Agradecemos Bryan Venema e Eric Martinson para a construção do aparelho eletropolimerização. Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde (R01GM100718 para SEG) eo Instituto Nacional de Eye of the National Institutes of Health (R01EY017564 para SEG).

1. Deposição de lipídios a partir de solventes orgânicos: Protocolo Classical <ol><li> Remover os lípidos de armazenamento à temperatura de -20 ° C ou -80 ° C, aquecer até à TA Cuidado:. Lípidos são extremamente higroscópico, e muitos são sensíveis ao oxigénio. Cobertura de lípidos em árgon seco ou azoto gasoso e em todos os passos para minimizar a exposição ao ar. </li><li> Se necessário, suspender os lipídios em clorofórmio ou ciclo-hexano em mg / ml 1-10, nota que as concentrações indicadas pelo fabricante são tipicamente nominal só CUIDADO: Use luvas apropriadas e outros equipamentos de proteção individual, quando a utilização de solventes orgânicos.. Retire o PPE rapidamente se solvente é derramado sobre eles, como a maioria dos materiais ainda são permeáveis ​​a estes solventes e eles só fornecem protecção temporária. </li><li> Limpe ambos os lados de duas 25 x 37.5 mm ITO lâminas de vidro revestidas com etanol </li><li> Misturar os lípidos para alcançar as proporções molares desejadas. Por cada 1 cm2 de área de ITO desliza para ser revestido com lábioid, mix ~ 15-20 mg de lipídios. Por exemplo, se os dois 25 x 37.5 mm lâminas eram para ser totalmente revestido, teríamos tipicamente usam 30 ul de 10 mg / ml de mistura de lípidos Nota:. Adicionar 0,1% em mol de DPPE-vermelho do Texas para imagiologia fluorescente, e ver abaixo para cuidados cerca corantes fluorescentes. </li><li> Verifique se ITO lado revestido das lâminas de vidro está voltada para cima, medindo a resistência da superfície com um ohmímetro ou multímetro. </li><li> Aspirar os lipídios em um solvente resistente à seringa Cuidado:. Há colas ou plástico, excepto PTFE, deve contactar o solvente orgânico. </li><li> Com a agulha da seringa não é bem tocando a superfície de ITO, aplicam-se lentamente os lipídios se movendo a agulha para trás e para a frente através do slide. Cubra a superfície o mais uniformemente, procura um &quot;arco-íris brilho&quot; na superfície do vidro. </li><li> Coloque os slides rapidamente sob &lt;1 Torr (1 mm Hg) de vácuo para 0,5-1 horas para remover qualquer traço do solvente. Solte a vácuo com gás inerte. </li><li> Aplicar uma junta de vedação de silicone, com umfina camada de gordura de silicone vácuo em ambos os lados. Adicione pelo menos 5 mm de corrediça descoberta exposta a uma extremidade da lâmina. </li><li> Proceder de imediato à Secção 4. </li></ol> 2. Preparação de lipossomas pequeno para desidratação controlada <ol><li> Preparar a mistura de lípidos como nos Passos 1.1 a 1.4. </li><li> Secar os lípidos utilizando uma corrente de gon ou azoto gasoso num tubo de cultura de 10-15 mm de diâmetro. No caso de pequenas quantidades de lípidos, ≤ 0,5 mg, o filme resultante pode ser hidratado imediatamente após a sua colocação sob vácuo durante 0,5-1 horas para remover o solvente residual, prosseguir para o passo 2.5. Grandes quantidades de lipídios tendem a prender solventes orgânicos em um gel grosso, mesmo sob vácuo, e estão melhor preparados por liofilização, veja os passos 2.3-4. </li><li> Suspender o filme de lípido seco em ciclo-hexano, cobrir-se com árgon e de vedação com uma tampa, colocar o tubo num bloco frio e congelamento a -80 ° C durante um mínimo de horas. </li><li> Coloque o bloco da amostra fria e lípido num sistema de vácuocapaz de atingir 100 mTorr. Aplique vácuo, que vai &quot;parar&quot; em cerca de 1 Torr como sublima solventes fora. Uma vez que o solvente é completamente removido (~ 1 h) de vácuo irá cair abaixo deste nível. Libertação de vácuo com o gás inerte e selar o tubo ou hidrato imediatamente. </li><li> Enquanto os lípidos estão sob vácuo, o buffer de hidratação desgaseificar usando vácuo e aspersão de 15-17. </li><li> Hidratos dos lípidos utilizando tampão desgaseificado a concentração final de 1-10 mg / ml. Permitir que os lípidos para hidratar lentamente. Depois de 30 min-1 hora e vortex para quebrar pedaços restantes. Espera um 0,5-1 horas adicionais para permitir a hidratação completa. Usar um osmoticant, tal como sorbitol ou sacarose até 200 mm, para evitar a desidratação completa nos passos seguintes. </li><li> Prepara lipossomas 100-200 nm de diâmetro por extrusão. Veja protocolo extrusão do fabricante para obter mais detalhes. Note-se que o buffer deve ter menos de ~ 25 mM força iônica, ou protocolos especiais de tensão eletropolimerização serão necessários na seção 4. </li></ol> 3.Deposição de Lipídeos por desidratação controlada de pequenas Lipossomas <ol><li> Atenção: Este protocolo requer lípidos para ser colocado em equilíbrio com vapor de soluções salinas saturadas durante muitas horas. Recomendamos realizar o protocolo em uma atmosfera de gás inerte, usando uma caixa de luva ou gabinete similar. </li><li> Cuidado: Se preparando amostras contendo proteínas, evitar a desidratação completa. Hidratar a atmosfera em qualquer recinto com um copo de água morna, ou um umidificador base de ultra-sons. Usar um higrómetro para garantir que há, pelo menos, 30% de humidade relativa. Use sorbitol ou sacarose na pequena tampão lipossoma como precaução adicional para evitar a desidratação total. </li><li> Prepare uma solução saturada de umidade relativa do ar apropriada sal. Humidade alvo depende da osmolaridade da preparação das vesículas. No caso das preparações com osmolaridade fisiológica, utilizar 30-45% de HR, enquanto que as preparações de vesículas de baixa