Agradecemos a Anne-Marie Dion-Cote para discussões que levaram ao desenvolvimento do método. JK e RB são FQNRT estudiosos de doutorado, M.-MG é um estudioso Vanier CIHR e J.-YM é pesquisador sênior FRSQ. Este trabalho foi apoiado por fundos de Ciências Naturais e do Conselho de Pesquisa de Engenharia de JY. M.

1. Produção de recombinante de baculovírus Os baculovírus são gerados utilizando o Sistema de Expressão de Baculovirus Bac-to-Bac de Invitrogen, principalmente de acordo com o protocolo do fabricante, com apenas ligeiras modificações: <ol><li> Um vetor pFastBac1 modificado (Gibco, a vida) foi criado contendo o GST e Seus-tags (Figura 2). O local de clonagem múltipla (MCS) de pET-52b (+) vector (Novagen), que contém uma etiqueta 10xHis, foi inserido no mcs de um vector pFastBac1 para gerar pFastBac1-Strep-10xHis. A sequência de MCS pET-52b (+) foi amplificado por PCR entre os locais de restrição Xbal e BlpI, a adição de um local de restrição de BglII no terminal 5 &#39;da extremidade e um local de restrição Hind III na extremidade 3&#39;. O produto de PCR foi então clonado entre BamHI e HindIII sítio de restrição de pFastBac1, usando a compatibilidade de sequências de restrição de BamHI e BglII. Uma vez que o objetivo era gerar um pFastBac1 permitindo a expressão deproteína recombinante com estreptavidina-e 10xHis-tags, o sítio de restrição BamHI de pET-52b (+) sequência de MCS não foi utilizado. Além disso, o sítio de restrição XbaI não foi usado para evitar a redundância de sítios de restrição que ocorrem entre os sites que já estão no MCS de pFastBac1 e estes inserido com o MCS de pET-52b (+). A sequência de codificação de GST com o local de reconhecimento PreScission Protease (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) foi então inserido no pFastBac1-Strep-10xHis. A sequência de cDNA a partir de GST pGEX-6P-2 (GE Healthcare) foi amplificado por PCR com iniciadores que contêm sítios de restrição Ncol e Kpnl na extremidade 5 &#39;e 3&#39; das extremidades, respectivamente. O local Ncol permite a adição de um codão de iniciação, mas também uma alanina para o GST. O produto de PCR foi então clonado no pFastBac1-Strep-10xHis entre os sítios de restrição Ncol e Kpnl, resultando na deleção da etiqueta de estreptavidina. O novo vetor de fusão assim obtido foi denominado pFastBac1-GST-10xHis. </li><li> Clonar o cDNA codificante para a protein de interesse no vector pFastBac-GST-10xHis entre a GST (N-terminal) e a cauda de His (C-terminal). Ter cuidado para remover o codão de terminação para permitir que o cDNA de fusão com o His-tag no terminal C. </li><li> Transforme E. coli DH10Bac com o pFastBac recombinante (obtida no passo 1.2) para gerar o bacmid. Permitir que as colónias crescer durante a noite a 37 ° C e várias horas a 30 ° C em placas de selecção contendo Bluo-gal e IPTG (10 mg / ml de tetraciclina, 50 ug / ml de canamicina, 7 ug / ml de gentamicina, 100 ug / ml de Bluo- Gal, 40 ug / ml de IPTG). </li><li> Escolha e restreak duas colônias brancas (a partir do passo 1.3) em placas de seleção para confirmar o fenótipo branco. </li><li> Inocular 2 ml de LB contendo 10 ug / ml de tetraciclina, 50 ug / ml de canamicina, 10 mg / ml de gentamicina, com as duas colónias brancas a partir do passo 1.4 e deixá-los crescer durante a noite, sob agitação (250 rpm) a 37 ° C. </li><li> A fim de purificar o ADN de bacmid, sedimentar as bactérias do passo 1.5,ressuspender as células em 300 uL de solução I e adicionar 300 mL de solução II (kit Maxiprep da Qiagen). Incubar durante 5 min à temperatura ambiente, adicionar 300 mL de 3 M KOAc, pH 5,5 e incubação durante 