Apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde concessão R01EY018144.

1. Produção, redobragem e purificação por HPLC de Holo-RBP <ol><li> Transformar BL-21cells com o vector pET3a abrigando o ADNc para a RBP humano com sua etiqueta 6x no N-terminal. Crescer as transformadas BL-21 células em um agitador a 37 ° C em 40 ml de meio LB com carbenicilina até OD a 600 nm atingir 0,5. RBP induzir a expressão da proteína por adição de IPTG a 1 mM. Crescer as bactérias a 37 ° C mais 5 horas. </li><li> RBP produzido em E. coli é principalmente presente nos corpos de inclusão insolúveis. Para enriquecer a corpos de inclusão, as células de pelotas a 10000 xg durante 20 min. Em seguida, sonicar as células em gelo, em 5 ml de PBS com inibidores de protease, seguido de 2 ciclos de congelamento e descongelamento. Pellet para baixo dos corpos de inclusão a 20.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e guardar o pellet em gelo. </li><li> Solubilizar o corpo de inclusão de pelotas por sonicação em 10 ml 7,5 M de hidrocloreto de guanidina. Adicionar metade do volume (5 ml) de tampão Tris 25 mM, pH 9,0 e DTT a um c definitivaoncentration de 10 mM. Misture vigorosamente solução num misturador vortex durante a noite à temperatura ambiente para reduzir totalmente e desnaturar proteínas. </li><li> Centrifugar a solução de proteína para remover o material insolúvel a 18.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Após a centrifugação, transferir o sobrenadante para um novo tubo e colocar o tubo em gelo. </li><li> Prepare quatro volumes (60 ml) de tampão de re-enrolamento (25 mM Tris, pH 9,0, 0,3 mM de cistina, 3,0 mM de cisteína, EDTA 1 mM). Degas buffer do redobragem. Também preparar 600 retinol mM ul 10 em etanol sob luz vermelha ofuscante. Mantê-lo no escuro no gelo. Tanto o tampão de redobragem e solução retinol precisa ser preparada de fresco. </li><li> Arrefecer tanto uma solução da proteína e do tampão de redobragem no gelo durante pelo menos 30 min. Temperatura mais elevada provavelmente reduz a qualidade do redobrada RBP. Adicionar gota a gota 1 ml de tampão de redobragem e 10 ul de solução de retinol, por sua vez, enquanto solução de proteína é vigorosamente misturada num copo com gelo. Repita este passo até que todos tampão redobramento e retinolsão adicionados. Manter agitação da reacção em gelo, no escuro, durante 5 horas. </li><li> Girar a reacção de redobragem a 24.000 xg durante 30 min a 4 ° C. É essencial para remover os agregados logo após a reacção de redobragem. </li><li> Concentra-se a solução sobrenadante utilizando Amicon Ultra concentrador 15 (MWCO 10 K) a cerca de 10 ml. Não se concentrar a solução redobrado mais do que este nível. Concentrando-se demasiado irá conduzir a agregação da proteína e diminui o rendimento final e da qualidade de RBP correctamente dobrado. Dilui-se a amostra concentrada com PBS arrefecido de 100 ml. O propósito deste passo é remover os componentes na reacção de redobragem que interferem com a purificação de níquel. </li><li> Girar a solução mais uma vez a 24000 xg durante 20 min a 4 ° C. É importante para remover qualquer precipitado. Transferir o sobrenadante para dois tubos de 50 ml, contendo cada um 1 ml de Ni-NTA de polpa que não foi lavada com PBS. Rodar os tubos a 4 ° C durante uma hora. Incubando f solução diluídaou de 1 hora pode provocar a precipitação de proteínas deformadas que precisam de ser removidos. </li><li> Girar os tubos a 500 xg durante 3 min. Remover o sobrenadante cuidadosamente. Flutuante nada deve ser removido. Adicionar PBS frio a 30 ml para cada tubo. Girar novamente e remover o sobrenadante. Repita esse processo até que você não vê nada, mas contas no tubo. </li><li> Transferir a resina Ni-NTA de uma coluna vazia. Lavar a resina com 20 volumes de coluna de 10 mM de imidazole, 500 mM de NaCl em PBS. Eluir His-RBP, em 5 volumes de coluna de 100 mM de imidazole em PBS. Não armazenar esta solução por um período prolongado de tempo, e congelamento reduz o rendimento final e qualidade. Para o melhor resultado, purificar RBP por HPLC imediatamente. </li><li> Dializar