Este trabalho é apoiado pelo Conselho de Pesquisa de Ciências Biológicas Biotecnologia e (BBSRC), a Royal Society e da Universidade de Nottingham.

1 Determinação da intensidade da mudança de fluorescência após ligação da Mant-marcado de nucleótidos. <ol><li> Adicionar 1 uM marcado com mant nucleótido a cinesina 1 uM (concentração final) em tampão de reacção adequado. Normalmente, um tampão que beneficia o crescimento ea estabilidade dos microtúbulos é usado (ver discussão). Um tampão utilizada contém 80 mM de piperazina bis-2-etanossulfónico (PIPES), pH6.9, 1 mM de MgCl2 e 1 mM de ácido etilenoglicol-bis-2-ácido aminoéter-tetracético (EGTA). Nota: A concentração de cinesina indicado em todos os protocolos, refere-se à concentração de sítios de ligação de nucleótidos (isto é, domínios de automóveis). Diferentes cinesinas existir como monómeros, dímeros ou tetrâmeros e assim pode conter mais do que um local de ligação de nucleótidos, por molécula. </li><li> Após um período de incubação (1-3 min) e utilizando um fluorímetro padrão, medir o espectro de emissão para o complexo-cinesina nucleótido marcado com mant. Use um comprimento de onda de excitação de 365 nm emedida a luz emitida 400-500 nm em incrementos de 1 nM. </li><li> Adicione uma solução de 1 mM de nucleótidos mant-rotulado no mesmo tampão de reacção usado no Passo 1.1. </li><li> Medir o espectro de emissão para o mant nucleotídica única amostra, como descrito anteriormente (ver Passo 1.2). </li><li> Normalizar o espectro com o sinal de comprimento de onda no pico de intensidade de fluorescência do espectro de nucleótido mant em solução (isto é, sem quinesina), dividindo esse valor por meio. </li><li> Traçar o espectro normalizado (por exemplo, a Figura 2B) para observar as diferenças de intensidade de fluorescência entre o mantATP-bound e / ou mantADP-bound kinesina e mant nucleotídeo em solução. </li></ol> 2 Medição das constantes de associação e dissociação da taxa para mantATP <ol><li> A uma solução de até 20 uM cinesina (ver discussão) em qualquer Mg 2 + tampão apropriado -free (por exemplo, 80mm pH6.9 PIPES, 1 mM de EGTA, 0,1% de Tween 20), adicionar 1mM de ácido etilenodiaminotetracético (concentração final) (EDTA) e 1 mM (concentração final), ditiotreitol (DTT). Nota: A adição de Tween 20 para o buffer é recomendado, pois reduz / impede a perda de proteína kinesina na coluna usado para troca de tampão (Passos 2.3 e 3.3) </li><li> Incubar a solução a 25 ° C durante 15 min. </li><li> Independente de nucleótidos e de EDTA livre da cinesina usando uma coluna de fluxo por gravidade de filtração de gel G-25 Sephadex de acordo com as instruções do fabricante (ver lista de materiais). <ol><li> Equilibrar a coluna com pelo menos 3 volumes de um tampão apropriado -free Mg 2 + de coluna (ver Passo 2.1). Carregar a solução contendo a cinesina na coluna. Preparar um tubo de recolha por adição de um volume adequado de solução de cloreto de magnésio 100 mM para o tubo vazio, de tal forma que a concentração final de cloreto de magnésio é 1 mM após a recolha da solução de cinesina. Além imediata de cloreto de magnésio ajuda estabilizaSE, o kinesin sem ação. </li><li> Eluir a kinesina usando um tampão -free apropriado Mg 2 +. Kinesins são instáveis ​​quando livre de nucleotídeo por isso é importante trabalhar rapidamente. Guarde o kinesina sem ação no gelo e usar dentro de 1-2 horas. </li></ol></li><li> Durante ou antes da preparação de cinesina livre de nucleótido, preparar uma série de concentração mantATP no mesmo tampão da reacção como a solução final de cinesina livre de nucleótido. Determinar a gama de concentrações de mantATP necessárias de acordo com a concentração de cinesina disponíveis com uma série típico que varia de 0,1 a 50 um (ver passo 2.5 e discussão). </li><li> Prepara-se uma série de concentrações de cinesina livre de nucleótido. Para cada concentração