Nosso método nos permite visualizar moléculas únicas com uma área de imagem 40 vezes maior do que os métodos convencionais, e tem um sinal de fundo muito reduzido. Ao contrário de outras técnicas, nossa abordagem usa uma única lente objetiva, não requer uma câmara de amostra especial, e é facilmente compatível com sistemas de microscópio comercial. Depois de reunir os componentes necessários, comece a construir o sistema.
Aqui, vários elementos já estão em posição no banco. Montado em um bloco de alumínio está um corpo de microscópio com um estágio Piezo e suporte de amostra. Também no banco estão três lasers e elementos ópticos para combinar os feixes.
Os feixes combinados são acoplados a uma fibra de modo único da forma mais eficiente possível. Como etapa preliminar final, monte uma fonte de luz colidida em um sistema de gaiola. Este tem uma fonte de luz coerente temporária conectada a uma única fibra de modo, um adaptador de fibra, lente acromática e íris.
Comece a trabalhar com o caminho de detecção. Primeiro, coloque a fonte de luz colidida na porta objetiva do corpo do microscópio. Ajuste o espelho sob os objetivos para que o feixe de saída esteja aproximadamente horizontal e alinhado com os orifícios do banco.
Insira um espelho dicroico no caminho do feixe e reflita o feixe em 90 graus. Adicione espelhos para permitir o ajuste do caminho do feixe transmitido para uma câmera sCMOS. Use os espelhos para garantir que o feixe atinja o centro do chip.
Em seguida, insira uma lente de tubo focal de 300 mililitros sobre uma distância focal da câmera. Remova a fonte de luz colidida do corpo do microscópio. Em seguida, ajuste a posição da lente do tubo para definir seu plano focal.
Pare os ajustes quando a câmera resolver claramente o padrão no teto. O caminho de detecção é retratado neste esquema. Observe a adição de um filtro de passe de várias bandas antes da lente do tubo para imagens de fluorescência multicolorida.
Volte ao corpo do microscópio. Lá, reinstale a fonte de luz colidida no suporte objetivo. Após o espelho dicroico, coloque um espelho dobrável no caminho do feixe refletido para redirecioná-lo em 90 graus.
Remova a fonte de luz colidida do corpo do microscópio e coloque-a nas proximidades. Em seguida, insira uma lente focal de 400 milímetros em cerca de uma distância focal do espelho. No corpo do microscópio instale a lente objetiva.
Em seguida, ajuste a posição do espelho ao longo do eixo óptico. Observe o teto acima do objetivo e pare quando um padrão de disco arejado perfeito for formado lá. Agora remova o objetivo e reinstale a fonte de luz colidida com uma íris aberta.
Determine onde ao longo do caminho do feixe o feixe é menor a cerca de 400 milímetros de distância do espelho. Uma vez identificado o ponto, monte um espelho lá, um plano de imagem conjugado. O estado da configuração neste momento aparece neste esquema.
O espelho apenas adicionado é rotulado M5. Insira outro espelho para refletir o feixe de 90 graus e monte uma lente de distância focal de 150 milímetros além dele. A lente deve estar a 150 milímetros do plano de imagem conjugado. Em seguida, tire temporariamente a primeira lente no caminho do feixe de excitação.
Com esta configuração encontre a posição focal da segunda lente. Coloque um espelho galvo de um único eixo neste ponto focal como um plano focal conjugado para trás. Forneça zero volts ao espelho galvo e gire seu suporte para que ele reflita o feixe de 90 graus.
Em seguida, ao longo do caminho do feixe, coloque um espelho dobrável que reflete o feixe a 90 graus. Coloque a lente 100 milímetros ao longo do caminho do feixe do plano focal conjugado. Mais uma vez, remova a fonte de luz colidida do suporte do microscópio.
Adicione outra lente de colisão de 100 milímetros com um adaptador de fibra e fibra de modo único, juntamente com uma íris. Em seguida, use a íris, fibra e lente para enviar um feixe colidido através do sistema de imagem. Em seguida, insira uma lente cilíndrica de distância focal 400 milímetros pouco antes da última lente de colisão no caminho do feixe.
Use-o para focar o feixe. Insira uma lente cilíndrica de 50 milímetros 450 milímetros na frente da primeira. Esta é uma representação esquemática da configuração final com os caminhos de detecção e excitação.
A saída dos três lasers é acoplada ao caminho pela fibra de modo único. Para testar, prepare uma amostra de hidrogel 3D. Este consiste em contas carmesim de 20 nanômetros misturadas com hidrogel.
Na configuração coloque a amostra de hidrogel no suporte da amostra. Para a excitação da amostra ligue o laser de 638 nanômetros e ajuste sua potência para menos de um miliwatt. Configure o software de controle da câmera no modo de gatilho interno e capture o vídeo.
Neste ponto o galvo motor tem zero volts aplicados. Posicione a câmera para que a imagem esteja no centro da lente. Em seguida, ajuste o espelho que é o plano de imagem conjugado.
Gire o botão horizontal no espelho para obter uma iluminação altamente inclinada. Registo a imagem do azulejo como na imagem de fluorescência amostral do hidrogel 3D com contas de 20 nanômetros. A barra de escala é de 20 micrômetros.
Prossiga depois de configurar hardware e software para varrer o espelho galvo. Este é o software de varredura galvo espelho para a configuração. Providencie uma imagem completa de campo de visão, configurando Vmin para menos 500 milvolts.
Em seguida, definir Vmax para 500 milvolts. Em seguida, mude para o software de aquisição da câmera. No modo de gatilho selecione Externo.
No menu suspenso LightScan PLUS selecione Down Next, clique em Controle de velocidade de varredura. Certos parâmetros de controle agora podem ser definidos. Sob a altura da janela entre 180 linhas.
Em Exposição insira 28 milissegundos. Quando feito, retorne ao software de controle de espelhos. No interruptor de software de controle de espelho em pilhas 3D ON. Especifique o número de pilhas e o tamanho da etapa.
Clique em tirar vídeo para começar a gravar imagens. Este é um exemplo de imagem Epi de DNA rotulado de um único fio. Em contraste, a técnica de ladrilho varrido altamente inclinado produziu esta imagem.
A imagem HIST mostra menos fundo em comparação com a imagem Epi. O DNA está em um hidrogel 3D, e o comprimento de onda de excitação é de 638 nanômetros. Aqui está uma imagem Epi do fator de alongamento de tradução eucariótica rotulado 2.
A imagem HIST melhorou a relação sinal-fundo. Também tem iluminação mais uniforme. Ambos têm o mesmo poder de iluminação de 7,5 miliwatts.
As velocidades de imagem foram de 2,5 quadros por segundo. É importante manter constantemente um ângulo de alta inclinação e sincronizar o espelho de varredura com a leitura da câmera. Isso garante uma alta relação sinal-fundo durante a aquisição de imagens.
Esperamos que a microscopia HIST beneficie várias aplicações, incluindo imagens de super resolução em profundidades de imagem mais profundas e perfil de expressão genética de alto rendimento em fatias de tecido grosso.
