar o vírus, a uma taxa de 0,1 mL / min. Após a injecção está terminada esperar 10 minutos antes de se retirar a agulha a fim de evitar o refluxo do vírus à superfície do cérebro. </li><li> Use uma sutura de costura com agulha para selar a pele e aplicar antibióticos para a ferida. </li><li> O curso do tempo da expressão funcional ChR2 e NpHR de vectores de AAV podem variar, dependendo do desenho experimental e título viral. Para esta experiência, in vivo </em&gt; gravações foram realizadas 18-21 dias após a injecção. </li></ol> 3. Entrega Luz e de Gravação vivo de ChR2 ou NpHR-expressando neurônios <ol><li> Anexar um eletrodo de tungstênio (~ 1-1,5 mohms, microprobes) a um tubo capilar de vidro (Fisher Scientific) com super-cola. </li><li> Use uma ferramenta de fibra de descascamento (Thorlabs) para expor a extremidade nua de uma fibra multimodo óptico (200 núcleo um de diâmetro, Thorlabs) e ponta de fibra limpa com etanol. Muito levemente marcar ponta de fibra com uma faca de diamante em forma de cunha (Thorlabs) e remova cuidadosamente o excesso de fibras (por exemplo, com uma pinça fina). A fibra deve decompor facilmente no placar. </li><li> Ligue o FC extremidade da fibra para o conector de PC na porta de um único laser de díodo 200 mW (saída <a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ) com o comprimento de onda desejado. Certifique-se de que óculos de proteção apropriado é usado em todos os momentos em que o trabalho com lasers. </li><li> Meça a lintensidade aser na ponta da fibra óptica utilizando um medidor de potência óptica ( <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ). Para in vivo gravações, a intensidade da luz tão pouco quanto 20-100 mW / mm 2 pode evocar confiavelmente ChR2-ou activação ou silenciamento NpHR-mediada, respectivamente, da actividade neuronal. </li><li> Inserir a fibra óptica no interior do tubo capilar. Posicione a ponta da fibra de aproximadamente 500 mm acima da ponta do eletrodo de tungstênio e amarrar um fio de sutura fina duas vezes em alguns pontos perto da ponta para que o eletrodo ea fibra são retas. Certifique-se de que a distância entre a ponta do eléctrodo e do nó mais próximo é o tempo suficiente para a inserção da região alvo. </li><li> Prepare o animal tal como nos passos 2.1 e 2.2 acima. Use a craniotomia inicial como um guia para fazer uma nova janela pequena limpo no crânio para o posicionamento do optrode ( <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ). Fazer uma pequena incisão na parte dura usando uma agulha fina. </li><li> Cuidadosamente abaixe o optrode através da janela do crânio e no cérebro para a região transduzidas usando um micromanipulador (Narishige). Em seguida, avançar o optrode lentamente em 10-50 mM passos até o surgimento de uma célula de luz responsivo. </li><li> A interface de usuário do software personalizado (NeuroLux Pro <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ) escrito em LabVIEW (National Instruments) é usado para controlar o laser de diodo única e para visualizar e gravar a atividade neural em curso. Sinais gravados são capturados com um Examp-20K (Kation Científica) amplificador passa-banda-filtrada (0,3-8 kHz), e um análogo da National Instruments para lousa digital (NI USB-6009). A interface de usuário NeuroLux Pro permite a escolha de entradas analógicas (escolher dois canais para o sinal neuronal e TTL) e saída digital. O usuário pode definir a taxa de amostragem (20 kHz), o período de linha de base (pré-light), e pós-luz. O usuário pode definir o stimulati a laser TTLem largura de pulso, freqüência e período de estimulação (se a freqüência é de 20 Hz e estimulação período é de 500 ms, 10 pulsos de laser com largura de pulso definida são entregues). O usuário também pode escolher a entrega de luz contínua (por exemplo, Figura 1). Para gravações repetidas, o usuário também pode definir o número de trens de pulsos eo intervalo entre trens. Os dados podem ser adquiridos com ou sem gravação em disco. </li><li> Após a gravação, os animais são anestesiados com o cocktail de cetamina / xilazina e perfundidos transcardialmente com soro fisiológico e paraformaldeído (4%), a fim de verificar a colocação optrode e expressão de opsina. </li></ol>