osmolaridade pode ser desidratado adequadamenteequilíbrio com 75-90% RH (Ver também Tabela 1). </li><li> Coloque a solução saturada de sal e excesso de sal em um recipiente hermeticamente selado com uma prateleira interior. Embalagens de alimentos comerciais para iogurte e granola funciona muito bem. Substitua a prateleira após o enchimento, e certifique-se de líquidos é 5-10 mm abaixo da prateleira. </li><li> Limpe ITO lâminas revestidas como na seção 1. Usar o multímetro para determinar qual dos lados está condutor, e rotular o lado não-condutora com o nome da amostra. </li><li> Levemente graxa ambos os lados do silicone (Grau USP VI) junta (s) com um ou vários furos. </li><li> Coloque o lado lâminas condutoras em cima da bancada, e aplicar a junta de silicone (s) em cada lâmina para que lípido será aplicada, tornando-se que há pelo menos 5 mm de lâmina exposta numa extremidade para ligar ao aparelho eletroformação. Alise a junta para assegurar uma boa vedação. </li><li> Dilui-se a preparação das vesículas num tampão de baixo teor de sal isosmótica de ~ 1-2 mg / ml. Nós achamos que a maior concentrções produzir maus resultados. </li><li> Aplicar lipídico para o slide em gotas ul de 1-10. Pequenas gotas geralmente produzem melhores resultados. </li><li> Colocar a lâmina no interior de prateleira acima da solução salina saturada e selar o recipiente hermeticamente. Deixe em temperatura ambiente por 3 horas para O / N. O recipiente pode ser colocado a 4 ° C, mas nota que, para alguns sais, a HR depende fortemente da temperatura e, em que o frio vai aumentar o tempo de equilíbrio. </li><li> O filme resultante pode ter um ligeiro brilho arco-íris para isso, mas em qualquer caso, devem aparecer quase desidratado. Soluções a partir altamente osmóticos pode ser impossível para secar completamente a um filme lipídico, o que não irá afectar negativamente os resultados. </li></ol> 4. Eletropolimerização de lipossomas gigantes <ol><li> Películas lipídicas, em especial as formadas a partir de lipossomas desidratados, são facilmente desalojado. Hidrato cuidadosamente cada poço pela colocação de uma agulha G 27, a seringa na borda do anel de vedação e aplicando lentamente tampão. Buffers podemincluem água, ≤ 200 mM sacarose, ≤ 1 M sorbitol e ≤ 5 HEPES. Solução salina mais de 10 mm podem exigir protocolos de tensão eletropolimerização alternados. Transbordamento cada junta assim por ~ 10%. </li><li> Nota: uma vez que os lipídios são hidratados, avançar rapidamente através das etapas restantes, desde filmes lipídicos começar a descamar imediatamente. Rendimento e tamanho são maximizados se eletropolimerização começa pontualmente. </li><li> Com um movimento suave, aplicar uma segunda corrediça de ITO, cara condutora no interior, para a parte superior da junta. Certifique-se de ter pelo menos 5 mm de saliência fora da área de vedação e em frente à primeira saliência. Pressione suavemente para assegurar uma boa vedação. </li><li> Limpe as duas saliências usando etanol e verificar que os lados que enfrentam a junta são condutoras com o multímetro. </li><li> A câmara pode ainda ser protegido com parafilme luz ou grampos de mola de tensão, se o desejar. </li><li> Ligação da câmara eletroformação a uma fonte de tensão, assegurando barras de alumínio ou de cobre, &quot;EMI gasket espuma &quot;, ou fita adesiva condutora às superfícies condutoras das duas lâminas. Usamos EMI junta de espuma. Planos para um gabarito e fixação são mostrados na Figura 5. </li><li> Verifique se não há curto-circuito entre os contatos, e que os contatos se conectar corretamente às superfícies de ITO, usando o multímetro. </li><li> Aquece-se a câmara de 10 ° C acima da temperatura de fusão mais elevada de qualquer um dos lípidos presentes, por exemplo, para o DPPC, o calor a 52 ° C, mínimo, 10 ° C acima da temperatura de fusão da cadeia de 42 ° C. </li><li> Para buffers com pouco sal, aplique uma onda senoidal de 10 Hz, ~ 0,7 V rms para cada milímetro de diferença entre as duas superfícies revestidas ITO, por 60-90 min. Para buffers elevados de sal, outros protocolos de tensão deve ser utilizado (ver referências). </li></ol> 5. Imaging and Troubleshooting <ol><li> Imagem do lipossoma utilizando um microscópio invertido equipado com um cubo de filtro para rodamina ou corantes Texas Red. O lipossoma deve ser de forma esférica,predominantemente unilamelar por olho, e livre de defeitos, tais como &quot;strings&quot; pendurado do lipossoma. </li><li> Se os lipossomas forem demasiado pequenas, usar menos lípido. </li><li> Se existem muitos defeitos ou alguns lipossomas, isto pode ser devido a lípidos em fase de gel. Considerar o aumento da temperatura eletropolimerização. </li><li> Se alguns ou nenhum lipossomas gigantes formada em tudo de pequenos lipossomas desidratados, reduzir a resistência osmótica do tampão de lipossoma, ou aumentar a resistência osmótica do tampão eletroformação. Um influxo de tampão para a solução concentrada de tampão intersticial pode provocar a delaminação da película de lípido depositado. </li><li> Se o rendimento da vesícula, qualidade ou tamanho é pobre, e você incluiu sais ou tampões de pH nos buffers eletropolimerização ou lipossomas, considere protocolos alternativos de tensão eletropolimerização. Por exemplo, Pott, et ai. 11, recomendado um protocolo de três passos utilizando uma onda sinusoidal de 500 Hz, o aumento da tensão de 50-1,300 Vpp / h durante 30 minutos, mantendo durante 90 minutos, on diminuindo a frequência de 50 Hz em 30-60 min. Eléctrodos de platina ou de titânio pode ser necessário neste caso, mas isso não irá alterar substancialmente o protocolo. </li></ol>