10 min em gelo. Centrifugar as amostras a 4 ° C, a velocidade máxima durante 10 min. Adicionar 800 mL de isopropanol para os sobrenadantes e incubar por 10 min em gelo. Centrifugar as amostras durante 15 min a 4 ° C e lava-se o sedimento com 500 ul de etanol a 70%. Deixar o sedimento secar e ressuspender o sob condições estéreis, em 40 ul de Tris-EDTA a pH 8,0. O ADN de bacmid deve ser armazenada a 4 ° C. </li><li> Gerar baculovírus, conforme descrito no protocolo do fabricante. Os baculovírus pode ser armazenado a 4 ° C protegidos da luz. </li></ol> 2. Recombinant Protein Expression <ol><li> De modo a escolher o baculovírus mais eficiente para a purificação e para controlar o tempo do pico da expressão da proteína é alcançada, execute um mini-ensaio de uma infecçãos seguintes: Infect 2 x 10 7 de Sf9 infectadas células cultivadas a 27 ° C em meio de Grace (complementado com SBF a 10% e 1% P / S) com 133 ul (1/150) de baculovírus. Recolhe alíquotas de 1,5 ml a 0, 24, 48, e 72 horas pós-infecção. Sedimentar as células e analisar o nível da proteína de interesse por western blotting utilizando anticorpos anti-tag de expressão. </li><li> Use o baculovírus mais eficiente a partir do passo 2.1 para infectar um spinner contendo 1,0 x 10 6 células Sf9 por ml em 500 ml de mídia com uma proporção de 1/150 entre o vírus e meios de comunicação. Permitir que as células infectadas crescer em suspensão a 27 ° C e colheita das células, quando a expressão máxima de proteína (como determinado no passo 2.1 acima) é alcançado. As células sedimentadas podem ser armazenadas a -80 ° C até posterior utilização. </li></ol> 3. Preparação de Lisado celular solúvel Todos os seguintes passos de incubação são realizados a 4 ° C sob rotação suave. <ol><li> Lyse SAs células que expressam f9 sua proteína de interesse, em ~ 20 ml de tampão de ligação de GST (NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 0,05% de Triton-X-100, DTT 1 mM em PBS1X para uma concentração final de NaCl de 250 mM, e inibidores da protease cocktail (Roche). Num banho de água gelada, a solução 20x Dounce com um homogeneizador de Dounce, sonicado 3x 30 segundos cada (produção de 70%), e novamente Dounce 20x. </li><li> (Opcional). Incubar o ligado total de células com 1 mM de MgCl 2 e 7 nuclease Benzonase (2,5 U / ml) durante 30 min a 4 ° C para remover o ADN de contaminação ou de ARN. </li><li> Centrifugar a 18.000 rpm durante 30 min a 4 ° C. Manter o sobrenadante. </li><li> (Opcional). Centrífuga-se o sobrenadante de novo durante 30 min a 18.000 rpm a 4 ° C para obter um lisado solúvel claro. Passar o sobrenadante através de um filtro de 0,2 ou 0,45 mM para evitar o entupimento. </li></ol> 4. Ligação da proteína em GST Beads <ol><li> Incubar o ligado celular solúvel com 1 ml de pérolas de GST (pré-lavado duas vezes com10 ml de tampão GST) de ligação, durante 1 hora a 4 ° C, sob suave rotação. </li></ol> Comentário: O tempo de incubação deve ser optimizado de acordo com a estabilidade da proteína e eficiência de ligação. <ol start="2"><li> Rotação rápida a 700 rpm e remover o sobrenadante contendo as proteínas não ligadas (o que pode ser mantido para uma análise mais aprofundada). Lavar as proteínas ligadas a GST (Figura 3B, pista 1) com tampão de lavagem de GST (GST com tampão de ligação NaCl 350 mM final). </li><li> Repita o passo 4.2 2x. Na última lavagem, remover tanto sobrenadante quanto possível. </li><li> Incubar os grânulos com 5 mM de ATP e 15 mM de MgCl 2 (em 10 ml de tampão de ligação a GST) durante 1 hora a 4 ° C para evitar ligação não específica de proteínas de choque de calor 8. Lavar as pérolas três