de mantATP (Passo 2.4), uma concentração de cinesina livre-de nucleótidos devem ser preparadas de modo a que o nucleótido marcado mant-se em 5 a 10 vezes de excesso molar, mais locais de ligação de nucleótidos de cinesina. </li><li> Defina o comprimento de onda de excitação no-flo paradow fluorímetro a 365 nm e recolhem a luz emitida a&gt; 400 nm usando um filtro de passagem longa. </li><li> Começando com a concentração mais baixa de mantATP, misturar o mantATP com uma concentração adequada de cinesina livre de nucleótido em uma proporção de 1: 1 v / v utilizando um fluorímetro de fluxo interrompido (Figura 3A e 3B Inserção). Nota: Os reagentes são diluídos em 50% durante a mistura. Manter uma nota da concentração de nucleotídeos no pré e pós de mistura (ou seja, 3,0 / 1,5 M) para evitar confusão. </li><li> Montar a alteração na intensidade da fluorescência medida para cada concentração de mantATP a uma função exponencial, mais uma linha de declive negativo constante para explicar a fotodegradação do grupo mant (isto é, 0 = A fluorescência .exp (k .t obs) + (m. t + c), em que A é a amplitude de 0, kobs é a constante de velocidade e t é o tempo, ver Figura 3B e discussão). A partir destes ajustes determinar umtaxa constante (k obs) para cada concentração de mantATP. Cada obs k é uma convolução de uma constante de associação e de dissociação taxa (Figura 1, k 1 e k-1). </li><li> Deconvoluir da associação e da taxa de dissociação constantes traçando k obs contra concentração mantATP (por exemplo, a Figura 3C). Monte estes dados a uma função linear (isto é, k obs = k 1 [mantATP] + k-1) para obter o gradiente e do eixo y intercepção. O gradiente representa a constante de velocidade para a associação mantATP (Figura 1, k 1), com M -1 s unidades -1. A intersecção representa a constante de velocidade de dissociação (Figura 1, k-1), com unidades de s-1 (ver discussão). Nota: Esta abordagem também pode ser aplicado para determinar a associação e dissociação do ADPAs constantes de velocidade (figura 1, k e k -4 4) usando mantADP como as sequências de nucleótidos. </li></ol> 3 Medição da dissociação Constante para mantADP <ol><li> A uma solução de 2 uM cinesina num tampão de reacção adequado (por exemplo, 80 mM PIPES pH6.9, 1 mM de MgCl 2, 1 mM de EGTA, 0,1% de Tween 20), adicionar 50 uM mantADP (concentração final). </li><li> Incubar a 25 ° C por 30 min. </li><li> Remover o excesso de mantADP e outro nucleótido livre por troca de tampão a cinesina no tampão de reacção escolhido usando uma coluna de Sephadex G-25 (ver a lista de materiais) de acordo com as instruções do fabricante. O domínio motor kinesin agora deve ser carregado com mantADP. </li><li> Definir o comprimento de onda de excitação no fluorímetro de fluxo parado para 365 nm e recolhem a luz emitida a&gt; 400 nm usando um filtro de passagem longa. </li><li> Misture o complexo mantADP.kinesin (~ 1 | iM) com uma dobra em 50 ou maior do molar excesso não marcado de ATP em uma relação de 1: 1 v / v utilizando um fluorímetro de fluxo interrompido (Figura 4A e 4B Inserção). </li><li> Coloque a diminuição da intensidade de fluorescência observado ao longo do tempo a uma única função exponencial além de uma linha de constante inclinação negativa para explicar fotodegradação do grupo mant (ie, Fluorescência = A 0 .exp (k .t obs) + (+ m.t c), em que A é a amplitude de 0, kobs é a constante de velocidade e t é o tempo, ver Figura 4B e discussão). O k obs determinada a partir desta forma é a constante de velocidade para a dissociação de ADP (Figura 1, k 4) com as unidades de s-1 (ver discussão). </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Aqui, apresentamos os protocolos de observação e análise da cinética de transições entre os estados de nucleotídeos para um kinesin. Estes protocolos utilizam o método de mistura stopped-flow rápido em conjunto com nucleótidos marcados