Sua RBP-purificada a partir da resina de Ni-NTA contra 25 mM de Tris, pH 8,4, e NaCl 120 mM. Um concentrador pode também ser utilizado para a troca de tampão. As amostras para HPLC claras por centrifugação a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C para a direita antes de cada execução. </li><li> Purifica-se a holo-RBP na HPLC utilizando um iãotroca coluna AX-300 por um gradiente por passos de NaCl (220 mM de 12 min, 360 mM de 15 min, e 1,000 mM de 15 min), utilizando 25 mM de Tris, pH 8,4 como fase móvel a 1 mL / min. Com o aumento da concentração de NaCl, holo-His-RBP é libertado enquanto apo-RBP e misfolded RBP ficar ligado à coluna (Figura 1). Se redobragem RBP não for feito optimamente, misfolded RBP (eg misfolded RBP-I na Figura 1) pode predominar toda a preparação. </li><li> Recuperar o enrolamento correcto holo-RBP a partir das fracções de pico a 360 mM NaCl. Monitorizar cuidadosamente o perfil de eluição do enrolamento correcto e misfolded His-RBP. Em 1000 mM de NaCl, a maioria dos misfolded His-RBP deve ser liberado. </li><li> As fracções contendo o complexo de holo-RBP são reunidas, concentradas e dialisadas contra PBS durante a noite a 4 ° C. Verifique o rendimento final e qualidade (330 nm/280 nm) em espectrofotômetro. Produto correctamente dobradas deve ter uma razão de 330 nm/280 nm do ligeiramente maior do que 1 (Figura 1). </li><li> Para produçãoe apo-RBP, adicionar um volume igual de heptano, para o complexo de holo-RBP purificada e misturar suavemente por rotação durante a noite a 4 ° C. Centrifugar a 16.000 g durante 10 min a 4 ° C e transferir cuidadosamente a fase aquosa inferior para um tubo novo (evitando-se o precipitado na interface). Repita o processo três vezes com uma incubação de 3 horas para cada uma. Verificar a absorção num espectrofotómetro Nanodrop para garantir que o pico 330 nm diminuiu para o nível de fundo. </li></ol> 2. Monitoramento em tempo real de STRA6 catalisada Retinol lançamento e Carregando Retinol <ol><li> Bloquear um preto de 96 poços da placa de microtitulação-2 (Thermo Scientific) com 200 ul de Casein Blocker (Pierce) durante a noite a 4 ° C para evitar a aderência não específica da holo-RBP ao plástico. Blocker Casein dá o melhor efeito de bloqueio dos bloqueadores todas as soluções testadas. </li><li> As membranas preparadas de fresco a partir de células que expressam STRA6 ou células de controlo foram lavados com PBS e passada através de uma seringa de Hamilton (GastiGHT # 1710) 6 vezes para produzir uma suspensão uniforme em PBS. Nós normalmente utilizam membranas derivadas de 1/100 a 1/20 de células cultivadas numa placa de 100 mm por reacção. </li><li> Lavar os poços revestidos da placa de microtitulação-2 uma vez com 200 ul de PBS. Arrefece-se a placa em gelo antes da adição da suspensão de membranas (50 uL por poço). </li><li> Monitorização em tempo real de retinol fluorescência é medida usando óptica de fluorescência da Omega Polarstar (BMG Labtech) com o 320EX excitação do filtro eo filtro de emissão de 460-10. O programa está definido para o modo de leitura Endpoint. O modo de placa pode também ser usado para medir um curso de tempo, se os intervalos de tempo não são variados. O sinal de cada ponto de tempo é a média de 10 medições (média orbital com um diâmetro de 2 mm) e o ganho é definido para 1800. A placa é agitada durante 10 segundos a 500 rpm utilizando dupla agitação orbital, antes de cada medição. </li><li> Para iniciar o teste de libertação de retinol, os poços são lidos uma vez utilizando a leitura Endpoint mode antes holo-RBP (tipicamente a concentração final de 1 uM) é adicionado a 0 min. Assim que a holo-RBP é adicionado, a reacção é monitorizada continuamente min cada 5-10 durante 1-3 hr. Para iniciar o ensaio de carga retinol, all-trans-retinol (tipicamente de 1 uM de concentração final) é adicionado aos poços sob luz vermelha fraca. A placa é lido uma vez antes de apo-RBP é adicionado a 0 min. Assim que a apo-RBP é adicionado, a reacção é monitorizada continuamente min cada 5-10 durante 1-3 hr. </li><li> Depois de todas as medições são