<ol>
	<li>Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+giant+vesicles.+Probing+the+membrane+nanoregime+via+optical+microscopy.">A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy.</a> Journal of Physics-Condensed Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).</li><li>Luisi, P. L., Walde, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Giant Vesicles. , (2000).</li><li>Riquelme, G., Lopez, E., Garcia-Segura, L. M., Ferragut, J. A., Gonzalez-Ros, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+liposomes:+a+model+system+in+which+to+obtain+patch-clamp+recordings+of+ionic+channels.">Giant liposomes: a model system in which to obtain patch-clamp recordings of ionic channels.</a> Biochemistry. 29 (51), 11215-11222 (1990).</li><li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+vesicles:+preparations+and+applications.">Giant vesicles: preparations and applications.</a> Chembiochem. 11 (7), 848-865 (2010).</li><li>Aimon, S., Manzi, J., Schmidt, D., Poveda Larrosa, J. A., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+a+voltage-gated+potassium+channel+in+giant+unilamellar+vesicles.">Functional reconstitution of a voltage-gated potassium channel in giant unilamellar vesicles.</a> PLoS. One. 6 (10), e25529 (2011).</li><li>Girard, P., Pecreaux, J., Lenoir, G., Falson, P., Rigaud, J. L., Bassereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+reconstitution+of+membrane+proteins+into+giant+unilamellar+vesicles.">A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles.</a> Biophys. J. 87 (1), 419-429 (2004).</li><li>Manley, S., Gordon, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+giant+unilamellar+vesicles+via+hydration+of+a+lipid+film.">Making giant unilamellar vesicles via hydration of a lipid film.</a> Curr. Protoc. Cell. Biol. 24, 1-13 (2008).</li><li>Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+vesicles+formed+by+gentle+hydration+and+electroformation:+a+comparison+by+fluorescence+microscopy.">Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy.</a> Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).</li><li>Angelova, M. I., Soleau, S., Meleard, P., Faucon, J. F., Bothorel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+giant+vesicles+by+external+AC+electric+fields.+Kinetics+and+applications.">Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications.</a> Progressin Colloid &amp; Polymer Science. 89, 127-131 (1992).</li><li>Politano, T. J., Froude, V. E., Jing, B., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AC-electric+field+dependent+electroformation+of+giant+lipid+vesicles.">AC-electric field dependent electroformation of giant lipid vesicles.</a> Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 79 (1), 75-82 (2010).</li><li>Pott, T., Bouvrais, H., M&#233;l&#233;ard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+unilamellar+vesicle+formation+under+physiologically+relevant+conditions.">Giant unilamellar vesicle formation under physiologically relevant conditions.</a> Chem. Phys. Lip. 154 (2), 115-119 (2008).</li><li>Sens, P., Isambert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Undulation+Instability+of+Lipid+Membranes+under+an+Electric+Field.">Undulation Instability of Lipid Membranes under an Electric Field.</a> Phys. Rev. Lett. 88 (12), (2002).</li><li>Green, N. G., Ramos, A., Gonz&#225;lez, A., Morgan, H., Castellanos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+induced+by+nonuniform+ac+electric+fields+in+electrolytes+on+microelectrodes.+I.+Experimental+measurements.">Fluid flow induced by nonuniform ac electric fields in electrolytes on microelectrodes. I. Experimental measurements.</a> Phys. Rev. E. 61 (4), 4011-4018 (2000).</li><li>Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+giant+unilamellar+vesicles+from+damp+lipid+film+for+better+lipid+compositional+uniformity.">Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1818 (11), 2598-2604 (2012).</li><li>Bakalyar, S. R., Bradley, M. P. T., Honganen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dissolved+gases+in+high+-performance+liquid+chromatography.">The role of dissolved gases in high -performance liquid chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 158, 277-293 (1978).</li><li>Brown, J. N., Hewins, M., Van Der Linden, J. H. M., Lynch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+degassing+and+other+factors+affecting+liquid+chromatographic+detector+stability.">Solvent degassing and other factors affecting liquid chromatographic detector stability.</a> J. Chromatogr. A. 204, 115-122 (1981).</li><li>Dolan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobile+Phase+Degassing-Why,+When,+and+How.">Mobile Phase Degassing-Why, When, and How.</a> LC-GC. 17 (10), 909-912 (1999).</li><li>Cheng, H., Jiang, X., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+lipid+homeostasis+of+mouse+dorsal+root+ganglia+induced+by+apolipoprotein+E+deficiency:+a+shotgun+lipidomics+study.">Alterations in lipid homeostasis of mouse dorsal root ganglia induced by apolipoprotein E deficiency: a shotgun lipidomics study.</a> J. Neurochem. 101 (1), 57-76 (2007).