<ol>
	<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-color+optical+activation,+silencing,+and+desynchronization+of+neural+activity+with+single-spike+temporal+resolution.">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution.</a> PLoS One. 2 (3), e299 (2007).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses.">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li><li>Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+of+awakening+probed+with+optogenetic+control+of+hypocretin+neurons.">Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons.</a> Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).</li><li>Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics in the nonhuman primate.</a> Prog Brain Res. 196, 215-233 (2012).</li><li>Zhao, S., Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li><li>Madisen, L., Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-activation+and+silencing.">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-activation and silencing.</a> Nat Neurosci. 15 (5), 793-802 (2012).</li><li>Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, e. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+patterns+in+the+localization+of+glutamic+acid+decarboxylase+and+Ca2+/calmodulin+protein+kinase+gene+expression+in+the+rat+central+nervous+system.">Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system.</a> Neuroscience. 46 (4), 825-849 (1992).</li><li>McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+vectors+in+the+CNS.">Adeno-associated virus (AAV) vectors in the CNS.</a> Curr Gene Ther. 5 (3), 333-338 (2005).</li><li>Cardin, J. A., Carlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+local+circuits+in+vivo:+Integrated+optogenetic+and+electrophysiology+approaches+for+exploring+inhibitory+regulation+of+cortical+activity.">Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity.</a> J Physiol Paris. 106 (3-4), 104-111 (2012).</li><li>Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+optogenetic+silencing+of+orexin/hypocretin+neurons+induces+slow-wave+sleep+in+mice.">Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice.</a> J Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).</li><li>Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+optogenetic+control.">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).</li><li>Chow, B. Y., Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps.">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Uma grande variedade de técnicas estão disponíveis para geneticamente visando genes microbianos opsina para regiões cerebrais distintas em roedores. Entrega do gene viral fornece uma abordagem relativamente barata e rápida para mediar ChR2 e NpHR expressão com o tipo de célula especificidade. Os sistemas de vector de AAV são uma opção comum para utilização em experiências optogenetic devido a títulos elevados de produção que se mantêm estáveis ​​durante o armazenamento, a sua falta de patogenicidade, e a sua capacidade para produzir a expressão do gene de longo prazo 10. Muitas das construções de opsina com promotores específicos do tipo de células estão comercialmente disponíveis numa variedade de serotipos de AAV a partir de instalações nucleares, tais como o vector da Universidade da Pensilvânia ( <a href="http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore" target="_blank">http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore</a> ) ou a University da Carolina do Norte em Chapel Hill ( <a href="http://genetherapy.unc.edu" target="_blank">http://genetherapy.unc.edu</a> ). Uma desvantagem para a tecnologia de AAV é ocapacidade limitada de embalagens (~ 4,7 kb), que coloca uma restrição no tamanho da cassete de transgene que pode ser utilizado para direccionamento de células específicas. Como uma alternativa, os vectores lentivirais, que têm uma capacidade de embalagem maiores, é capaz de acomodar opsina alvo sob o controlo de sequências promotoras de maiores dimensões. O uso de um optrode permite a detecção segura de sinais electrofisiológicos em combinação com o fornecimento de luz temporalmente preciso. Como descrito acima, no entanto, é necessário o cuidado suficiente na sua construção. Uma vez que a fibra tica clivada é frágil, que amarra o fio de sutura pode causar muita força para quebrar a fibra. Mesmo que o optrode pode ser usado para várias gravações, o eléctrodo e de fibra óptica deve ser limpa (ou manualmente clivada no caso de a extremidade nua da fibra óptica), antes da inserção, porque a impedância do eléctrodo e da qualidade da luz entregue degradará com o uso repetido. Durante elementogravações ctrophysiological é importante que o optrode ser avançada lentamente. O optrode usada aqui tem aproximadamente 350 espessura mM (eletrodo de tungstênio: 125 m; núcleo da fibra óptica: 200 mm) e baixá-lo rapidamente pode levar ao movimento do tecido cerebral. Artefatos induzidos-Light também pode ser considerada com particular gravação e entrega luz set-ups 11-12. Embora não tenhamos encontrado nenhum artefato induzida pela luz em nossa condição experimental, as gravações fora da área do cérebro transdução pode, potencialmente, ser usado como um controle de artefatos leves. Outra consideração durante o processo de gravação é a intensidade da luz necessária para a observação de alterações na CHR2-ou NpHR-expressam os neurónios, em especial para as gravações de longa duração. Intensidade do laser forte e iluminação do laser a longo poderia resultar no prejuízo dos tecidos e / ou uma diminuição da resposta ao subsequente de luz entregue 12-13. Para experimentação comportamental é necessária a utilização de um vector viral de controlo para eliminating de qualquer efeito devido ao calor produzido a partir da fibra. Para muitas das construções optogenetic disponíveis comercialmente há construções complementares de controle, em que a sequência do gene da opsina foi removido. Deve notar-se que a engenharia ChR2 variantes com propriedades melhoradas e cinética têm sido desenvolvidos ao longo com outros opsinas silenciamento que podem ser mais adequados para certas questões experimentais 14-15. Por exemplo, uma nova variante ChR2 estabelecida através de mutagénese direccionada, denominado &quot;Cheta&quot;, pode dirigir-alta fidelidade spiking neuronal em frequências (até pelo menos 200 Hz) acima daquela da ChR2 14 original. A combinação de in vivo entrega luz e gravação simultânea de respostas neuronais é um passo crítico no estabelecimento de relações de causalidade entre a atividade estampados nas populações de células geneticamente direcionados e eventos comportamentais bloqueado em tempo correspondentes. Os procedimentos e hardware descrito aqui fornecer uma abordagem simples para a implementação optogenetics para in vivo gravações fixo-cabeça em roedores.

