We thank Susanne Fenz for discussing the possibility of reconstituting proteins by agarose swelling, Feng Ching Tsai for current measurements, and present and former members of the Bassereau group for support and assistance. The project was funded by the Agence Nationale de la Recherche (grant BLAN-0057-01), by the European Commission (NoE SoftComp), by the Universit&#233; Pierre et Marie Curie (grant from the FED21, Dynamique des Syst&#232;mes Complexes). M.G. was supported by an Institut Curie International PhD Fellowship, S.A. by a fellowship from the Fondation pour la Recherche M&#233;dicale, G.E.S.T. by a Marie Curie Incoming International Fellowship from the European Commission and a grant from the Universit&#233; Pierre et Marie Curie. The publication fees were covered by the Labex &#8216;CelTisPhyBio&#8217; (ANR-11-LABX0038).

1. Preparação de Solução <ol><li> Prepare 5 ml de &quot;tampão de SUV contendo 5 mM de KCl, 1 mM de HEPES (pH 7,4) ou TRIS (pH 7,5), e 2 mM de trealose. Filtra-se o tampão com um filtro de seringa de 0,2 um e dividir em alíquotas de 1 ml, que podem ser armazenadas a -20 ° C. NOTA: Detalhes adicionais para reagentes e instrumentos são indicados na lista de materiais. </li><li> Prepare 40 ml de GUV &#39;Crescimento Buffer&#39; que vai encher o interior GUV durante a reidratação filme. Para um crescimento &quot;baixo teor de sal&quot;, combinar KCl 5 mM, HEPES 1 mM (pH 7,4) ou 1 mM de TRIS (pH 7,5), e ~ 400 mM de sacarose. Para um crescimento &#39;de sal fisiológico, combinar KCl 100 mM, HEPES 5 mM (pH 7,4) ou 5 mM de Tris (pH 7,5), e ~ 200 mM de sacarose. </li><li> Preparar 40 ml de &quot;Tampão de Observação &#39;para a solução externa na câmara experimental através da combinação de KCl 100 mM, HEPES 5 mM (pH 7,4) ou 5 mM de Tris (pH 7,5), e ~ 200 mM de glucose. NOTA: Estes buffers são apenas examples. Veja a discussão para adaptar os buffers para outras experiências. </li><li> Meça as osmolaridades do crescimento e da observação buffers com um osmômetro. Adicionar grânulos de sacarose ou glicose para combiná-los para dentro de 1%, de modo que não irá lisar GUVs ou entrar em colapso quando transferido a partir da câmara de crescimento para a câmara de observação. NOTA: Nesta gama de concentração, a adição de 1 mM de sacarose (13,7 mg por 40 ml) ou glucose (7,2 mg por 40 ml) aumenta a osmolaridade por ~ 1 mOsm. </li><li> Filtrar os tampões de crescimento e observação com um filtro de 0,2 um e armazená-las a 4 ° C para inibir o crescimento bacteriano. </li><li> Dissolve-se 50 mg de beta-caseína em 10 ml de TRIS 20 mM (pH 7,5) tampão para formar uma solução de beta-caseína de 5 mg / ml necessária para passivar as superfícies de câmaras experimentais de modo que não aderem GUVs, espalhou-e-rajada. Uma vez que a beta-caseína está completamente dissolvido (até várias horas a 4 ° C), filtra-se (0,2 um) em que alíquotas de 0,5 ml, que pode ser rapidamente congelados e armazenadosa -20 ° C para uso posterior (descongeladas aliquotas armazenadas a 4 ° C pode ser usada tipicamente para até 1 semana). </li></ol> 2. Preparação SUV <ol><li> Prepare e congelar alíquotas de PROTEO-SUVs seguindo o protocolo detalhado previamente publicado 28. Use KvAP marcado por fluorescência com Alexa-488 maleimida, reconstituída em DPhPC SUVs (10 mg / ml) a uma relação de proteína para lípido de 1:10 (em massa). NOTA: Tipo selvagem KvAP contém uma cisteína por monómero localizado perto do terminal C intra-celular (aminoácido 247). </li><li> Fluorescentes, só em lípides SUVs: NOTA: Manusear clorofórmio sob uma coifa vestindo luvas de borracha nitrílica e óculos de segurança. Evitar a utilização de qualquer plástico como o clorofórmio pode dissolvê-los. Soluções de clorofórmio pode ser armazenada em frascos de vidro âmbar com tampas de Teflon e transferido utilizando seringas de vidro. Tome cuidado para lavar todos os vidros pelo menos 5 a 10 vezes com clorofórmio, antes e após a pipetagem lipídios. <ol><li> Preparar 100 ul de10 SUVs mg / ml DPhPC contendo 0,5% molar do lípido fluorescente vermelho, vermelho do Texas DHPE, por mistura de 100 ul de solução DPhPC (10 mg / ml em clorofórmio) com 8,2 ml de solução de vermelho de Texas-DHPE (1 mg / ml em metanol) num frasco de vidro âmbar de 1,5 mL. </li><li> Secam-se os lípidos para baixo sob uma corrente de azoto numa campânula química durante a rotação do frasco. Quando o filme parece ser seco, colocar os lípidos em vácuo durante 3 horas para remover qualquer solvente residual. </li><li> Adicionar 100 mL de tampão de SUV para os lipídios, e vortex vigorosamente até não lipídica permanece preso às paredes do frasco e a solução é uniformemente leitoso. </li><li> Sonicar a solução de lípido para formar SUVs. Ajuste a posição frasco até o ultra-som faz com que a maior parte do movimento e fluxo dentro do frasco, e tomar cuidado para não aquecer a solução desnecessariamente. Continue a sonicação até que a solução se tornar translúcido, ou, quando possível, transparente (2-5 min para a ponta ultra-sons, ~ 20 min para o banho de ultra-sons). </li><li> AliquoSUVs t (por exemplo, 10 jul ou 20 l) e congelamento (-20 ° C) para uso posterior. NOTA: Os lipídios, principalmente lipídios insaturados, pode facilmente avaria. Soluções lipídicas loja a 20 ° C (ou 80 ° C), sob árgon e utilizar no prazo de 6 meses. Produtos de degradação de lipidos pode ser detectada com a cromatografia em camada delgada. </li></ol></li></ol> 3. GUV Crescimento por eletroformação <ol><li> Prepare a câmara eletroformação. <ol><li> Se a câmara não tenha sido limpo, retire as janelas, limpar tudo selante e graxa, extrair os fios, e lavar e esfregar a câmara com um lenço de papel, utilizando água e etanol (≥70%), alternadamente. </li><li> Esfregar os fios bem, submergir os fios e câmara em acetona, e sonicar durante 5 minutos. Limpe tudo com um tecido novamente usando acetona. Coloque a câmara em etanol e sonicado durante 5 minutos. </li><li> Monte a