com fluorescência. Métodos deste tipo têm sido amplamente utilizados para o estudo de ligação de nucleótidos e de dissociação para uma variedade de cinesinas 9-11,13-16. Os métodos descritos não permitem a observação de libertação de fosfato (Figura 1, Passo 3). No entanto, a fluorescência de fluxo interrompido pode ser usada para observar a esta transição, utilizando uma proteína de detecção de fosfato para a produção de pares de fosfato para uma mudança de intensidade de fluorescência 17. Os métodos apresentados uso nucleótidos marcados com o pequeno methylanthraniloyl fluoróforo (mant), que geralmente apresentam um aumento na intensidade de fluorescência quando ligados à proteína. Além disso, o fluoróforo mant, quando conjugado com ou em 2 &#39;ou 3&#39; em posição o ribose, muitas vezes, tem pouco ou nenhum efeito sobre a ligação, a dissociação ou a hidrólise do nucleótido 9-12. Mant-nucleótidos marcados estão prontamente disponíveis a partir de fontes comerciais (ver lista de materiais) e são fornecidos como uma mistura dos 2 &#39;e 3&#39; do conjugado uma vez que rapidamente se equilibram novamente, quando purificado com um único isómero 8. Nucleótidos marcados com Mant fazer moléculas repórter excelentes pelo que a cinética de ligação e de dissociação de nucleótidos podem ser observadas. A utilização de nucleótidos marcados com fluorescência significa que a leitura dos ensaios descritos é uma mudança no tempo real da intensidade de fluorescência. Isto faz com que estes ensaios ideal para a fluorescência de fluxo parado, o que permite uma mistura rápida dos reagentes e da observação de alterações de fluorescência associada com a reacção subsequente em tempo real. A combinação de de fluxo parado como a técnica de mistura e de fluorescência como o método de detecção produz um sistema que é relativamente amostra efficiente. Por exemplo, para adquirir os dados apresentados na Figura 3C requer 0,8-1,0 mg de cinesina-13 purificada, MCAK, e para adquirir os dados apresentados na Figura 4B requer ~ 0,3 mg de cinesina-13 purificada, MCAK. Uma desvantagem do uso de mant como um fluoróforo é que é propenso a fotobranqueamento. Isto pode ser observado no isolamento de cinesina cinética de reacção por mistura de uma solução de nucleótido marcado com mant com tampão de reacção, na ausência de cinesina, no de fluxo parado. A lenta redução na intensidade de fluorescência é observado como o grupo mant torna branqueada. Ao longo da gama de escalas de tempo utilizados nos protocolos descritos fotobranqueamento do grupo mant está bem descrita por uma função linear. Portanto, uma forma simples de corrigir os dados de fotobranqueamento é para se ajustar a uma função exponencial com uma linha de base descrita por uma função linear (isto é, mt + c), em vez da linha de base plana mais comum, descrito por um único parâmetro. ligação mantATP Ao medir as constantes de velocidade de associação e de dissociação da mantATP (Secção 2) o ADP, o qual permanece associado com o sítio de ligação de nucleotídeo cinesina na ausência de microtúbulos, devem ser removidos. Esta associação permite mantATP e de dissociação (figura 1, passo 1) para ser observado no isolamento a partir de dissociação ADP. Para conseguir isto, a cinesina é incubado com pelo menos um excesso de 50 vezes de EDTA sobre os locais de ligação de nucleótidos (Passo 2.1). O EDTA sequestra iões Mg 2 + Mg 2 + causando a dissociar-se do bolso de ligação ao nucleótido, o que resulta na libertação do nucleótido 11. Portanto, ao realizar as etapas de 2,1-2,3, é fundamental a utilização de um tampão livre de Mg 2 +. A proteína isenta de cinesina nucleótido é trocada de tampão para separá-lo tanto do nucleótido livre e de EDTA. Para realizar essa separação, uma descartável ge de fluxo por gravidadecoluna l filtração é suficiente e é simples e rápido de usar (ver lista de materiais). A