vezes com tampão de lavagem de GST. </li></ol> 5. PreScission clivagem do GST <ol><li> Centrifugar as esferas de GST, remover o sobrenadante e lavar as contas de GST com P5 buffer (50 NaHPO 4 mM pH 7,0, NaCl 500 mM, 10% de glicerol, 0,05% de Triton-X-100, 5 mM de imidazole). </li><li> Incubar as GST-esferas com enzimas PreScission, em tampão P5 a partir de 3 horas a durante a noite a 4 ° C. (Dividir as esferas de GST em fracções de 100 mL e adicionar 4-8 unidades (2-4 ul) de enzima diluído em 100 ul de tampão de P5). </li></ol> Comentário: O tempo de incubação do passo PreScission precisa ser optimizada de acordo com o peso molecular, assim como a estabilidade da proteína. Se se observar degradação, este tempo de incubação pode ser reduzido até um mínimo de 2 horas em vez de durante a noite. <ol start="3"><li> Rotação rápida e recolher o sobrenadante. Repita esta etapa duas vezes depois de adicionar 100 ml de P5 de tampão aos grânulos e reunir todas as fracções (Figura 3B, pista 2). </li></ol> Comentário: Os restantes grânulos pode ser usada para a análise de eficácia de clivagem (Figura 3B </strong&gt;, pista 3). Normalmente, 70-80% da proteína é clivada. 6. Para TALON metal Affinity Resin-A ligação às proteínas <ol><li> Divide-se a eluição a partir de cima em 3 fracções de 1 ml e incubar cada uma com 100 de resina de afinidade com metal Talon grânulos secos ul (pré-lavado duas vezes com tampão de P5) durante 1 hora sob rotação. </li></ol> Comentário: Dividindo a eluição em várias frações aumenta a eficiência de ligação / lavagens. <ol start="2"><li> Lava-se a resina 5 min com tampão de P30 (P5 tampão com uma concentração final de 30 mM de imidazol). </li><li> Repita o passo 6.2 2x e reunir as contas em um único tubo. Antes da última lavagem, remover tanto sobrenadante quanto possível. </li></ol> Comentário: Isto corresponde à amostra ligado GARRA (Figura 3B, pista 4). 7. A eluição da proteína purificada <ol><li> Incubar a resina TALON proteína ligada por 5 min sob rotação com P500 tampão (tampão P5 com uma concentração final de 500 mM de imidazol). Use uma proporção entre o buffer e gotas de 1:1 v / v (Por exemplo, se você tivesse tomado 200 mL de contas secas, você terá que adicionar 200 mL de P500). Repetir este passo duas vezes e manter cada fracção eluída separadamente (chamado de eluição 1 (E1), eluição 2 (E2) e eluição 3 (E3) e a figura 3B, pistas 5-7). </li></ol> Comentário: Os grânulos restantes podem ser utilizados para análise de eficiência de eluição (Figura 3B, pista 8). Tipicamente, 60-80% da proteína é eluída no total. <ol start="2"><li> Analisar a quantidade e qualidade da sua proteína purificada por carregar aproximadamente 20-40 ul de cada fracção com uma concentração padrão de BSA em SDS-PAGE e mancha com azul de Coomassie (Figura 3B) ou SYPRO mancha de proteína para visualização. </li></ol> Comentário: A proteína de interesse pode também ser detectado throughout o procedimento de purificação utilizando anticorpo anti-GST e anti-Seus anticorpos (figura 3C). 8. Armazenamento da Proteína Purificada <ol><li> Dializar a proteína purificada contra um tampão de armazenamento adequado (por exemplo, 20 mM de Tris-Acetato, pH 8,0, KAc 200 mM, Glicerol a 10%, EDTA 1 mM, DTT 0,5 mM) a 4 ° C. É importante verificar a precipitação de proteína purificada durante a diálise. Nós normalmente dialisar 2x durante 1 hora a 4 ° C, sob agitação de rotação. </li><li> Fazer pequenas aliquotas de proteína purificada (10-20 mL) e congelam-se em gelo seco durante 30 min. Armazenar as alíquotas a -80 ° C e evitar muitos ciclos de congelamento / descongelamento. </li></ol>