câmera, inserindo os fios através dos furos, e gire e limpe os fios para se certificar de que eles are limpo. Coloque a câmara em água destilada, sonicar durante 5 minutos e secar a câmara com uma corrente de azoto ou de ar. </li></ol></li><li> Preparar 30 ul de 3 mg / ml de suspensão de SUVs em tampão de SUV. Para formar GUVs contendo proteínas, combinar 8 ul de SUVs (Proteo-DPhPC 10 mg / ml KvAP 1:10), 2 ul de SUVs fluorescentes (10 mg / ml DPhPC, 0,5 mol% TexasRed-DHPE) e 20 ul de SUV tampão num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para um final de proteína lipídica (massa) proporção de 1 para: 12,5 e de 0,1% molar TexasRed-DHPE. Misture a solução vigorosamente. <ol><li> Alternativamente, para a prática do protocolo com apenas SUVs lípidos, simplesmente combinar 10 ul de SUVs fluorescentes (10 mg / ml DPhPC e 0,5 mol% TexasRed-DHPE) com tampão de SUV 20 ul. </li></ol></li><li> Depositar o Solution SUV. <ol><li> Usar uma pipeta 2 mL ou 5 mL de seringa de vidro para depositar pequenos (&lt;0,2 ul) gotículas da solução SUV nos fios. Cerca de 1 ml de solução é necessário para formar uma série de gotas ao longo1 cm de fio. Certifique-se de que as gotas são pequenos o suficiente e separados o suficiente que eles não se tocam ou fusível. </li><li> Deixe os SUVs depositados secar por ~ 30 min, ao ar livre. Quando todas as gotas se instalaram, girar o fio de modo que os depósitos lipídicos são mais fáceis de observar ao microscópio. NOTA: Se os SUVs não secar o suficiente, eles podem simplesmente lavar os fios quando o buffer de crescimento é adicionado, durante a secagem em excesso pode danificar a proteína. Por causa da humidade do ar influencia a taxa de secagem, o tempo de secagem e / ou humidade do ar pode ser ajustado para obter resultados óptimos 30. A película lipídica sobre os fios devem ser visíveis ao microscópio. </li></ol></li><li> Monte a câmara. <ol><li> Fecha-se o fundo da câmara: Use uma seringa para aplicar graxa de vácuo para o fundo da câmara em torno dos três poços e prima de 40 mm x 22 milímetros lamela suavemente contra ele para selar o fundo da câmara de modo que ela adere, sem uma lacuna. Selar os lados da câmara (onde a saída fios) comvedação colar. Aplicar graxa de vácuo na parte superior da câmara que define os três poços. </li><li> Lentamente adicionar tampão de crescimento, até que cada poço é enchido até ao topo. Evitar qualquer movimento rápido da solução nos poços como este pode remover a película de lípido fora dos eléctrodos. </li><li> Feche a câmara pressionando o cursor superior tampa com cuidado sobre a graxa, tendo o cuidado para não deslocar a lamela inferior. Use um tecido para remover quaisquer gotas de tampão nas bordas de topo da tampa deslizante. NOTA: Este é um bom momento para examinar a câmara sob o microscópio para confirmar que o filme lipídico manteve-se nos fios. </li></ol></li><li> Ligue o gerador de sinais para os fios usando duas garras jacaré. Defina a frequência (onda senoidal de 10 Hz / 500 Hz para o buffer de sal baixo / alto) e usar um multímetro para medir e ajustar a tensão sobre os fios para 0,7 / 0,35 V raiz quadrada (Vrms) para o buffer de sal de baixa / média alta. Cubra a câmara com folha de alumínio para proteger os fluorophores da luz. Deixar tele GUVs a crescer durante 2 a 3 horas para o tampão de baixa salinidade, e 12 hr ou O / N para o tampão de alto teor salino. </li><li> Desligue a câmara do gerador e coloque-o cuidadosamente em um microscópio invertido para avaliar o crescimento GUV. Use, movimentos lentos ou estacionários fluxo de fluido nas cavidades prematuramente pode separar GUVs dos fios. NOTA: GUVs nas extremidades dos fios são normalmente visíveis no contraste de fase (objectiva 40X longa distância de trabalho), enquanto GUVs em qualquer lugar sobre a metade inferior dos fios pode ser visto com epifluorescência. Se não há GUVs são visíveis, tente rodar os fios de olhar para a superfície superior. GUVs pode ser armazenado a 4 ° C numa câmara de crescimento durante vários dias. </li></ol> 4. GUV Crescimento por inchaço Gel-assistida <ol><li> Preparar 10 ml de uma solução de agarose a 1% através da mistura de 100 mg de agarose com 10 ml de água pura. Aqueça até ferver, colocando-o no microondas a 480 W para ~ 20 seg. Mexa para certificar-se da agarose esteja completamente dissolvido. NOTA: A soluçãopode ser armazenada a 4 ° C e reaquecido quando necessário. </li><li> Plasma-clean (plasma de ar) uma tampa-slide durante 1 minuto para que a solução de agarose vai se espalhar muito bem nele. Usar a tampa-slides no próximo 15 min como o efeito de limpeza plasma desaparece rapidamente. </li><li> Aplicar 200 ul de solução de agarose quente para cada um de 22 x 22 mm 2 de modo deslizante a solução molha toda a superfície. Incline a deslizar verticalmente e tocar a borda inferior a um tecido para remover o excesso de líquido e deixar apenas uma camada lisa fina de agarose no slide. </li><li> Coloque o slide em uma chapa quente ou um forno a 60 ° C e deixe-o secar por pelo menos 30 min. O filme agarose é pouco visível a olho nu. Após as lâminas de arrefecer até à TA, utilizá-los imediatamente, ou armazenar para até uma semana num recipiente fechado a 4 ° C. </li><li> Coloque a lamela revestida de agarose em um padrão de 3,5 centímetros de Petri. </li><li> Preparar a solução de SUV tal como na Secção 3.2 e aplica ~ 15 ul da solução de SUV (3 mg / ml de lípido) em~ 30 muito pequenas gotas suavemente sobre a superfície de agarose. Tome cuidado para não distorcer a camada de agarose demais. </li><li> Colocar a lâmina sob uma ligeira corrente de azoto durante cerca de 10-15 min e a seguir a evaporação do tampão por olho como as gotículas de secar. </li><li> Assim que os SUVs terem secado, adicionar tampão de crescimento para cobrir a superfície da lâmina. Para uma pequena 3,5 centímetros prato Petri uso ~ 1 ml de tampão. </li><li> Permitir que o inchaço prosseguir durante ~ 30 min, e então analisar