feitas, o download dos dados em bruto (exemplo mostrado na Figura 2) a partir do software de Análise de Dados Omega (BMG Labtech) para o Microsoft Excel para análise de dados. Cada ponto no tempo gera um arquivo que contém as leituras de todas as condições experimentais. Por exemplo, se houver 20 pontos no tempo, consolidar 20 arquivos em um arquivo do Excel para análise de dados. </li><li> Para a análise dos dados, os sinais de fluorescência antes da adição de retinol ou holo-RBP a 0 min são considerados sinais de fundo umad subtraídos dos sinais finais de fluorescência em todos os pontos de tempo. Embora os sinais de fundo é baixo comparado com retinol fluorescência em holo-RBP, subtraindo-se o fundo não específico elimina a influência de dispersão da luz pelas membranas e possibilita a concentrar-se na fluorescência do retinol de holo-RBP ou retinol adicionado a 0 min. </li></ol> 3. Monitoramento em tempo real de STRA6 catalisada Transporte de Retinol De Holo-RBP para CRBP-I <ol><li> Retinol-EGFP é uma transferência de ressonância novo fluorescência (FRET) par que foi recentemente estabelecido 41. STRA6 catalisada transporte de retinol holo-RBP para EGFP-CRBP-I é monitorado em tempo real através da medição de retinol-EGFP FRET. EGFP-CRBP-I a proteína de fusão com 6xHis tag (EGFP-CRBP-I) é produzida em células de mamíferos e é purificado em resina Ni-NTA antes da experiência. EGFP-CRBP-I pode ser armazenado em PBS com os inibidores de protease por um curto período de tempo, a 4 ° C. Alternativamente a proteína de fusão is congeladas a -80 ° C em pequenas aliquotas. </li><li> Antes das reacções, preparar uma placa de microtitulação bloqueadas-2 e as membranas tal como descrito acima. Lavar os poços revestidos da placa de microtitulação-2 uma vez com 200 ul de PBS antes da adição da suspensão de membranas (50 uL por poço). </li><li> Real-time retinol-EGFP FRET é medida usando polarstar Omega com a excitação 320EX filtro e os filtros de emissão de 460-10 e 510-10 usando simultâneas duelo óptica de emissão de fluorescência. O programa está definido para o modo de leitura Endpoint. O modo de placa pode também ser usado para medir um curso de tempo, se os intervalos de tempo não são variados. O sinal de cada ponto de tempo é a média de 10 medições (média orbital com um diâmetro de 2 mm) e o ganho é fixado em 1800 por canal. A placa é agitada durante 10 segundos a 500 rpm utilizando dupla agitação orbital, antes de cada medição. </li><li> Para iniciar as reacções, EGFP-CRBP-I (tipicamente de 1 uM de concentração final) é adicionado aos poços. A placa é lida emce utilizar o modo de leitura Endpoint antes de holo-RBP é adicionado a 0 min. Assim que a holo-RBP é adicionado, a reacção é monitorizada por medição continuamente a cada 5-10 min para hr 1-2. </li><li> Depois de todas as medições são feitas, o download dos dados em bruto (exemplo mostrado na Figura 3) a partir do software de Análise de Dados Omega para Microsoft Excel para análise de dados, tal como descrito acima. </li><li> Retinol-EGFP FRET é calculada pela mudança dinâmica na relação dos picos de aceitador / dador de emissão 47. A equação 41 para calcular essa proporção é [(510 t -510 b) / (460 t -460 b)], onde t 510, 510 b, 460 t, b e 460 representam as emissões em 510 nm após o início da reacção ( t = tempo de ponto), a 510 nm antes de retinol ou holo-RBP é adicionado (b = branco), a 460 nm após a iniciação da reacção de (t = ponto de tempo), e a 460 nm antes de retinol ou holo-RBP é adicionada (b = fundo), respectivamente. </li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Compartilhamos aqui um protocolo de produção otimizada RBP porque os procedimentos de produção e purificação da RBP são críticos para a geração de RBP corretamente dobrado. Dada a possibilidade de espécies RBP deformadas e a presença de quantidades residuais de proteínas bacterianas, mesmo em bactérias purificada por HPLC-produzidos RBP, é útil utilizar RBP nativa do soro para confirmar a conclusão relacionada a RBP. RBP urina, o qual está comercialmente disponível, é uma mistura complexa de várias ...