A capacidade de ativar ou silenciar um tipo específico de célula dentro de um circuito neural de uma forma temporalmente preciso é fundamental para a compreensão de como os circuitos neurais processar diferentes tipos de informação subjacentes emoção e cognição. Controle experimental sobre a atividade neural intacto empregou ferramentas loss-/gain-of-function (por exemplo, estimulação elétrica, modulação farmacológica, lesão) que não fornecem o necessário para controlar seletivamente populações específicas de neurônios, ou em uma escala temporal ou espacial. Lidar diretamente com esses desafios tecnológicos, o desenvolvimento e aplicação de ferramentas sensíveis à luz geneticamente encodable permitiu neurocientistas para controlar a atividade elétrica dos tipos de células selecionadas durante os eventos comportamentais bem definidas. Muitas destas proteínas sensíveis à luz são de origem microbiana, com o canal de luz fechado catião, channelrodopsina-2 (ChR2) 1, e a bomba de cloreto de luz dirigido, halorhodoppecado (NpHR) 2,3, em uso generalizado. Uma grande vantagem do Optogenetics é a capacidade das populações de células geneticamente-alvo específicos nas regiões do cérebro heterogéneos e a técnica tem sido aplicada com sucesso a um número de organismos modelo (invertebrados para primatas não-humanos) 4-6. Muitos animais transgénicos optogenetic foram gerados e estão comercialmente disponíveis a 7,8, no entanto, que estabelece linhas transgénicas podem ser de trabalho intensivo e custo proibitivo. Aqui nós descrevemos um protocolo para a entrega de forma viral mediada de genes ChR2 e NpHR sob o promotor CaMKIIα em ratos prelimbic córtex e subiculum dorsal usando um adeno-associado recombinante do vírus (AAV). Dentro do cérebro anterior, expressão CaMKIIα é exclusivo para os neurônios piramidais glutamatérgicos 9. AAV é comumente utilizado para a pesquisa de base devido à sua relativa facilidade de produção e a falta de patogenicidade, assim como o forte e persia expressão do transgene do stent que tem sido conseguido com estes vectores de 10. Além disso, delineamos os passos e hardware para entrega luz e gravação simultânea em ratos fixo-cabeça anestesiados.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe </td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7653-01</td>
 <td>10 &mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Removable Needle</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7803-03</td>
 <td>31 gauge, beveled tip</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microinjector Pump</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>UMP3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pump Controller</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>SYS-MICRO4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicone Oil</td>
 <td>Alfa Aesar</td>
 <td>A12728</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Laser Protective Eyeware</td>
 <td>Kentek </td>
 <td>KMT-4501</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multimode Optical Fiber</td>
 <td>Thorlabs</td>
 <td>BFL37-200</td>
 <td>200 &mu;m diameter core, 0.37 NA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fiber Stripping Tool</td>
 <td>Thorlabs</td>
 <td>T12S21</td>
 <td>for 200 &mu;m diameter core multimode fiber</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical Power Meter</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Photodetector</td>
 <td>Newport</td>
 <td>818-SL/DB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW)</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>coupled to a 200 &mu;m multimode fiber with FC/PC adapter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Green Laser (532 nm, 100-200 mW)</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>coupled to a 200 &mu;m multimode fiber with FC/PC adapter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tungsten/Fiber Optrode</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>Lumitrode</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Capillary Tube</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>22-362-566</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydraulic Micromanipulator</td>
 <td>Narishige</td>
 <td>MO-22</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amplifier</td>
 <td>Kation Scientific</td>
 <td>ExAmp-20K</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Data Acquistion Device</td>
 <td>National Instruments</td>
 <td>NI USB-6009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rodent Head Restraint for Recording</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Small Animal Stereotaxic Unit</td>
 <td>David Kopf Instruments</td>
 <td>Model 963</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a method for high fidelity optogenetic control of individual pyramidal neurons in vivo