o crescimento de GUVs na câmara utilizando um microscópio invertido com contraste de fase ou de contraste de interferência diferencial (DIC). NOTA: observação epifluorescência é difícil devido à forte fundo de fluoróforos em gel e a auto-fluorescência da agarose. </li></ol> 5. Colheita e Observing GUVs <ol><li> Passivate a câmara de observação (por exemplo, pequena placa de Petri ou lamela de vidro) para que GUVs não furar, espalhar e explodiu na parte inferior da câmara. Cubra a chamber inferior com uma solução de beta-caseína, incubar durante 5 min, lavar-se a solução de caseína com água pura e seca com uma corrente de ar ou de azoto, e, finalmente, adicionar tampão de observação (por exemplo, ~ 5 mm de profundidade por uma pequena placa de Petri). </li><li> Colher as GUVs. Cortar a extremidade de uma pipeta de 100 uL dicas de modo que a abertura é maior (~ 2 mm de diâmetro), aspira-se lentamente e como a tensão de corte de pipetagem pode facilmente destruir GUVs. <ol><li> Para GUVs formado eletrointensivas, abra a câmara de crescimento, removendo suavemente a parte superior lamela. Coloque a ponta da pipeta diretamente acima de cada fio e aspirado ~ 50 ul enquanto se move a ponta da pipeta ao longo do fio de separar os GUVs. NOTA: Pode ajudar a girar a fio para coletar GUVs sobre o &quot;outro lado&quot; do fio. </li><li> Para GUVs &quot;inchaço&quot; assistida-gel, primeiro toque no lado do prato de petri algumas vezes para ajudar os GUVs desprendimento da superfície da lamela. Posicione a ponta da pipeta logo acima da lamela e aspirado de 50 ul enquanto pulling a ponta para trás sobre a superfície. Transferir directamente GUVs colhidas para uma câmara de observação, ou armazenar em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, a 4 ° C durante até 1 semana. </li></ol></li><li> Coloque a câmara de observação em um microscópio invertido, adicione as GUVs à câmara de observação, e aguarde alguns minutos para que os GUVs para se depositam no fundo da câmara. </li><li> Levantamento da câmara com contraste de fase ou DIC para localizar rapidamente lisas, esféricas (&#39;defeito livres) &quot;candidatos guv&quot;. Examine cada &quot;candidato GUV&quot; em epifluorescência para excluir quaisquer que contêm lipossomas menores aninhados dentro. Finalmente, verificar que a intensidade de fluorescência de lípidos é uniforme e compatível com uma única membrana (ou seja, unilamelar). NOTA: Em alguns bilamellar (ou multi-lamelares) vesículas, as membranas são muito próximos de ser resolvidas para que eles apareçam unilamelar em contraste de fase ou imagens DIC. No entanto, estes objectos podem ser distinguidos dos unilame realGUVs Llar por sua fluorescência de lípidos, que é duas vezes (ou mais) brilhantes. </li></ol> 6. GUVs de fixação de Patch <ol><li> Faça pipetas de patch com um diâmetro de ponta 1-2 mm de vidro de borosilicato capilar padrão usando o programa recomendado para o extrator pipeta. NOTA: tratamentos especiais, tais como polimento fogo não são necessários, e pipetas pode ser utilizado para vários dias depois de terem sido puxados se forem mantidos dentro de uma caixa fechada. </li><li> Passivar a câmara de incubação com uma solução de beta-caseína (5 mg / ml) para assegurar que não aderem GUVs, e espalhar sobre as superfícies da câmara de ruptura. Lavar a caseína fora após 5 min. </li><li> Insira o eletrodo de aterramento, encher a câmara com tampão de observação, transferir 10 mL da suspensão de GUV como descrito no passo 5.2 e 5.3, e aguarde alguns minutos para que os GUVs para assentar no fundo. </li><li> Encha uma pipeta remendo fresco com a solução (buffer de observação ou outra solução iso-osmótica) emontá-lo no amplificador headstage patch-clamp. </li><li> Pesquisa através da câmara para localizar um GUV &quot;sem defeitos&quot;, como descrito na seção 5.4, e verifique se ele contém proteína fluorescente. </li><li> Aplicar uma pressão positiva constante (&gt; 100 Pa, ou H 2 O em um manômetro de cerca de 1 cm) para manter a pipeta remendo interior limpo, e inserir a pipeta de patch para a câmara. Traga a pipeta de patch para o campo de visão, aplicar pulsos de teste para medir / compensar o deslocamento e resistência à tensão pipeta, e examinar a pipeta sob iluminação fluorescente para confirmar que a dica é limpo. </li><li> Traga a pipeta de patch para o GUV e, se necessário, simultaneamente, reduzir a pressão positiva para que o fluxo de saída da pipeta patch não fazer a GUV &quot;fugir&quot;. Quando a pipeta patch está perto do GUV, aplicam uma pressão negativa (até 5 cm de H 2 O) para puxar o GUV contra a pipeta patch. Monitorar a resistência como o &quot;; Língua &quot;de membrana GUV entra na pipeta patch e as formas gigaseal. </li><li> Se um gigaseal não formaram, remova a pipeta patch da câmara e volte para o passo 6.4. Se o patch membrana formada uma gigaseal, mas a GUV permanecer ligado à pipeta, extirpar o patch puxando para longe do GUV, estourando a GUV contra o fundo da câmara, ou brevemente movendo a pipeta da solução. </li><li> Quando o remendo de membrana de dentro para fora foi excisada do GUV e o gigaseal é estável, desligar os pulsos de teste e aplicar um protocolo de tensão tal como o mostrado na Figura 13. NOTA: Figura 13 segue a convenção eletrofisiológico padrão para um patch de dentro para fora na qual a corrente que flui para o patch-eletrodo é &quot;positivo&quot;, e V = V banho - V pipeta. Segurando o remendo a um potencial negativo (por exemplo, V = -100 mV) para ~ 30 segundos lugares KvAP em estado de repouso, enquanto etapas (100 ms a 5 segundos) para potenciais mais positivos (por exemplo, V = 100 mV) pode, então, dirigir-la em Regência (ie, abertos) estados ativos. </li><li> Após as medições em um patch membrana terminar, quebrar o patch com um pulso zap ou pressão e verifique se o deslocamento do eletrodo remendo tensão não se afastou. Retirar a pipeta patch da câmara, e volte para o passo 6.4. </li></ol>