interacção de mantATP com quinesina de nucleótidos livres é realizada a uma gama de concentrações mantATP (Passo 2.4) para permitir desconvolução das constantes de associação e de dissociação da taxa (Passo 2.8). A teoria por detrás experiências deste tipo é bem descrito na referência 18 Na realização destas experiências uma começa com a concentração mais baixa de mantATP. Isso elimina a necessidade de etapas de lavagem entre diferentes concentrações. Provavelmente será necessário para ajustar a sensibilidade do fluorímetro de fluxo parado como a concentração mantATP é aumentada. A concentração mantATP devem estar sempre em excesso pelo menos de 5 vezes em relação à concentração de sítios de ligação de nucleótidos de cinesina para manter as condições de pseudo-primeira ordem. No entanto, como a concentração de mantATP é aumentada, a alteração de sinal pode tornar-se inundado como a fracção de nucleótidos que se liga a cinesina diminui. Therefore, a concentração da cinesina também é aumentado para cada nova concentração de mantATP de tal modo que a concentração de mantATP nunca é maior do que um excesso molar de 10 vezes em relação a locais de ligação de nucleótidos (Passo 2.6). mantADP dissociação Apesar da taxa de associação e dissociação para as constantes mantADP pode ser determinada pelo mesmo método descrito para mantATP (Secção 2). A dissociação de ADP a partir de uma quinesina pode ser directamente observada por pré-carregar o local de ligação do nucleótido com mantADP (Passos 3,1-3,3) O complexo mantADP.kinesin é então misturado com um excesso de ATP não marcado (passo 3.5). O excesso não marcado ATP impede a religação da mantADP a cinesina e assim permite que a reacção de dissociação (Figura 1, k 4) para ser observado no isolamento da associação de mantADP. Neste ensaio, a concentração de ATP não marcado deve ser, pelo menos, um excesso molar de 50 vezes de nucleotide sítios de ligação. A teoria por detrás deste ensaio é também descrito na referência 18 Este método directa dá um valor mais preciso para a taxa constante de dissociação do que a extrapolação para o eixo y descrito no Passo 2.8. Inclusão de microtúbulos Os métodos descritos podem também ser utilizados para determinar a cinética de ligação e de dissociação de nucleótidos na presença de microtúbulos. Os microtúbulos são introduzidos para as sequências de nucleótidos contendo uma seringa antes da mistura no fluxo parou: a seringa inferior na Figura 3B e 4B (Inserções). Nesta configuração, a cinesina irá satisfazer o nucleótido ao mesmo tempo que satisfaz os microtúbulos. Microtúbulos estabilizados são utilizados, em que o período de vida do polímero tubulina é alargado através da utilização de uma substância química ou de estabilização, tal como o taxol ou um análogo de GTP nonhydrolysable, tais como a guanosina-5 &#39;- [(α, β) -methyleno] trifosfato (GMPCPP, veja a lista de materiais). É possível utilizar dois ciclos de polimerização da tubulina com GMPCPP fazer microtúbulos que podem ser armazenados durante vários meses em 9,19 de azoto líquido. O uso de microtúbulos pré-preparados reduz significativamente as dificuldades práticas para a realização do ensaio. Para incluir microtúbulos nos ensaios, é importante o uso de um tampão de reacção adequado para a estabilidade dos microtúbulos. O tampão de escolha é baseado TUBOS, com o tampão mais comumente usado contendo 80 mM de PIPES pH 6,9, 1 mM de MgCl2 e 1 mM de EGTA (conhecido como BRB80) 20,21. Os métodos descritos não se restringem a utilização com cinesinas, mas pode ser adaptada e aplicada a qualquer proteína de ligação de nucleótido. Por exemplo, métodos semelhantes têm sido aplicadas para o ciclo de facturação ATP de membros da família de miosina de motores moleculares 12,22 e a utilização de nucleótidos marcados mant guanosina estende-se aindamétodos deste tipo a GTP hidrolisar proteínas 23,24.