</li><li>Greenspan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humidity+fixed+points+of+binary+saturated+aqueous+solutions.">Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions.</a> J. Res. Natl. Bur. Stand. 81 (1), 89-96 (1977).</li><li>Rockland, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saturated+Salt+Solutions+for+Static+Control+of+Relative+Humidity+between+5+&#176;+and+40+&#176;C.">Saturated Salt Solutions for Static Control of Relative Humidity between 5 &#176; and 40 &#176;C.</a> Anal. Chem. 32 (10), 1375-1376 (1960).</li><li>Washburn, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> International Critical Tables of Numerical Data, Physics, Chemistry and Technology (1st Electronic Edition). , 216-249 (2003).</li><li>Estes, D. J., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+liposomes+in+physiological+buffer+using+electroformation+in+a+flow+chamber.">Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1712 (2), 152-160 (2005).</li><li>Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Peroxides+Promote+Large+Rafts:+Effects+of+Excitation+of+Probes+in+Fluorescence+Microscopy+and+Electrochemical+Reactions+during+Vesicle+Formation.">Lipid Peroxides Promote Large Rafts: Effects of Excitation of Probes in Fluorescence Microscopy and Electrochemical Reactions during Vesicle Formation.</a> Biophys. J. 91 (6), 2172-2183 (2006).</li><li>Morales-Penningston, N. F., Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GUV+preparation+and+imaging:+minimizing+artifacts.">GUV preparation and imaging: minimizing artifacts.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).</li><li>Grit, M., de Smidt, J. H., Struijke, A., Crommelin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolysis+of+phosphatidylcholine+in+aqueous+liposome+dispersions.">Hydrolysis of phosphatidylcholine in aqueous liposome dispersions.</a> Int. J. Pharm. 50 (1), 1-6 (1989).</li><li>Zhou, Y., Berry, C. K., Storer, P. A., Raphael, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxidation+of+polyunsaturated+phosphatidyl-choline+lipids+during+electroformation.">Peroxidation of polyunsaturated phosphatidyl-choline lipids during electroformation.</a> Biomaterials. 28 (6), 1298-1306 (2007).</li><li>Farkas, E. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+polarization+imaging+of+steady-state+molecular+order+in+ternary+lipid+vesicles+for+the+purpose+of+lipid+phase+assignment.">Multiphoton polarization imaging of steady-state molecular order in ternary lipid vesicles for the purpose of lipid phase assignment.</a> J. Phys. Chem. B. 114 (47), 15512-15522 (2010).</li><li>Hauser, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+ultrasonic+irradiation+on+the+chemical+structure+of+egg+lecithin.">The effect of ultrasonic irradiation on the chemical structure of egg lecithin.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 45 (4), 1049-1055 (1971).</li><li>Hauser, H., Cevc, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+vesicles.">Phospholipid vesicles.</a> Phospholipids Handbook. , (1993).</li><li>Veatch, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electro-formation+and+fluorescence+microscopy+of+giant+vesicles+with+coexisting+liquid+phases.">Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases.</a> Meth. Mol. Biol. 398, 59-72 (2007).</li><li>Kim, R. S., LaBella, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+analytical+methods+for+monitoring+autoxidation+profiles+of+authentic+lipids.">Comparison of analytical methods for monitoring autoxidation profiles of authentic lipids.</a> J. Lipid. Res. 28 (9), 1110-1117 (1987).</li><li>Veatch, S. L., Leung, S. S. W., Hancock, R. E. W., Thewalt, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+alter+miscibility+phase+boundaries+in+ternary+vesicles.">Fluorescent probes alter miscibility phase boundaries in ternary vesicles.</a> J. Phys. Chem. B. 111 (3), 502-504 (2007).</li><li>Juhasz, J., Davis, J. H., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probe+partitioning+in+GUVs+of+binary+phospholipid+mixtures:+implications+for+interpreting+phase+behavior.">Fluorescent probe partitioning in GUVs of binary phospholipid mixtures: implications for interpreting phase behavior.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1818 (1), 19-26 (2012).</li><li>Herold, C., Chwastek, G., Schwille, P., Petrov, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+electroformation+of+supergiant+unilamellar+vesicles+containing+cationic+lipids+on+ITO-coated+electrodes.">Efficient electroformation of supergiant unilamellar vesicles containing cationic lipids on ITO-coated electrodes.</a> Langmuir. 28 (13), 5518-5521 (2012).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Eletropolimerização de lipossomas gigantes tornou-se uma técnica flexível compatível com diversos lipídios, preparações, e tampões. O controle cuidadoso do processo de deposição de lipídios é o mais crítico para o sucesso. Nós apresentamos ferramentas simples para fazer a deposição controlada de lipídios a partir de pequenas preparações de lipossomas um processo simples. A humidade relativa é crítico para o bom desidratação dos lipossomas iniciais, e o valor óptimo variará com a concentração ...