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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution,+lateral+mobility+and+function+of+membrane+proteins+incorporated+into+giant+unilamellar+vesicles.">Distribution, lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).</li><li>Girard, P., Prost, J., Bassereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+or+Active+Fluctuations+in+Membranes+Containing+Proteins.">Passive or Active Fluctuations in Membranes Containing Proteins.</a> Physical Review Letters. 94 (8), 088102 (2005).</li><li>Betaneli, V., Petrov, E. P., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Lipids+in+VDAC+Oligomerization.">The Role of Lipids in VDAC Oligomerization.</a> Biophysical Journal. 102 (3), 523-531 (2012).</li><li>Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+an+archaebacterial+voltage-dependent+K++channel.">Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel.</a> Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structure+of+a+voltage-dependent+K++channel.">X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel.</a> Nature. 423 (6935), 33-41 (2003).</li><li>Aimon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Reconstitution+of+a+Voltage-Gated+Potassium+Channel+in+Giant+Unilamellar+Vesicles.">Functional Reconstitution of a Voltage-Gated Potassium Channel in Giant Unilamellar Vesicles.</a> PLoS ONE. 6 (10), e25529 (2011).</li><li>Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. -. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+a+Kv+Channel+into+Lipid+Membranes+for+Structural+and+Functional+Studies.">Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), (2013).</li><li>Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+giant+unilamellar+vesicles+from+damp+lipid+film+for+better+lipid+compositional+uniformity.">Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (11), 2598-2604 (2012).</li><li>Suchyna, T. M., Markin, V. 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L., Leonil, J., Chanat, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;S1-casein,+which+is+essential+for+efficient+ER-to-Golgi+casein+transport,+is+also+present+in+a+tightly+membrane-associated+form.">&#945;S1-casein, which is essential for efficient ER-to-Golgi casein transport, is also present in a tightly membrane-associated form.</a> BMC Cell Biology. 11 (1), 1-15 (2010).</li><li>Garten, M., Toombes, G. E. S., Aimon, S., Bassereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+Voltage+Dependent+Proteins+with+Giant+Unilamellar+Vesicles+in+a+&#8220;Whole+Cell&#8221;+Configuration.">Studying Voltage Dependent Proteins with Giant Unilamellar Vesicles in a &#8220;Whole Cell&#8221; Configuration.</a> Biophysical Journal. 104 (2), 466a (2013).</li><li>Crowe, L. M., Reid, D. S., Crowe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+trehalose+special+for+preserving+dry+biomaterials.">Is trehalose special for preserving dry biomaterials.</a> Biophysical Journal. 71 (4), 2087-2093 (1996).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Sistemas de modelos biomiméticos são uma ferramenta importante para o estudo das propriedades e interações de proteínas e membranas. Em comparação com outros sistemas reconstituídos como MBL ou membranas lipídicas suportados, GUV sistemas baseados apresentam várias possibilidades incluindo controlo considerável de composição da membrana, a tensão e a geometria, bem como sendo verdadeiramente livre de óleo. No entanto, a incorporação de proteínas transmembrana, como KvAP, em GUVs requer adaptações sig...