As cinesinas são uma superfamília de proteínas caracterizada por um domínio altamente conservado do motor 1. O domínio motora cinesina interage com microtúbulos de um modo dependente-nucleótido. Os membros da família kinesin exibir uma gama de funções de kinesins translocação, que transportam cargas de uma forma direcionada ao longo dos microtúbulos, a kinesins de ligação finais não translocação de microtúbulos, que regulam a dinâmica dos microtúbulos 2,3. Kinesins utilizar o volume de negócios de adensosine-5&#39;-trifosfato (ATP) para regular a sua interação com o citoesqueleto de microtúbulos 4-6. A conformação do domínio motora cinesina e, por conseguinte, a sua afinidade para a microtúbulos depende do seu estado de nucleótidos: de ATP, ADP, ADP.Pi ou não de nucleótidos podem ser ligados (Figura 1). Para compreender o mecanismo molecular de uma quinesina, é necessária uma compreensão da relação entre o volume de ATP e interacção dos microtúbulos. Aguinte, um importante objectivo no campo da cinesina é para caracterizar as propriedades funcionais de diferentes estados de nucleótidos e a cinética das transições entre ambos na presença e na ausência de microtúbulos. <img alt="Figura 1" fo:content-width="2in" width="200" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig1highres.jpg" /> Figura 1 O ciclo de facturação mais simples do ATP para uma cinesina consiste em quatro estados possíveis: (Φ) livre de nucleótido, o ATP-ligado, ADP.P i -bound e ADP-bound Cada um dos quatro transições é caracterizada por um para a frente e. taxa constante para trás (k x k-x e, respectivamente). Para compreender como a química do ciclo de facturação ATP está acoplado ao ciclo de interacção mecânica microtúbulos, deve-se determinar qual o passo do ciclo de facturação ATP é limitante da taxa na ausência de microtubules e, em seguida, determinar a forma como o ciclo é alterado pela presença de microtúbulos. O ciclo de facturação simples ATP consiste em quatro passos químicos individuais: (1) ligação de ATP para o local vazio (Φ indica o local vazio, ou seja, livre de cinesina-nucleótido); (2) clivagem do ATP; (3) fosfato de dissociação e (4) dissociação ADP (Figura 1). O passo limitante de velocidade define a constante de velocidade para o ciclo completo volume de ATP. Portanto, para determinar qual é o passo limitante da velocidade de cada uma das transições individuais deve ser medido e comparado com a constante de velocidade para o ciclo completo. Os métodos para medir a constante de taxa de ciclo global rotatividade ATP não são descritos aqui, mas pode ser encontrado na referência 7 Descrevem-se métodos em que as constantes de velocidade para os passos químicos individuais podem ser determinados. Há um número de métodos disponíveis para estudar transições individuais do ciclo de facturação de uma proteína de nucleótidos de hidrólise. Os métodos aqui apresentados têm advantage das propriedades dos nucleótidos marcados com fluoróforo do methylanthraniloyl, geralmente referido como mant, que exibem uma alteração na intensidade de fluorescência após a ligação à proteína 8. O grupo mant é usado porque o seu pequeno tamanho significa que, quando acoplado à ribose (figura 2A), que, geralmente, tem pouco ou nenhum efeito sobre a cinética de ligação de nucleótidos ou hidrólise 9-12. Aqui, nós apresentamos os protocolos que descrevem a utilização de nucleótidos marcados com mant, em conjunto com a fluorescência de fluxo parado, para permitir a observação da ligação e dissociação de nucleótidos no ciclo de facturação de um ATP cinesina.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="781">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:279px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">2&#8217;/3&#8217;-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5&#8217;triphosphate&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"># NU-202</td>
			<td style="width:279px;">mantATP</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">2&#8217;/3&#8217;-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5&#8217;-diphosphate&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"># NU-201</td>
			<td style="width:279px;">mantADP</td>
		</tr>
		<tr height="134">
			<td height="134" style="height:134px;width:220px;">Mg-ATP</td>
			<td style="width:147px;">Roche</td>
			<td style="width:136px;"># 10519979001</td>
			<td style="width:279px;">The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100&#160;mM in 100&#160;mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260&#160;nm (e = 15400&#160;M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20&#160;oC.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">BP120-500</td>
			<td style="width:279px;">0.5&#160;M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled.</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:220px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:147px;">Melford</td>
			<td style="width:136px;">MB1015</td>
			<td style="width:279px;">1&#160;M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">NAP-5 column</td>