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	<li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification.">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li><li>Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+separation+of+GST+fusion+proteins+from+co-purifying+GroEL.">A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL.</a> Trends Genet. 12, 209-210 (1996).</li><li>Carr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+recombinant+form+of+the+V+antigen+of+Yersinia+pestis,+using+three+different+expression+systems.">Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems.</a> Vaccine. 18, 153-159 (1999).</li><li>Armisen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+adsorption+of+poly-His+tagged+glutaryl+acylase+on+tailor-made+metal+chelate+supports.">Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports.</a> J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).</li><li>Kuhn, S., Zipfel, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+baculovirus+expression+vector+pBSV-8His+directs+secretion+of+histidine-tagged+proteins.">The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins.</a> Gene. 162, 225-229 (1995).</li><li>Buisson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+breast+cancer+proteins+PALB2+and+piccolo+BRCA2+in+stimulating+homologous+recombination.">Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).</li><li>Filimonova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoforms+of+Serratia+marcescens+nuclease.+The+role+of+Mg2++in+the+hydrolysis+mechanism.">Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism.</a> Biochemistry. 62, 983-988 (1997).</li><li>Thorslund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+breast+cancer+tumor+suppressor+BRCA2+promotes+the+specific+targeting+of+RAD51+to+single-stranded+DNA.">The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).</li><li>Genois, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+BRCA2+and+RAD51+for+promoting+homologous+recombination+in+Leishmania+infantum.">Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).</li><li>Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+vector+system:+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression.">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).</li></ol>