Ao estudar os princípios físicos que regem os sistemas vivos, as abordagens bottom-up permitem um experimentalista para controlar composição do sistema e outros parâmetros que não são facilmente manipulados em sistemas baseados em células 1. Para os processos baseados em membrana, gigante Vesículas Unilamelares (GUVs, diâmetro ~ 1-100 mm) têm provado ser um sistema muito útil biomiméticos 2-7 como eles são adequados para estudos de microscopia e micromanipulação de 8 - 10. Embora existam muitos protocolos diferentes para produzir GUVs, a maioria se dividem em duas categorias - emulsão base aproxima 11,12 e técnicas baseadas em reidratação um filme lipídico 13-16. Em métodos baseados em emulsão, os folhetos interiores e exteriores das membranas de GUV são montados sequencialmente a partir de monocamadas de lípido nas interfaces água / óleo. Esta abordagem é ideal para a encapsulação de proteínas solúveis comnas GUVs, e para a formação de GUVs com composição lipídica folheto assimétrica. No entanto, GUVs formados a partir de emulsões podem reter vestígios de solvente que alterem as propriedades mecânicas da membrana 17, e a abordagem não é especialmente bem adequado para a reconstituição da proteína trans-membrana. Métodos de reidratação Filme contar com o facto de secagem (desidratação) faz com que muitas misturas de lipidos para formar uma pilha multi-lamelar de membranas. Se esta pilha é então colocado em contacto com um tampão aquoso, membranas na pilha vai mover fluxos separados como solvente e entre eles na superfície da pilha, as membranas individuais podem separar para formar GUVs 13,18 (bem como um verdadeiro zoológico de outros objetos lipídicas). No entanto, mesmo para composições de tampão e ótimos de lipídios, este método clássico &quot;inchaço espontânea&quot; tem um rendimento relativamente baixo de GUVs livres de defeitos. Um método amplamente utilizado para aumentar o rendimento de GUVs sem defeitos é &quot;eletroformação221 ;, em que um campo de corrente alternada (CA) é aplicada durante a re-hidratação do filme. Embora o mecanismo ainda pouco compreendida, &quot;eletroformação&quot; pode dar espetaculares rendimentos guv (&gt; 90%, em circunstâncias favoráveis) para buffers de baixa concentração de sal (&lt;5 mm) 14,19, e pode até mesmo trabalhar em tampões fisiológicos (~ 100 mM), utilizando uma freqüência mais alta (500 Hz versus 10 Hz) campo AC e eletrodos de platina 15. Uma abordagem alternativa para aumentar o rendimento de GUVs livres de defeitos é &quot;assistida-gel inchaço&quot;, em que a solução de lípidos é depositada sobre um substrato de gel polimérico, em vez de o passivo (por exemplo, vidro, PTFE) substratos utilizados em clássica &quot;inchaço espontâneo &quot;. Quando o filme lipídico / gel resultante é reidratado, GUVs pode formar rapidamente, mesmo para tampões fisiológicos 16,20. Todos estes métodos podem produzir GUVs apenas em lípidos que podem ser utilizados para estudar os fenómenos de membrana associada, tais como ointeracção entre proteínas e membranas solúveis. No entanto, a incorporação de uma proteína trans-membrana em GUVs, são necessárias modificações significativas para assegurar que a proteína permanece num estado funcional durante todo o processo de reconstituição. Embora as soluções de lípidos em solventes orgânicos (por exemplo, clorofórmio, ciclo-hexano) são ideais para a produção de filmes de lípidos, proteínas trans-membranares são tipicamente estáveis ​​apenas quando o seu domínio transmembranar hidrófobo é incorporado numa bicamada lipídica, ou rodeado por uma micela de detergente ( por exemplo, durante a purificação de proteínas). Assim, o material de partida para uma reconstituição é tipicamente membranas nativas, a proteína purificada em uma solução de detergente, ou de pequenas vesículas unilamelares contendo proteínas (Proteo-SUVs) e / ou vesículas multi-lamelares (MLVs-proteo) formados por remoção de detergente na presença de lipídios. A maioria dos métodos para incorporar estas proteínas de membrana em GUVs se dividem em três categorias. Insertio Direton: proteína Trans-membrana suspensa em detergente é misturado com pré-formadas, lipídeos-somente, GUVs solubilizados levemente detergentes, e o detergente em seguida, removido usando BIOBEADS 21. Embora conceptualmente simples, este método requer um controlo preciso da concentração de detergente, como uma concentração demasiado elevada de detergente possa dissolver os GUVs enquanto uma concentração demasiado baixa pode causar a proteína se desdobrar ou agregado. GUV / Proteo-SUV Fusão: Proteína em PROTEO-SUVs é combinado com pré-formadas, lipídico-somente GUVs e fusão é facilitada com peptídeos fusogénicos especiais 22 ou detergente 21. Normalmente a extensão da fusão é limitado levando a GUVs com baixa densidade de proteína. Desidratação / A re-hidratação: Um filme de lípido contendo a proteína é formada por desidratação parcial de um proteo-SUV (ou proteo-MLV) e solução GUVs são então crescidas como para uma película de lípido puro. O desafio é óbvio para proteger a proteína durante o dehydrati parcialna etapa 23, mas o método tem sido utilizado com sucesso para reconstituir as proteínas trans-membranas, tais como a bacteriorodopsina, Cálcio-ATPase, integrina e VDAC em GUVs 7,23 - 25. Este artigo descreve protocolos de desidratação / re-hidratação para fazer GUVs contendo o canal de potássio dependentes da voltagem, KvAP, de Archaea, Aeropyrum pernix hiper-termofílica. KvAP tem um elevado grau de homologia com os canais de potássio dependentes da voltagem eucariótica 26 e uma estrutura de cristal conhecida 27 , tornando-se um bom modelo para estudar o mecanismo de gating tensão. Produção dos Proteo-SUVs foi descrito em pormenor anteriormente e não faz parte deste tutorial 26,28,29. Importante, KvAP Proteo-SUVs não tem que ser produzido para cada preparação GUV, como elas podem ser armazenadas em pequenas (por exemplo, 10 ul) alíquotas a -80 ° C durante períodos de tempo prolongados (&gt; 1 ano). Eletroformaçãoou inchaço assistida-gel pode então ser usado para cultivar as GUVs de Proteo-SUVs KvAP (ou proteo-MLV). Os passos chave para o protocolo eletroformação estão ilustrados na Figura 1. As gotas de uma solução de SUVs que contêm a proteína é depositada em fios de platina (mostrado na Figura 2). Desidratação parcial da suspensão de SUV leva à formação de uma película de lípido, através da proteína de fusão de SUVs. Durante a hidratação, um campo de CA é aplicada aos eléctrodos, para auxiliar as camadas lipídicas para delaminar e formar GUVs. Um campo de 10 Hz funciona bem quando se usa &quot;baixo teor de sal&quot; (&lt;5 mm) tampão de reidratação 28 e GUVs levar várias horas para crescer. Em contraste, tampões fisiológicos (contendo ~ 100 mm sal) funcionam bem com uma tensão mais baixa, de 500 Hz campo AC, mas exigem uma prolongada (~ 12 horas) período de 15 inchaço. Este método é baseado em um protocolo anterior usando ITO desliza 24, mas usa uma câmara cont customaining dois fios de platina, como mostrado na Figura 2 (veja a discussão de detalhes do projeto e sugestões para o mais simples, câmaras improvisado). A Figura 3 ilustra o método de inchaço assistida-gel. O protocolo funciona bem com tampões com concentrações fisiológicas de sal, é rápido, e produz GUVs com uma distribuição mais homogênea da proteína. No entanto, o rendimento de, GUVs aparentemente livres de defeitos isolados (ou seja, a membrana GUV é uniforme no comprimento escalas ópticos e não coloque nenhum objeto) é menor, embora ele fornece um número suficiente para patch-clamp e experimentos de manipulação de micro- . Este método foi baseado num protocolo utilizando gel de agarose para produzir GUVs apenas em lipidos 16 e requer menos equipamento especializado do que o método da eletroformação. A caracterização de GUVs com microscopia de fluorescência é descrito, bem como procedimentos que utilizam um padrão de patch-clamp set-up paramedir a atividade KvAP no &quot;inside-out&quot; extirpado pedaços de membrana. Cultivo GUVs contendo proteína pode ser mais difícil do que GUVs apenas em lípidos. Em particular, o rendimento final GUV pode dependem sensivelmente exactamente como a solução SUV é depositado e desidratada para formar a pilha de membrana. Para alguém sem experiência anterior com GUVs, pode ser útil para a primeira GUVs crescer apenas em lípidos, segundo um protocolo convencional de 15,16 em que a folha de membrana é formada pela deposição de lípidos a partir de um solvente orgânico. Uma vez que o protocolo convencional funciona bem, deposição SUV e desidratação parcial pode, então, ser dominado usando SUVs apenas em lípidos, que são também muito útil quando se ajusta o protocolo para uma nova composição de lípido. Quando GUVs crescer de forma confiável a partir de SUVs apenas em lipídios, então é apenas um pequeno passo para produzir GUVs contendo proteínas de PROTEO-SUVs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="599">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Name of the 