Lipossomas gigantes (muitas vezes chamado de vesículas unilamelares gigantes, ou GUVs) foram principalmente usados ​​para estudar a física ea química física de bicamadas lipídicas, incluindo estudos de deformação bicamada, a convivência fase lateral (&quot;jangadas&quot;), a fusão da membrana, etc 1-4. Eles têm uma estrutura de célula grosseira, como: concha esférica de membrana que envolve um interior aquoso, que pode ser feita facilmente diferente do tampão aquoso circundante. Eles são, por definição, ≈ 1-100 um de diâmetro, de forma que possam ser visualizados utilizando uma variedade de abordagens de microscopia de luz. Elas podem ser feitas usando tenso gradientes osmóticos ou tensão aplicadas mecanicamente, de modo que, embora geralmente macia, as suas propriedades podem ser manipuladas para um manuseamento fácil. Em particular, controlando a &quot;dureza&quot; do lipossoma torna mais simples para formar manchas &quot;lipossoma inscritos&quot; ou excisada para electrofisiologia. No passado, a reconstituição do canal iónico foi amplamente praticada em planar lípido bilayers. Agora, a capacidade para formar manchas de lipossomas gigantes e usar o tremor considerável de ferramentas desenvolvidas para electrofisiologia convencional (microscopia de fluorescência, micropipeta aspiração, perfusão rápida e controlo de temperatura, etc), faz com que os lipossomas gigantes cada vez mais atraente para os estudos de reconstituição 5,6. Lipossomas gigantes tenham sido feitas por muitas estratégias. Na verdade, os lipossomas formam-se espontaneamente gigantes por um processo de inchamento quando um filme de lípido seco é reidratado 4,7,8. O desejo de preparar mais rapidamente maior, lipossomas mais uniformes levou os pesquisadores a outras abordagens, o principal deles eletropolimerização 1,9. Eletroformação também depende da hidratação de uma película de lípido seca, mas acelera o processo através da aplicação de um campo eléctrico oscilante do outro lado da película de lípido. O campo é aplicada através de dois eletrodos, tanto fios de platina ou de índio-estanho-Oxide (ITO) lâminas de vidro revestidas, separados por água outamponar e sobre o qual são depositados os lípidos. Ao acelerar o inchaço dos lipossomas, se consegue um maior rendimento de lipossomas maiores. Assim, eletropolimerização tornou-se o método padrão para a produção de lipossomas gigantes 4. O mecanismo de eletropolimerização não é totalmente compreendida, e a maioria dos protocolos são desenvolvidos empiricamente (por exemplo, 10,11). No entanto, podemos aprender um pouco sobre o que esperar, considerando a teoria e alguns resultados empíricos. Acredita-se que eletropolimerização ocorre por condução fluxo eletro-osmótico de tampão entre bicamadas lipídicas individuais empilhados no filme lipídico depositado 10,11. Acoplamento electrostático a flutuações térmicas das bicamadas lipídicas é também provavelmente envolvidos 12. Estas hipóteses qualitativamente prever os limites superiores para a frequência e a força do campo eléctrico que pode ser usado 10,12. Em particular, prevê-se que as soluções de elevada condutividade ( <em&gt; ou seja, soluções fisiológicas sal) reduzir as forças eletro que podem iniciar a eletropolimerização lipossomas 12. Vazões eletroosmótico geralmente diminuem com o aumento da concentração de sal e são frequentemente culminado em alguma freqüência de oscilação do campo elétrico (por exemplo, embora em uma geometria diferente, Green et al. 13). Assim, maiores intensidades de campo e freqüências mais altas são razoáveis ​​para soluções de alta condutividade, dentro dos limites de 10. No entanto, as proteínas de membrana são susceptíveis de ser incompatível com o método usual de lípidos para depositar eléctrodos electroswelling para o procedimento, isto é, em solventes orgânicos, os quais são, em seguida, evapora-se para deixar uma fina película de lípido. Existem dois caminhos principais contornar esta dificuldade: a incorporar proteínas após a formação de lipossomas gigante, ou para adaptar a forma como os lípidos sejam depositados. Nossa abordagem baseia-se em outros 5,11 para depositar os lipídios e reconstituiçãotuído proteína de membrana juntos a partir de uma suspensão de pequenas ou grandes &quot;proteolipossomos&quot;. Nós descrevemos o processo demorado e mais difícil de produzir proteolipossomos de proteína e lipídios purificada em outro lugar (Collins e Gordon, em revisão). Aqui descrevemos o protocolo, na