Métodos optogenetic surgiram como uma ferramenta poderosa para a elucidação atividade circuito neural subjacente a um conjunto diversificado de comportamentos através de uma ampla gama de espécies. Ferramentas optogenetic de origem microbiana consistem em proteínas de membrana sensível à luz que são capazes de ativar (por exemplo, canal-2, ChR2) ou o silêncio (por exemplo, halorodopsina, NpHR) atividade neural ingenetically definidos tipos de células em escalas de tempo comportamentalmente relevantes. Primeiro, demonstrar uma abordagem simples para entrega mediada por vírus adeno-associado de ChR2 e NpHR transgenes para o subiculum dorsal e região prelimbic do córtex pré-frontal em ratos. Porque ChR2 e NpHR são geneticamente targetable, descrevemos a utilização desta tecnologia para controlar a atividade elétrica de populações específicas de neurônios (ou seja, os neurônios piramidais) embutidos no tecido heterogêneo com alta precisão temporal. Descrevemos o hardware, software personalizadointerface do usuário e os procedimentos que permitem a entrega simultânea de luz e gravação elétrica de neurônios piramidais transduzidas em um anestesiado em preparação vivo. Estas ferramentas de luz responsivo proporcionar a oportunidade para identificar as contribuições causais de diferentes tipos de células para o processamento de informações e comportamento.