A GST-His protocolo de purificação aqui apresentada é adequada para a purificação de uma ampla gama de tamanhos de proteínas recombinantes: Foram purificados com sucesso Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), e um alto teor de proteína de peso molecular de instável Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) 6,9. Além disso, as proteínas purificadas com este protocolo foram bioquimicamente ativo 6. O sucesso deste método depende unicamente da expressão, solubil...

A purificação de proteínas recombinantes é crucial para tratar de questões fundamentais em bioquímica. As formas convencionais de purificação de proteínas, como a cromatografia de permuta iónica e cromatografia de exclusão de tamanho dependem de propriedades físicas da proteína-alvo, tais como o seu ponto isoeléctrico e carga ou tamanho, respectivamente. As características da proteína últimos são partilhados por uma variedade de proteínas, o que aumenta consideravelmente a probabilidade de as proteínas contaminantes, em estratégias de purificação de proteínas convencionais. Este problema pode ser contornado com o uso de várias colunas de purificação, o que é demorado. Ao mesmo tempo, os últimos métodos de cromatografia de exigir configuração experimental caro. A purificação por afinidade-tag aumenta fortemente a especificidade do alvo, tal como na maioria dos casos, a marcação será único para a proteína de interesse. Em estudos recentes, com Flag ou HA-purificação de afinidade tem sido amplamente usado. Em contraste com rec existenteprotocolos de purificação de proteínas ombinant em que tags simples são utilizados, foi estabelecida a combinação única de duas tags. O nosso método envolve a fusão de uma etiqueta de GST na extremidade N-terminal e uma cauda de His no terminal C da proteína de interesse, para uma óptima relação entre a quantidade e pureza da proteína desejada. A GST é uma marca longa (29 kDa), que é altamente eficiente para a purificação sobre Sepharose de glutationa. Além disso, utilizando GST garante boa relação custo-eficácia de nosso método 1. A possibilidade de se clivar a GST com o enzima PreScission (com a sequência de reconhecimento LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, resultando na adição de apenas dois aminoácidos) tem muitas vantagens, por exemplo, esta estratégia evita a alteração das funções fisiológicas de proteínas devido a impedimento alostérico. O pequeno His-tag fundido com o outro extremo da proteína serve num segundo passo de purificação para aumentar a pureza da proteína por lavando a GST clivada, bem como proteínas degradadas e outros<html> contaminantes. Além disso, o protocolo não requer um passo de diálise quando se muda de GST para a coluna passo His-purificação (resina TALON). Contaminantes comuns em tais processos de purificação são proteínas de choque térmico (HSP). A adição de um passo de incubação com MgCl2 e ATP permite a remoção desses contaminantes (Figura 1). Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) e cromatografia líquida de alta performance (HPLC) são técnicas comuns que dependem instrumentação dispendiosa para gerar um rendimento elevado de proteína purificada de interesse. O protocolo de purificação de lote apresentamos aqui, em contraste, é manual e não necessita de uma instalação instrumental caro. Um rendimento elevado de proteína pode ser alcançado com a expansão do protocolo. Ao mesmo tempo, com o protocolo de purificação do lote, o volume de eluição pode ser ajustada, a fim de aumentar a concentração de proteína, o que não é dada com FPLC ou HPLC. ntent &quot;&gt; Além disso, com a GST-His protocolo de purificação do lote, proteínas com uma gama de dimensões de ~ 10-300 kDa pode ser purificada. Uma das maiores vantagens é dada pelo facto de que se pode purificar várias proteínas ao mesmo tempo , por exemplo, tanto um de tipo selvagem e a sua proteína mutante. O sucesso do protocolo apresentado apenas depende do nível de expressão e a solubilidade da proteína de interesse.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E.Coli &lt;/em&gt;DH10Bac (competent)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxi Prep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>Solution I and II</td></tr><tr><td>Ultra Pure Bluo-Gal</td><td>Gibco (Life)</td><td>15519028</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gibco (Life)</td><td>15529019</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 infected cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>PreScission enzyme</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>Grace&#039;s infected medium supplemented</td><td>Gibco (Life)</td><td>11605-094</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum characterized</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>P/S (Penicillin-Streptomycin)</td><td>Gibco (Life)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione Sepharose resin</td><td>GE bioscience</td><td>17075605</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Talon resin</td><td>Clontech</td><td>635504</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>BioShop</td><td>288324</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco (Life)</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal GST-antibody</td><td>Production in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal 6X-His-antibody</td><td>Clontech</td><td>631212</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dounce homogenizer (tight)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (Fisher dismembrator)</td><td>Fisher</td><td>Model 150</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis bag (50 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>2115217</td><td></td></tr></tbody></table>

gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins

Ensaios de chave em enzimologia para a caracterização bioquímica de proteínas in vitro, necessitam de elevadas concentrações de proteína purificada de interesse. Protocolos de purificação de proteína deve combinar eficiência, simplicidade e eficácia de custo 1. Aqui, nós descrevemos a GST-His método como um novo sistema de purificação por afinidade em pequena escala para as proteínas recombinantes, com base em um N-terminal de etiqueta de glutationa-Sepharose (GST) de 2,3 e uma marcação 10xHis C-terminal de 4, que são ambos fundida para a proteína de interesse. A última construção é usado para gerar baculovírus, para a infecção de células Sf9 infectadas para a expressão da proteína 5. GST é uma marca bastante longo (29 kDa), que serve para garantir a eficiência da purificação. No entanto, pode influenciar as propriedades fisiológicas da proteína. Por isso, é subsequentemente clivado da proteína usando a enzima PreScission 6. A fim de assegurar a máxima pureza e para remover a GST clivada, nósadicionou-se uma segunda etapa de purificação por afinidade com base na comparativamente pequena de His. Mais importante, a nossa técnica é baseada em duas etiquetas diferentes flanqueiam as duas extremidades da proteína, que é uma ferramenta eficaz para remover as proteínas degradadas e, portanto, enriquece proteínas de comprimento total. O método aqui apresentado não requer uma configuração instrumental caros, tais como FPLC. Além disso, incorporamos MgCl2 e lavagens de ATP para remover impurezas da proteína de choque térmico e tratamento nuclease abolir contaminando ácidos nucléicos. Em resumo, a combinação de duas marcas diferentes flanqueiam o N-e C-terminal e a capacidade para clivar um dos marcadores, garante a recuperação de uma proteína altamente purificada e de comprimento completo de interesse.