			Material/Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:155px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:149px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>850356P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">Egg PC L-&#945;-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>840051P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Egg PA L-&#945;-phosphatidic acid (Egg, Chicken)</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>840101P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">18:1 (&#916;9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>850375P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">cholesterol (ovine wool, &#62;98%)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>700000P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">TRed-DHPE</td>
			<td style="width:132px;">Invirtogen</td>
			<td>T-1395MP</td>
			<td style="width:149px;">labeled lipid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">BPTR-Ceramide</td>
			<td style="width:132px;">Invirtogen</td>
			<td>D-7540&#160;</td>
			<td style="width:149px;">labeled lipid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Choloroform</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>22711.290</td>
			<td style="width:149px;">AnalaR Normapur</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Acetone</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>20066.296</td>
			<td style="width:149px;">AnalaR Normapur</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Ethanol</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>20821.330</td>
			<td style="width:149px;">AnalaR Normapur</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Kimwipe</td>
			<td style="width:132px;">Kimtech</td>
			<td>7552</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Hamilton syringes&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Hamilton Bonaduz AG</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">diverse</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Amber vials and teflon cups</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>SU860083 and SU860076</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Parafilm</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>291-1214</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:132px;">eppendorf</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">diverse</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Agarose</td>
			<td style="width:132px;">Euromex</td>
			<td style="width:155px;">LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Sucrose</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>84097-1kg</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Glucose&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>G8270-1kg</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Trehalose</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>T9531-25G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">KCl</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>P9333-1kg</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Hepes</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>H3375-100G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">TRIS</td>
			<td style="width:132px;">Euromex</td>
			<td>EU0011-A</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Osmometer</td>
			<td style="width:132px;">Wescor</td>
			<td>Vapro</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">pH meter</td>
			<td style="width:132px;">Schott instruments</td>
			<td>Lab850</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Sonicator</td>
			<td style="width:132px;">Elmasonic</td>
			<td>S 180 H</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td style="width:132px;">Sartorius steim</td>
			<td>Minisart 16532</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Function generator</td>
			<td style="width:132px;">TTi</td>
			<td>TG315</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Platinum wires</td>
			<td style="width:132px;">Goodfellow</td>
			<td>LS413074</td>
			<td style="width:149px;">99.99+%, d=0.5mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Polytetrafluoroethylene</td>
			<td style="width:132px;">Goodfellow</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Dow Corning &#39;high vacuum grease&#39;</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>1597418</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">sealing paste</td>
			<td style="width:132px;">Vitrex medical A/S, Denmark</td>
			<td>REF 140014</td>
			<td style="width:149px;">Sigillum Wax</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Cover slides 22x40 mm No1,5</td>
			<td style="width:132px;">VWR&#160;</td>
			<td>631-0136</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Cover slides 22x22 mm No1,5</td>
			<td style="width:132px;">VWR&#160;</td>
			<td>631-0125</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">plasma cleaner</td>
			<td style="width:132px;">Harrick</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td style="width:149px;">airplasma, setting &#39;high&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">petri dishes</td>
			<td style="width:132px;">Falcon BD</td>
			<td>REF 353001</td>
			<td style="width:149px;">3.5 cmx1cm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">patch clamp amplifier</td>
			<td style="width:132px;">Axon instruments</td>
			<td>Multiclamp700B</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">DAQ Card</td>
			<td style="width:132px;">National Instruments</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Labview</td>
			<td style="width:132px;">National Instruments</td>
			<td>version 8.6</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">Glass pipettes boro silicate OD 1mm ID 0.58mm</td>
			<td style="width:132px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>GC100-15</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Electrode holder</td>
			<td style="width:132px;">Warner Instruments&#160;</td>
			<td>Q45W-T10P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:132px;">Sutter&#160;</td>
			<td>MP-285</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">pipette puller</td>
			<td style="width:132px;">Sutter&#160;</td>
			<td>P-2000&#160;</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Camera</td>
			<td style="width:132px;">ProSilica&#160;</td>
			<td>GC1380</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Zeiss microscope</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td>Axiovert 135</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">Objective</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">40x long working distance, Phase contrast</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Objective&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">100x Plan-Apochromat NA 1.3</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Filterset GFP (for Alexa-488)</td>
			<td style="width:132px;">Horiba</td>
			<td>XF100-3</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Filterset Cy3 (for TexasRed)</td>
			<td style="width:132px;">Horiba</td>
			<td>XF101-2</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">beta-casein</td>
			<td style="width:132px;">Sigma&#160;</td>
			<td>C6905-1G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">confocal microscope</td>
			<td style="width:132px;">Nikon Eclipse TE 2000-E</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">D-Eclipse C1 confocal head</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Objective</td>
			<td style="width:132px;">Nikon</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">Plan Fluor 100&#215; NA1.3</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">matlab</td>
			<td style="width:132px;">Mathworks</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">for image processing and analysis of the current traces</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, kvap, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies

Gigante Unilamelares vesículas (GUVs) são um sistema biomimético popular para estudar membrana fenômenos associados. No entanto, vulgarmente utilizados protocolos para crescer GUVs deve ser modificado de modo a formar GUVs contendo proteínas transmembranares funcionais. Este artigo descreve dois métodos de desidratação-reidratação - eletroformação e inchaço assistida-gel - para formar GUVs contendo o canal de potássio voltagem-dependentes, KvAP. Em ambos os métodos, a solução de pequenas vesículas unilamelares contendo proteína é parcialmente desidratado para formar uma pilha de membranas, o qual é, em seguida, deixadas inchar em um tampão de reidratação. Para o método da eletroformação, o filme é depositado sobre eléctrodos de platina, de modo que um campo CA pode ser aplicada durante a re-hidratação do filme. Em contraste, o método inchaço assistida-gel usa um substrato de gel de agarose para melhorar a hidratação do filme. Ambos os métodos podem produzir GUVs em (por exemplo, 100 mM), as concentrações baixas (por exemplo, 5 mM) e salinas fisiológicas. Os GUVs resultantes são caracterizados através de microscopia de fluorescência, e a função dos canais reconstituídos medida usando a configuração de patch-clamp de dentro para fora. Enquanto inchaço na presença de um campo eléctrico alternado (eletroformação) dá um rendimento elevado da GUVs livres de defeitos, o método inchaço assistida-gel produz uma distribuição de proteína mais homogénea e não requer nenhum equipamento especial.