A Figura 1 mostra uma imagem do software personalizado (NeuroLux Pro) desenvolvido em ambiente LabVIEW (National Instruments) utilizada para gravação simultânea de atividade neuronal e controlar parâmetros de pulso de luz (ou seja, frequência de pulso, largura de pulso, período de estimulação). O programa de software envia um sinal de comando para um dispositivo de aquisição digital que gera pulsos TTL para o controle sobre o laser de diodo único. Além disso, os softwares programa exibe e armazena a atividade neuronal gravado e sinais TTL entregues. Estes sinais são digitalizados por meio do dispositivo de aquisição de uma taxa de amostragem definida (por exemplo, de 20 kHz). Sinais gravados são guardados como um array bidimensional de precisão dupla em um arquivo binário. A Figura 2 mostra o optrode costume consistindo de um eléctrodo de tungsténio ligado a uma fibra óptica. Uma fibra óptica é fixado ao eléctrodo utilizando fio de sutura fina em trêspontos. Se necessário, super-cola pode ser utilizada para colar a eles. No entanto, evitar que fixa permanentemente a fibra óptica para o eléctrodo porque, embora o eléctrodo pode ser reutilizado várias vezes, a transmissão de luz através da fibra se degrada com o uso repetido e deve ser clivado e limpo ou substituído com cada inserção no cérebro. Painéis esquerdo da Figura 3 mostra imagens fluorescentes de uma maior proteína fluorescente amarela, indicando ChR2 real e expressão NpHR. Estas fotografias mostram a expressão NpHR representante no rato subículo dorsal (Figura 3A) e de expressão em ChR2 prelimbic córtex (Figura 3B). Viral expressão era restrita principalmente ao subiculum dorsal e córtex prelimbic (por exemplo, alguns fluorescência foi observada no giro denteado (Figura 3A, à esquerda)). Também foram observadas as faixas do eletrodo (faixa fina, cabeça de seta) e fibra óptica (faixa de espessura, seta). Figura 4 mostra que ChR2 induzida spiking temporalmente preciso no córtex de rato prelimbic. Figura 4A é um exemplo de rastreio de potenciais de acção ChR2-desencadeada em resposta a 20 Hz de entrega de 10 mseg pulsos de luz azul para rato prelimbic córtex. Raster trama (Figura 4B) mostra a activação induzida por ChR2 em seis neurónios representativos. Todos os neurônios registrados mostrou spiking luz evocadas com fidelidade perfeita. Em contraste com ChR2, NpHR rapidamente e reversivelmente silenciados actividade espontânea in vivo em ratos prelimbic córtex (painel da direita da Figura 4). Figura 4C é um exemplo de rastreio mostrando que contínua iluminação de 532 nm (10 s) do córtex prelimbic expressar sob o NpHR CaMKllα promotor elimina atividade de uma única unidade espontânea in vivo. Note-se que o silenciamento completa da actividade das células piramidais prelimbic é para a entrega de luz contínua 10 seg tempo bloqueado. Baixoer raster plot (Figura 4D) mostra silenciamento induzido por NpHR em seis neurônios representativos. Tanto in vivo gravações são típicos, obtidos a partir de ratos adultos Sprague-Dawley em que a entrega mediada por AAV de genes microbianos opsina ocorreu entre 18-21 dias antes. A Figura 5 mostra o resultado da estimulação repetida ChR2 de um neurónio piramidal prelimbic rato. Azul pulso de luz (10 ms) foi entregue a 20 Hz por 5 segundos (total 100 pulsos). Vestígios de tensão da spiking luz evocadas foram repetidamente adquirido a cada 2 minutos durante uma sessão de gravação de 2 horas (61 repetições no total). Mesmo quando se usa este protocolo de estimulação repetitiva, ChR2 induzida spiking estável e robusto, em resposta ao fornecimento de luz. Figuras 6 e 7 mostram os resultados da fotoinibição induzida por NpHR e fotoativação ChR2-driven de rato subicular atividade dos neurônios. Como é o caso no córtex prelimbic, NpHR e ChR2 puderammediar o tempo bloqueado inibição induzida por luz e ativação dos neurônios subicular transduzidas-opsina com alta reprodutibilidade. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig1.jpg" /> Figura 1. Captura de tela da interface do software Pro NeuroLux para entrega luz e gravação simultânea eletrofisiológico. Traço Na foto mostra silenciamento NpHR induzida da atividade espontânea de ratos células piramidais prelimbic em resposta a 10 seg de contínua entrega 532 nm de luz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig2.jpg" /> Figura 2. Imagem de alta potência de optrode personalizado. Uma fibra óptica está inserido no interior do tubo capilar de vidro, ligado a um eléctrodo de tungsténio e fixada ao eléctrodo utilizando fio de sutura. A distância de centro a centro de entreen a ponta do eletrodo ea ponta da fibra é de aproximadamente 500 mm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig3.jpg" /> Figura 3. Expressão viral e colocação optrode. (Esquerda) As fotografias mostram expressão NpHR representante no subiculum dorsal (A) e de expressão ChR2 no córtex prelimbic (B). (Direita) esquemático que representa o local onde cada fotografia foi tirada. A seta e flecha em cada fotografia indicam a localização do eletrodo de tungstênio e de fibra óptica, respectivamente. SUB: subiculum, DG: giro denteado, PL:. Córtex prelimbic <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig4.jpg" /> Figura 4. In vivo registros eletrofisiológicos de ChR2 ou NpHR-transduzidas prelimb ratoic córtex. (A) Exemplo traço de potenciais de ação ChR2-desencadeadas em resposta a 20 Hz entrega de azul (473 nm) pulsos de luz (10 ms, azul bar). (B) Raster enredo mostrando spiking induzida por ChR2 em seis neurônios representativos. Cada unidade de actividade é representada como um ponto. (C) Exemplo traço de supressão induzida por NpHR da atividade espontânea durante verde contínua (532 nm) iluminação de luz (10 seg, bar verde). (D) Raster enredo mostrando silenciamento induzido por NpHR em seis neurônios representativos. Cada atividade unidade é plotado como um ponto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig5.jpg" /> Figura 5. Spiking Repetitivos 20 Hz ChR2-driven de um neurônio piramidal prelimbic rato in vivo. (A) Tensão traços do spiking luz evocadasadquirido nos pontos de tempo 0, 30, 60, 90, 120 minutos depois do início da gravação. (B) Raster enredo mostrando todos os 61 repetições (2 min de intervalo inter-julgamento, 120 min total) da ativação induzida pela luz. Cada atividade unidade é plotado como um ponto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig6.jpg" /> Figura 6. In vivo registros eletrofisiológicos de NpHR-transduzidas subiculum dorsal de ratos. (A) Exemplo traço contínuo mostrando que a iluminação de 10 seg 532 nm (barra verde) do subiculum dorsal expressar NpHR elimina atividade espontânea. (B) formas de onda média das duas unidades gravado a partir do traço acima. O limiar de amplitude foi utilizado para a identificação de dois neurónios distintas. (C) Raster trama mostra cinco repetiçãos de silenciamento induzido por NpHR destas unidades. Cada unidade de actividade é representada como um ponto. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig7.jpg" /> Figura 7. Repetitivo 20 Hz-driven CR2 spiking de um rato dorsal subicular neurônio in vivo. (A) Tensão vestígios da luz evocadas spiking adquiridos nos pontos de tempo 0, 30, 60, 90, 120 minutos depois do início da gravação. Detalhe: a atividade estouro típico desta célula. (B) Raster enredo mostrando todos os 61 repetições (2 min de intervalo inter-julgamento, 120 min total) da ativação induzida pela luz. Cada atividade unidade é plotado como um ponto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