A vitamina A é uma molécula orgânica que é essencial para a sobrevivência humana e para o bom funcionamento de quase todos os órgãos humanos. Derivados da vitamina A (retinóides) participar em diversos eventos bioquímicos e celulares, incluindo a detecção de luz para a visão e 1,2 a regulação da expressão do gene e a tradução da proteína durante o desenvolvimento embrionário e em tecidos adultos 3-6. Embora retinol tem a capacidade de se difundir por via sistémica, a evolução veio com plasma de proteína de ligação do retinol, uma proteína transportadora específica para a vitamina A no transporte de sangue para atingir a eficácia e especificidade elevadas e, para evitar a toxicidade associada a difusão aleatória 7-10. Um receptor de alta afinidade que se liga a RBP e leva-se a hipótese de vitamina A no 1970 11-13. Apesar da evidência acumulada em três décadas sobre a existência do receptor RBP 14-31, a hipótese do receptor foi debatida, durante muitos anos devido à existence de uma definição errada de holo-RBP. A definição correcta de holo-RBP é que é o complexo de alta afinidade de 1:1 entre retinol e RBP. Extracção repetida de holo-RBP por solvente orgânico é necessário para a produção de apo-RBP. Esta definição é utilizada por quase todos os laboratórios que estudam RBP 7,9,32-35 ou o receptor RBP 14-31,36-42. A definição incorrecta de holo-RBP que foi usado para provar a existência do receptor RBP é a mistura de retinol aguda livre com apo-RBP. Uma vez que a função do receptor RBP em vitamina A absorção de holo-RBP é a libertação a partir de retinol holo-RBP, o receptor RBP se não desempenham um papel na absorção de retinol se retinol é livre para começar (como proposto pela definição incorrecta de holo -RBP). A recente identificação de receptor RBP como uma proteína de domínio multitransmembrane chamado STRA636 e a sua função em vitamina A absorção de holo-RBP 36-43 fortemente argumenta contra a hipótese de que não RBPprecisa de um receptor para fornecer análises vitamina A. detalhada revelou que STRA6 tem 9 domínios transmembranares, com o terminal N localizado extracelularmente e C-terminal localizados intracelularmente 40. Localizado entre transmembranar 6 e 7 é um domínio de ligação a RBP essencial 39. STRA6 é acoplada a tanto LRAT e CRBP-I em vitamina A absorção do complexo de holo-RBP, mas nenhum nem LRAT CRBP-I é absolutamente necessário para a actividade melhorada STRA6 41. STRA6 capacidade de catalisar a liberação de retinol holo-RBP é a chave para a sua atividade de vitamina A captação de 41. Confiando em STRA6 para libertar o seu retinol, a vitamina A entrega por RBP pode transportar a vitamina A para alvejar células em tecidos periféricos, com elevada especificidade e eficiência. A importância crítica de holo-RBP definição e preparação é ilustrada não só pelo histórico debate sobre a existência do receptor RBP, mas também por três relacionados com estudos recentes com base no dif definições holo-RBPrentes da definição original e correta 44-46. O papel utilizado pela primeira vez a definição holo-RBP, que foi utilizado para rejeitar a existência do receptor RBP para estudar o receptor RBP 44. Os artigos segundo e terceiro veio com uma terceira definição de holo-RBP que tornou ainda menos susceptíveis de retinol a ser estudadas de modo a formar um complexo com boa RBP 45,46. Estes estudos preparados através da mistura de 3 H-retinol/RBP holo-RBP (nem apo-RBP), com 3 H-retinol. Uma vez que este ensaio não tem 3 H-retinol/RBP formado e não remover excesso livre 3 H-retinol 45,46, não é um ensaio de absorção de H-3 a partir de 3 H-retinol/RBP retinol, mas é livre 3 ensaio de difusão H-retinol. Foi demonstrado anteriormente que STRA6 não aumenta a absorção celular de retinol livre por LRAT 38 ou CRBP-I 41. Virtualmente todo o retinol é obrigado a RBP no sangue e não existe qualquer detectável free retinol. A principal função do receptor RBP é catalisar libertação retinol de holo-RBP retinol durante a captação de holo-RBP 41. Se o retinol é artificialmente liberado ou está na forma livre, para começar 45,46, o receptor RBP não é necessário. Os resultados dramaticamente diferentes obtidos a partir do ensaio de difusão livre de retinol em comparação com os ensaios baseados em correctamente preparado holo-RBP ilustram que uma correcta preparação de RBP é crucial para os seus ensaios funcionais. RBP pode ser purificada a partir de soro humano 41, mas o processo é complexo e o rendimento é baixo. Uma abordagem alternativa é a de produzir RBP em E. coli. Porque E. coli não tem a capacidade para dobrar correctamente mamíferos proteínas secretadas com mais de um par de ligações de dissulfureto como RBP, é essencial para a redobragem RBP e purificar a proteína correctamente dobrada. Proteínas deformadas não apenas um comportamento diferente do corrigido RBP dobrado em vários ensaios,mas também fazer com que a agregação da proteína durante a armazenagem. Pela mesma razão, a apo-RBP só é produzido a partir de alta qualidade holo-RBP. Descrevemos aqui um protocolo otimizado para produzir RBP de alta qualidade 100% carregado com retinol através da expressão bacteriana, redobramento, e purificação por HPLC. Purificação por HPLC, não só remove o RBP incorrectamente dobrado, mas também a contaminação bacteriana significativa que pode causar perturbações graves se RBP é usada em ensaios de transdução de sinal. Descrevemos também duas sensíveis técnicas de monitoramento em tempo real para estudar o transporte de retinol por STRA6. Ambas as técnicas dependem RBP alta qualidade. Devido a limitações de espaço, as técnicas clássicas de vitamina retinóide e baseada em HPLC baseado radioativo A captação de ensaios não são descritos aqui.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> cloridrato de guanidina </td><td> EMD </td><td> 5010 </td><td></td></tr><tr><td> cistina </td><td> Sigma </td><td> C8755 </td><td></td></tr><tr><td> cisteína </td><td> Sigma </td><td> C7352 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Pescador </td><td> BP118-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tris </td><td> Pescador </td><td> 7786-1 </td><td></td></tr><tr><td> TDT </td><td> EMD </td><td> 3860 </td><td></td></tr><tr><td> retinol </td><td> Sigma </td><td> R7632 </td><td></td></tr><tr><td> carbenicilina </td><td> Pescador </td><td> BP2648-5 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> EMD </td><td> 5810 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> EMD </td><td> 6508 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Pescador </td><td> BP358-10 </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA </td><td> Qiagen </td><td> 1018244 </td><td></td></tr><tr><td> imidazol </td><td> EMD </td><td> 5720 </td><td></td></tr><tr><td> heptano </td><td> EMD </td><td> HX0295-1 </td><td></td></tr><tr><td> Bloqueador de caseína </td><td> Perfurar </td><td> 37528 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Ultra 15 concentrador (MWCO10 K) </td><td> Millipore </td><td> UFC901024 </td><td></td></tr><tr><td> -2 placa de microflúor </td><td> Pescador </td><td> 14-245-177 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton seringa estanque ao gás # 1710 </td><td> Pescador </td><td> 14-824-655 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein

A vitamina A é essencial para a visão e o. Crescimento / diferenciação de quase todos os órgãos humanos Plasma proteína de ligação do retinol (RBP) e é o princípio portador específico da vitamina A no sangue. Aqui descrevemos uma técnica optimizada para produzir e purificar a holo-RBP e duas técnicas de monitorização em tempo real para o estudo do transporte da vitamina A por o receptor de alta afinidade RBP STRA6. A primeira técnica torna possível produzir uma grande quantidade de qualidade elevada de holo-RBP (100%-carregadas com retinol) para ensaios de transporte da vitamina A. RBP alta qualidade é essencial para ensaios funcionais devido misfolded RBP lançamentos vitamina A contaminação bacteriana e prontamente na preparação RBP pode causar artefactos. Técnicas de monitoramento em tempo real, como eletrofisiologia fizeram contribuições importantes para os estudos de transporte de membrana. A RBP mediada pelo receptor de transporte de retinol não tenha sido analisado em tempo real até recentemente. A segunda técnica aqui descrita é a real tempo de análise de STRA6 catalisada liberação retinol ou de carga. A terceira técnica é análise em tempo real de STRA6 catalisada transporte retinol de holo-RBP a proteína de ligação do retinol celular I (CRBP-I). Essas técnicas fornecem alta sensibilidade e resolução em revelar vitamina RBP receptor é um mecanismo de captação.