O crescimento de GUVs pode ser rapidamente avaliada examinando a câmara de crescimento sob o microscópio. Para eletroformação, os GUVs tendem a crescer em grupos ao longo dos fios de platina, tal como mostrado na Figura 4. Durante inchaço assistida-gel, GUVs aparecem como estruturas esféricas que crescem rapidamente e fundem em conjunto (Figura 5). GUVs sem defeitos são mais facilmente identificados e avaliados após a transferência para uma câmara ...

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Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

A reconstituição da proteína transmembranar, KvAP, em vesículas unilamelares gigantes (GUVs) é demonstrada por dois métodos de desidratação-re-hidratação - eletroformação, e inchaço assistida-gel. Em ambos os métodos, vesículas pequenas unilamelares que contêm a proteína são fundidos em conjunto para formar GUVs que pode, em seguida, ser estudadas por microscopia de fluorescência e de patch-clamp electrofisiologia.

Reconstituição de uma proteína transmembrana, a voltagem-Ion Channel, KvAP, em Gigante Unilamelares Vesicles para microscopia e de Patch Estudos Grampo

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

reconstitution-transmembrane-protein-voltage-gated-ion-channel-kvap

Research

JoVE Journal

Biology

18.9K visualizações.  Université Pierre et Marie Curie.  A reconstituição da proteína transmembranar, KvAP, em vesículas unilamelares gigantes (GUVs) é demonstrada por dois métodos de desidratação-re-hidratação - eletroformação, e inchaço assistida-gel. Em ambos os métodos, vesículas pequenas unilamelares que contêm a proteína são fundidos em conjunto para formar GUVs que pode, em seguida, ser estudadas por microscopia de fluorescência e de patch-clamp electrofisiologia. 

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Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

Métodos para Recordings patch-clamp Capacitância da Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Biologia

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Gravação de patch-clamp de canais iônicos Expresso em Oócitos Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

Pressão polimento Pipetas para Gravação de patch-clamp melhorada

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagênese e Análise Funcional de canais iônicos Heterologously Expresso em células de mamíferos

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Estratégia de Transfection otimizado para gravação de Expressão e eletrofisiológicos de Recombinante dos canais de íon em HEK-293T Células

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1. Many of these are referred to as cell-penetrating peptides, which are frequently noted for their potential as drug delivery vectors1-3. Moreover, there is increasing interest in antimicrobial peptides that operate via non-membrane lytic mechanisms4,5, particularly those that cross bacterial membranes without causing cell lysis and kill cells by interfering with intracellular processes6,7. In fact, authors have increasingly pointed out the relationship between cell-penetrating and antimicrobial peptides1,8. A firm understanding of the process of membrane translocation and the relationship between peptide structure and its ability to translocate requires effective, reproducible assays for translocation. Several groups have proposed methods to measure translocation into large unilamellar lipid vesicles (LUVs)9-13. LUVs serve as useful models for bacterial and eukaryotic cell membranes and are frequently used in peptide fluorescent studies14,15. Here, we describe our application of the method first developed by Matsuzaki and co-workers to consider antimicrobial peptides, such as magainin and buforin II16,17. In addition to providing our protocol for this method, we also present a straightforward approach to data analysis that quantifies translocation ability using this assay. The advantages of this translocation assay compared to others are that it has the potential to provide information about the rate of membrane translocation and does not require the addition of a fluorescent label, which can alter peptide properties18, to tryptophan-containing peptides. Briefly, translocation ability into lipid vesicles is measured as a function of the Foster Resonance Energy Transfer (FRET) between native tryptophan residues and dansyl phosphatidylethanolamine when proteins are associated with the external LUV membrane (Figure 1). Cell-penetrating peptides are cleaved as they encounter uninhibited trypsin encapsulated with the LUVs, leading to disassociation from the LUV membrane and a drop in FRET signal. The drop in FRET signal observed for a translocating peptide is significantly greater than that observed for the same peptide when the LUVs contain both trypsin and trypsin inhibitor, or when a peptide that does not spontaneously cross lipid membranes is exposed to trypsin-containing LUVs. This change in fluorescence provides a direct quantification of peptide translocation over time.

This protocol details a method for the quantitative measure of peptide translocation into large unilamellar lipid vesicles. This method also provides information about the rate of membrane translocation and can be used to identify peptides that efficiently and spontaneously cross lipid bilayers.

Medição Translocação Peptide em grandes vesículas Unilamelares

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Explorando Arterial Músculo Liso KV7 função dos canais de potássio utilizando electrofisiologia patch clamp e Miografia Pressão

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify and explore the function of these important proteins. However, classical preparations, such as planar bilayers, limit the manipulations and experiments that can be performed on the reconstituted channel and its membrane environment. The more cell-like structure of giant liposomes permits traditional patch-clamp experiments without sacrificing control of the lipid environment.
Electroformation is an efficient mean to produce giant liposomes &gt;10 &mu;m in diameter which relies on the application of alternating voltage to a thin, ordered lipid film deposited on an electrode surface. However, since the classical protocol calls for the lipids to be deposited from organic solvents, it is not compatible with less robust membrane proteins like ion channels and must be modified. Recently, protocols have been developed to electroform giant liposomes from partially dehydrated small liposomes, which we have adapted to protein-containing liposomes in our laboratory.
We present here the background, equipment, techniques, and pitfalls of electroformation of giant liposomes from small liposome dispersions. We begin with the classic protocol, which should be mastered first before attempting the more challenging protocols that follow. We demonstrate the process of controlled partial dehydration of small liposomes using vapor equilibrium with saturated salt solutions. Finally, we demonstrate the process of electroformation itself. We will describe simple, inexpensive equipment that can be made in-house to produce high-quality liposomes, and describe visual inspection of the preparation at each stage to ensure the best results.

Reconstituting functional membrane proteins into giant liposomes of defined composition is a powerful approach when combined with patch-clamp electrophysiology. However, conventional giant liposome production may be incompatible with protein stability. We describe protocols for producing giant liposomes from pure lipids or small liposomes containing ion channels.

Preparação de lipossomas gigantes por Imagem e patch-clamp Eletrofisiologia

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

Reconstituição de um canal de Kv para membranas lipídicas de Estudos estruturais e funcionais

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...