A fim de ilustrar a eficácia da GST-His protocolo de purificação, que purificado Rec14, um S. pombe proteína de 32,9 kDa. O Rec14 cDNA foi clonada no nosso vector pFastBac1 modificado permitindo a adição de GST-e Seus-tags no N-e C-terminais, respectivamente, (Figura 1A). Baculovírus recombinantes foram então preparados e utilizados para infectar células SF9 infectadas para a expressão da proteína. Os lisados ​​celulares solúveis foram incubados com contas de GST e proteínas li...

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GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

No presente protocolo, demonstramos um método altamente eficiente e de baixo custo purificação de proteínas em pequena escala, que permite a purificação de proteínas recombinantes, combinando de forma única um GST-tag quebrável e uma pequena His-tag.

GST-Sua purificação: A Two-step Affinity Purification Protocolo Cedendo Full-length proteínas purificadas

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

gst-his-purification-two-step-affinity-purification-protocol-yielding

Research

JoVE Journal

Biology

41.3K visualizações.  Hôtel-Dieu de Québec.  No presente protocolo, demonstramos um método altamente eficiente e de baixo custo purificação de proteínas em pequena escala, que permite a purificação de proteínas recombinantes, combinando de forma única um GST-tag quebrável e uma pequena His-tag. 

Vídeo: GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, particle size and shape, and surface-to-volume ratio of macromolecules. The technique is applicable to a very wide variety of solution conditions spanning a broad range of concentrations, pH values, ionic strengths, temperatures, additives, etc., but the sample is required to be monodisperse. This caveat led to the implementation of liquid chromatography systems on SAXS beamlines. Here, we describe the upstream integration of size-exclusion (SEC) and ion-exchange chromatography (IEC) on a beamline, different methods for optimal background subtraction, and data reduction. As an example, we describe how we use SEC- and IEC-SAXS on a fragment of the essential vaccinia virus protein D5, consisting of a D5N helicase domain. We determine its overall shape and molecular weight, showing the hexameric structure of the protein.

The determination of the solution structure of a protein by small angle X-ray scattering (SAXS) requires monodisperse samples. Here, we present two possibilities to ensure minimal delays between sample preparation and data acquisition: online size-exclusion chromatography (SEC) and online ion-exchange chromatography (IEC).

On-line Tamanho-exclusão e cromatografia de troca iônica em uma SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Bioquímica

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

Método para dobrar eficiente e purificação do Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

Expressão e purificação dos canais de íon Bestrophin mamíferos

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, the calcium (Ca2+)-permeable cation channel, transient receptor potential (TRP), binds tightly to the scaffold protein, inactivation-no-after-potential D (INAD), and forms a large signaling protein complex with eye-specific protein kinase C (ePKC) and phospholipase C&#946;/No receptor potential A (PLC&#946;/NORPA). However, the biochemical properties of the Drosophila TRP channel remain unclear. Based on the assembling mechanism of INAD protein complex, a modified affinity purification plus competition strategy was developed to purify the endogenous TRP channel. First, the purified histidine (His)-tagged NORPA 863-1095 fragment was bound to Ni-beads and used as bait to pull down the endogenous INAD protein complex from Drosophila head homogenates. Then, excessive purified glutathione S-transferase (GST)-tagged TRP 1261-1275 fragment was added to the Ni-beads to compete with the TRP channel. Finally, the TRP channel in the supernatant was separated from the excessive TRP 1261-1275 peptide by size-exclusion chromatography. This method makes it possible to study the gating mechanism of the Drosophila TRP channel from both biochemical and structural angles. The electrophysiology properties of purified Drosophila TRP channels can also be measured in the future.