ausência de qualquer proteína, mas é o mesmo quando a proteína é incorporada, que incluem os resultados que mostram que proteolipossomas contendo o canal de TRPV1 de iões pode ser transformado em GUVs e usado para de patch-clamp electrofisiologia. Em qualquer abordagem eletropolimerização, a inspeção visual da amostra de lipídios durante o processo de deposição de lipídios é fundamental para o sucesso. Nossa abordagem pode ser relevante para além da aplicação especializada para canal de reconstituição de íons. No momento, uma vez que este protocolo desenvolvido pela primeira vez e, agora, tem sido também demonstrado como a maneira em que os lípidos são depositadas sobre os eléctrodos para eletroformação afecta a heterogeneidade da composição dos GUVs resultantes. Baykai-Caglar et al. mostrou que 14 GUVs formados a partir de lipossomas cuidadosamente desidratados apresentou uma menor variação de 2,5 vezes na temperatura de transição de miscibilidade GUVs formados a partir de misturas de diferentes fosfolipidos e colesterol. O trabalho indica que os lípidos, e especialmente o colesterol, pode precipitar a partir da mistura de lípidos, quando depositados a partir de solventes orgânicos, o que resulta em grande variação espacial da composição do filme de lípidos depositado. Isto é especialmente importante para os estudos de comportamento de fase da membrana lipídica, mas também pode ser crucial para as experiências quantitativas na função do canal iónico. Protocolo Baykal-Caglar et al &#39;s. É semelhante, mas não idêntico ao nosso, e os leitores são encorajados a estudar também. Este protocolo (ver descrição, a Figura 1) é uma das muitas que poderiam ser usadas. Em princípio, o sucesso da eletroformação depende da mistura de lípidos, a hidratação, a temperatura, outros solutos (principalmente iões), e deClaro que a tensão ea frequência usada em formação. Como eletropolimerização torna-se melhor compreendida, esperamos aperfeiçoar nosso protocolo mais. Finalmente, muitas vezes há uma curva de aprendizagem em galvanoplastia lipossomas gigantes. Sugerimos dominar o protocolo convencional (Seções 1 e 4, e, se necessário, Seção 5) antes de aprender a depositar lipídios a partir de suspensões de lipossomas (seções 2-5).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Multimeter</td>
			<td>Agilent Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td>
			<td>U1232A or similar</td>
			<td>Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>117 or 177</td>
			<td>Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>Agilent Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td>
			<td>33210A or similar</td>
			<td>Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 &Omega; load</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies, Loveland, CO <a href="http://www.delta-technologies.com" target="_blank">www.delta-technologies.com</a></td>
			<td>CB-90IN-S107 or similar</td>
			<td>Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Omega Engineering Stamford, CT <a href="http://www.omega.com" target="_blank">www.omega.com</a></td>
			<td>CNi3233 or similar</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygrometer</td>
			<td>Extech, Nashua, NH, <a href="http://www.extech.com" target="_blank">www.extech.com</a></td>
			<td>445815</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>McMaster-Carr Elmhurst, IL <a href="http://www.mcmaster.com" target="_blank">www.mcmaster.com</a></td>
			<td><a href="http://www.mcmaster.com/#87315K64" target="_blank">87315K64</a></td>
			<td>Use USP Grade VI silicone for its high purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMI gasket</td>
			<td>Laird Technologies <a href="http://www.lairdtech.com" target="_blank">www.lairdtech.com</a></td>
			<td>4202-PA-51H-01800 or similar</td>
			<td>Distributed by Mouser <a href="http://www.mouser.com" target="_blank">www.mouser.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TxR-DHPE</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA <a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank">www.lifetechnologies.com</a></td>
			<td>T1395MP</td>
			<td>Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL <a href="http://www.avantilipids.com" target="_blank">www.avantilipids.com</a></td>
			<td>850457P or 850457C</td>
			<td>Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPS</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034P/C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology

A reconstituição de canais de iões em membranas de lípidos quimicamente definidos para a gravação electrofisiológico tem sido uma técnica poderosa para identificar e explorar a função destas proteínas importantes. No entanto, as preparações clássicas, tais como bicamadas planares, limitar as manipulações e experiências que podem ser realizadas sobre o canal reconstituída e seu ambiente de membrana. A estrutura mais células como de lipossomas gigantes permite experimentos de patch-clamp tradicionais, sem sacrificar o controle do ambiente lipídico. Eletropolimerização é um meio eficiente para a produção de lipossomas gigantes&gt; 10 m de diâmetro, que se baseia na aplicação de tensão alternada a um filme lipídico fina, ordenado depositado sobre uma superfície do eletrodo. No entanto, uma vez que o protocolo clássico chama para os lipidos a ser depositados a partir de solventes orgânicos, que não é compatível com as proteínas de membrana menos robustas como canais iónicos e devem ser modificadas. Recentemente, protocols têm sido desenvolvidos para electroform lipossomas gigantes parcialmente desidratadas de lipossomas pequenos, que se adaptaram aos lipossomas contendo proteína no nosso laboratório. Apresentamos aqui a fundo, equipamentos, técnicas e armadilhas da eletropolimerização de lipossomas gigantes de pequenas dispersões de lipossomas. Começamos com o protocolo clássico, que deve ser dominado antes de tentar os protocolos mais difíceis que se seguem. Demonstramos o processo de desidratação parcial controlada de pequenos lipossomas utilizando o equilíbrio do vapor com as soluções salinas saturadas. Finalmente, demonstramos o próprio processo de eletroformação. Iremos descrever equipamentos, simples e barato, que pode ser feita em casa para produzir lipossomas de alta qualidade, e descrevem a inspecção visual da preparação, em cada fase para assegurar os melhores resultados.