Apresentamos aqui os resultados representativos para holo-RBP produção e purificação por HPLC (Figura 1), em tempo real A análise de STRA6 catalisada libertação retinol de holo-RBP e carregamento de retinol em apo-RBP (Figura 2) e análise em tempo real de STRA6 catalisada transporte retinol de holo-RBP a EGFP-CRBP-I (Figura 3). Sem a redobragem, RBP produzido em bactérias é quase completamente misfolded devido à presença de muita...

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Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Aqui descrevemos uma técnica otimizada para produzir produtos de alta qualidade vitamina A / complexo RBP e duas técnicas de monitoramento em tempo real para estudar a vitamina A STRA6 transporte, o receptor RBP.

Em tempo real, análises de Transporte Retinol pelo receptor de membrana da proteína de Retinol Binding

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.6K visualizações.  University of California, Los Angeles. Aqui descrevemos uma técnica otimizada para produzir produtos de alta qualidade vitamina A / complexo RBP e duas técnicas de monitoramento em tempo real para estudar a vitamina A STRA6 transporte, o receptor RBP.

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Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Taxas de medição de plasma Proteína de membrana endocítica por Biotinilação reversível

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Biologia

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Medição quantitativa do GLUT4 translocação para a membrana plasmática por citometria de fluxo

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&amp;#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

Reconstituição bioquímica de receptor de esteróide • Hsp90 Complexos de Proteínas e Reativação da ligação do ligando

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

Mapeamento de Difusão Molecular na membrana plasmática por Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

Monitoramento em tempo real de Ligante-receptor Interações com transferência de energia de ressonância de fluorescência

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Método de purificação de proteína livre de Determinação Affinity Binding por termoforese Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

Células de mamíferos autonomamente bioluminescentes para monitoramento contínuo e em tempo real de citotoxicidade

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Imagem Plasma Membrane Deformações Com pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Medições em tempo real de proteína de membrana: Receptor Interações Usando Superfície Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...