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A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

O recente desenvolvimento de ferramentas de neurociência que combinam genética e óptica, denominado &quot;optogenetics&quot;, possibilita o controle sobre a atividade do circuito neural com um nível sem precedentes de resolução espacial e temporal. Aqui nós fornecemos um protocolo para a integração na gravação vivo com manipulação optogenetic de subconjuntos geneticamente definidos de neurônios piramidais corticais pré-frontais e subicular.

Um Método para High Fidelity Optogenetic Controle de Individual Piramidal neurônios<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

18.9K visualizações.  University of Colorado Boulder.  O recente desenvolvimento de ferramentas de neurociência que combinam genética e óptica, denominado "optogenetics", possibilita o controle sobre a atividade do circuito neural com um nível sem precedentes de resolução espacial e temporal. Aqui nós fornecemos um protocolo para a integração na gravação vivo com manipulação optogenetic de subconjuntos geneticamente definidos de neurônios piramidais corticais pré-frontais e subicula...

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In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Em Eletroporação vivo de Retina do rato em desenvolvimento

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Neurociência

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Transdução Viral seletiva de Adultos-nascido neurônios olfativos de crônica In vivo Estímulo Optogenetic

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological techniques, in the understanding of the underlying pathophysiology1. Here we describe a method to perform electrophysiological studies on mouse sciatic nerves in vivo.
The animals are anesthetized with isoflurane in order to ensure analgesia for the tested mice and undisturbed working environment during the measurements that take about 30 min/animal. A constant body temperature of 37 &#176;C is maintained by a heating plate and continuously measured by a rectal thermo probe2. Additionally, an electrocardiogram (ECG) is routinely recorded during the measurements in order to continuously monitor the physiological state of the investigated animals.
Electrophysiological recordings are performed on the sciatic nerve, the largest nerve of the peripheral nervous system (PNS), supplying the mouse hind limb with both motoric and sensory fiber tracts. In our protocol, sciatic nerves remain in situ and therefore do not have to be extracted or exposed, allowing measurements without any adverse nerve irritations along with actual recordings. Using appropriate needle electrodes3 we perform both proximal and distal nerve stimulations, registering the transmitted potentials with sensing electrodes at gastrocnemius muscles. After data processing, reliable and highly consistent values for the nerve conduction velocity (NCV) and the compound motor action potential (CMAP), the key parameters for quantification of gross peripheral nerve functioning, can be achieved.

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Measurements of nerve conduction properties in vivo exemplify a powerful tool to characterize various animal models of neuromuscular diseases. Here, we present an easy and reliable protocol by which electrophysiological analysis on sciatic nerves of anesthetized mice can be performed.

Em Medidas Vivo eletrofisiológicos nos nervos ciático Rato

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo optogenética Dissection de Circuitos medo no cérebro Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic hippocampal neurons can often grow successfully on glass coverslips at high density under serum-free conditions, but low density cultures typically require a supply of trophic factors by co-culturing them with a glia feeder layer, preparation of which can be time-consuming and laborious. In addition, the presence of glia may confound interpretation of results and preclude studies on neuron-specific mechanisms. Here, a simplified method is presented for ultra-low density (~2,000 neurons/cm2), long-term (&#62;3 months) primary hippocampal neuron culture that is under serum free conditions and without glia cell support. Low density neurons are grown on poly-D-lysine coated coverslips, and flipped on high density neurons grown in a 24-well plate. Instead of using paraffin dots to create a space between the two neuronal layers, the experimenters can simply etch the plastic bottom of the well, on which the high density neurons reside, to create a microspace conducive to low density neuron growth. The co-culture can be easily maintained for &#62;3 months without significant loss of low density neurons, thus facilitating the morphological and physiological study of these neurons. To illustrate this successful culture condition, data are provided to show profuse synapse formation in low density cells after prolonged culture. This co-culture system also facilitates the survival of sparse individual neurons grown in islands of poly-D-lysine substrates and thus the formation of autaptic connections.

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Um método simplificado para Ultra-Baixa Densidade, Long-Term Primária do hipocampo Neuron Cultura

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Controlo óptico de uma proteína neuronal utilizando um ácido Unnatural Amino geneticamente codificados em neurónios

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Imagem de cálcio Ratiometric de neurônios individuais se comportando Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven therapies for TBI have been developed. This paper presents a novel method for pre-clinical neurotrauma research intended to complement existing pre-clinical models. It introduces human pathophysiology through the use of human induced pluripotent stem cell-derived neurons (hiPSCNs). It achieves loading pulse duration similar to the loading durations of clinical closed head impact injury. It employs a 96-well format that facilitates high throughput experiments and makes efficient use of expensive cells and culture reagents. Silicone membranes are first treated to remove neurotoxic uncured polymer and then bonded to commercial 96-well plate bodies to create stretchable 96-well plates. A custom-built device is used to indent some or all of the well bottoms from beneath, inducing equibiaxial mechanical strain that mechanically injures cells in culture in the wells. The relationship between indentation depth and mechanical strain is determined empirically using high speed videography of well bottoms during indentation. Cells, including hiPSCNs, can be cultured on these silicone membranes using modified versions of conventional cell culture protocols. Fluorescent microscopic images of cell cultures are acquired and analyzed after injury in a semi-automated fashion to quantify the level of injury in each well. The model presented is optimized for hiPSCNs but could in theory be applied to other cell types.

Here we present a method for a human in vitro model of stretch injury in a 96-well format on a timescale relevant to impact trauma. This includes methods for fabricating stretchable plates, quantifying the mechanical insult, culturing and injuring cells, imaging, and high content analysis to quantify injury.