Nos nossos exemplos, podemos preparar lipossomas a partir de uma mistura de cerca de 55 mol% de POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-fosfocolina), 15% molar POPS (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-fosfo , 30 mol% de colesterol e 0,1% molar de Texas Red-rotulado 1,2-dipalmitoil-sn-fosfoetanolamina (TxR-DPPE). Esta composição foi escolhida como representante de aproximadamente lípidos do gânglio da raiz dorsal 18. Notamos que 15% em mol carregada lípido (aqui POP) está perto do l...

Watch this Scientific Journal Video about Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology at JoVE.com

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

Reconstituindo as proteínas da membrana funcionais em lipossomas gigantes de composição definida é uma abordagem poderosa quando combinado com eletrofisiologia patch-clamp. No entanto, a produção de lipossomas gigante convencional pode ser incompatível com a estabilidade da proteína. Descrevemos protocolos para a produção de lipossomas gigantes de lípidos puros ou de pequenos lipossomas contendo canais de iões.

Preparação de lipossomas gigantes por Imagem e patch-clamp Eletrofisiologia

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

giant-liposome-preparation-for-imaging-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Biology

22.0K visualizações.  University of Washington. Reconstituindo as proteínas da membrana funcionais em lipossomas gigantes de composição definida é uma abordagem poderosa quando combinado com eletrofisiologia patch-clamp. No entanto, a produção de lipossomas gigante convencional pode ser incompatível com a estabilidade da proteína. Descrevemos protocolos para a produção de lipossomas gigantes de lípidos puros ou de pequenos lipossomas contendo canais de iões.

Vídeo: Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

Métodos para Recordings patch-clamp Capacitância da Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Biologia

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Gravação de patch-clamp de canais iônicos Expresso em Oócitos Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

Pressão polimento Pipetas para Gravação de patch-clamp melhorada

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can be used for many different studies, such as the characterization of membrane-active peptides, the reconstitution of ion channels or investigations on how changes in lipid bilayer properties alter the function of bilayer-spanning channels.  Here, we show how to form a planar bilayer and how to isolate small patches from the bilayer, and in a second video  will also demonstrate a procedure for using gramicidin channels to determine changes in lipid bilayer elastic properties.   We also demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. Here, we demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Preparação de Bicamadas Artificial para Experimentos Eletrofisiologia

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord Eletrofisiologia

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Explorando Arterial Músculo Liso KV7 função dos canais de potássio utilizando electrofisiologia patch clamp e Miografia Pressão

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

Introdução à membrana apoiada sólida baseada Eletrofisiologia

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...