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Based on the assembling mechanism of the INAD protein complex, in this protocol, a modified affinity purification plus competition strategy was developed to purify the endogenous Drosophila TRP channel.

Purificação dos canais potenciais do receptor transitório Endogenous Drosophila

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

Estratégias para expressar e purificar transportadores de soluto

High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, metabolites, neurotransmitters, and pharmaceuticals. Despite having emerged as attractive therapeutic targets and markers of disease, this group of proteins is still relatively underdrugged by current pharmaceuticals. Drug discovery projects for these transporters are impeded by limited structural, functional, and physiological knowledge, ultimately due to the difficulties in the expression and purification of this class of membrane-embedded proteins. Here, we demonstrate methods to obtain high-purity, milligram quantities of human SLC transporter proteins using&#160;codon-optimized gene sequences. In conjunction with a systematic exploration of construct design and high-throughput expression, these protocols ensure the preservation of the structural integrity and biochemical activity of the target proteins. We also highlight critical steps in the eukaryotic cell expression, affinity purification, and size-exclusion chromatography of these proteins. Ultimately, this workflow yields pure, functionally active, and stable protein preparations suitable for high-resolution structure determination, transport studies, small-molecule engagement assays, and high-throughput in vitro screening.

Autor em destaque: Expressão e purificação de transportadores de soluto humano usando genes otimizados para códons 

Structural and biochemical studies of human membrane transporters require milligram quantities of stable, intact, and homogeneous protein. Here we describe scalable methods to screen, express, and purify human solute carrier transporters using codon-optimized genes.

Expressão de alto rendimento e purificação de carreadores de solutos humanos para estudos estruturais e bioquímicos

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, ...

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident STIM1 regulates the activity of PM Orai1 channels in a process known as store operated calcium (Ca2+) entry which is the principal Ca2+ signaling process that drives the immune response. STIM1 undergoes post-translational N-glycosylation at two luminal Asn sites within the Ca2+ sensing domain of the molecule. However, the biochemical, biophysical, and structure biological effects of N-glycosylated STIM1 were poorly understood until recently due to an inability to readily obtain high levels of homogeneous N-glycosylated protein. Here, we describe the implementation of an in vitro chemical approach which attaches glucose moieties to specific protein sites applicable to understanding the underlying effects of N-glycosylation on protein structure and mechanism. Using solution nuclear magnetic resonance spectroscopy we assess both efficiency of the modification as well as the structural consequences of the glucose attachment with a single sample. This approach can readily be adapted to study the myriad glycosylated proteins found in nature.

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Biochemical and structural analyses of glycosylated proteins require relatively large amounts of homogeneous samples. Here, we present an efficient chemical method for site-specific glycosylation of recombinant proteins purified from bacteria by targeting reactive Cys thiols.

Direcionamento de tióis cisteína para in Vitro site-specific glicosilação de proteínas recombinantes

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

Imunologia e Infecção

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Purificação da Hsp104, um Disaggregase Protein

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Biologia

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Purificação de Proteínas ortogonais Facilitado por um Tag Affinity Pequenas Bispecific

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

GST-Sua purificação: A Two-step Affinity Purification Protocolo Cedendo Full-length proteínas purificadas

Resumo

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On-line Tamanho-exclusão e cromatografia de troca iônica em uma SAXS Beamline

Método para dobrar eficiente e purificação do Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Expressão e purificação dos canais de íon Bestrophin mamíferos

Purificação dos canais potenciais do receptor transitório Endogenous Drosophila

Expressão de alto rendimento e purificação de carreadores de solutos humanos para estudos estruturais e bioquímicos

Expressão de alto rendimento e purificação de carreadores de solutos humanos para estudos estruturais e bioquímicos

Expressão de alto rendimento e purificação de carreadores de solutos humanos para estudos estruturais e bioquímicos

Direcionamento de tióis cisteína para in Vitro site-specific glicosilação de proteínas recombinantes

Purificação da Hsp104, um Disaggregase Protein

Purificação de Proteínas ortogonais Facilitado por um Tag Affinity Pequenas Bispecific