			<td style="width:147px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;"># 17-0853</td>
			<td style="width:279px;">G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:220px;">GMPCPP</td>
			<td style="width:147px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"># NU-405</td>
			<td style="width:279px;">nonhydrolysable analogue of GTP</td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:220px;">Stopped-flow fluorimeter&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Applied Photophysics</td>
			<td style="width:136px;">SX20</td>
			<td style="width:279px;">A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1&#160;-&#160;100&#160;s to be monitored.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of stopped-flow fluorescence and labeled nucleotides to analyze the atp turnover cycle of kinesins

A superfamília de cinesina das proteínas de motor de microtúbulos associados compartilhar um domínio motor característica que ambas hidrolisa ATP e liga-se os microtúbulos. Kinesins mostrar as diferenças entre a superfamília, tanto em volume de negócios ATP e na interação dos microtúbulos. Estas diferenças adaptar kinesins específicos para diversas funções, tais como transporte de carga, microtúbulos deslizante, microtúbulos despolimerização e estabilização dos microtúbulos. Para compreender o mecanismo de acção de uma quinesina é importante para compreender a forma como o volume de ciclo de química ATP está acoplado ao ciclo de interacção mecânica microtúbulos. Para dissecar o ciclo de facturação de ATP, uma abordagem consiste em utilizar os nucleótidos marcados com fluorescência para visualizar os passos individuais do ciclo. A determinação da cinética da transição de cada nucleótido no ciclo de facturação ATP permite que o passo limitante da velocidade ou passos para o ciclo completo para ser identificado. Para uma cinesina, é importante conhecer o passo limitante da taxa, ema ausência de microtúbulos, como este passo é geralmente acelerada vários milhares de vezes quando a cinesina interage com microtúbulos. O ciclo na ausência de microtúbulos é então comparado com o na presença de microtúbulos de compreender completamente ATP ciclo de facturação de uma cinesina. A cinética da transição de nucleótidos individuais são geralmente demasiado rápida para observar misturando manualmente os reagentes, particularmente na presença de microtúbulos. Um dispositivo de mistura rápida, tal como um fluorímetro de fluxo parado, o que permite que a cinética de ser observada em escalas de tempo de tão pouco como alguns milésimos de segundo, pode ser utilizado para monitorar tais transições. Aqui, nós descrevemos os protocolos em que a mistura rápida dos reagentes de stopped-flow é utilizado em conjunção com nucleótidos marcados com fluorescência para dissecar o ciclo de facturação de um ATP cinesina.

Um aumento na intensidade de fluorescência do grupo mant é tipicamente observado após a ligação de nucleótido marcado, mant a uma cinesina. No entanto, a magnitude de uma tal mudança de sinal é dependente da cinesina particular em questão. Por isso, é útil para realizar medições de equilíbrio para confirmar a presença e grandeza de uma alteração da intensidade de fluorescência antes de progredir para ensaios cinéticos. Os espectros de fluorescência e representativas para mantATP mantADP, tanto em solução como no complexo com a cinesina-13, MCAK, são apresentados na Figura 2B. Estes dados ilustram o aumento de intensidade da fluorescência exibida por ambos mantATP mantADP e após ligação a MCAK. A mudança na intensidade de fluorescência após a ligação de mant nucleotídeo para um kinesin é usado para informar sobre a associação e dissociação de ambos ATP e ADP (pontos 2 e 3). No caso de MCAK, uma diferença de intensidade de fluorescência é observado entre mantATP.kinesin e mantADP.kinesin <sup&gt; 9. A Figura 3A descreve a reacção que ocorre durante a mistura com a cinesina mantATP livre de nucleótido. Os dados representativos que ilustram o aumento da intensidade de fluorescência que ocorre após ligação de mantATP a cinesina-13, MCAK é mostrado na Figura 3B. Dados do tipo mostrado na Figura 3B é recolhido a uma gama de concentrações mantATP. Um gráfico das constantes de velocidade (k) obs determinadas em função da concentração mantATP é mostrado na Figura 3C. Ajustando estes dados a uma função linear (isto é, k obs = k 1 [mantATP] + k-1) permite desconvolução das constantes de velocidade, que contribuem para k obs (Passo 2.8). Assim, permitindo a determinação de ambos a associação e a constante de velocidade de dissociação para mantATP (Figura 1, k 1 e k <em&gt; 1, respectivamente). A Figura 4A representa a reacção que ocorre durante a mistura mantADP.kinesin com um excesso de ATP não marcado. Os dados na Figura 4B mostra a diminuição da intensidade de fluorescência observada para mantADP mediante dissociação da cinesina-13, MCAK. Ao ajustar os dados para uma função exponencial (Passo 3.6) a constante de velocidade para a dissociação de mantADP é determinada directamente. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig2highres.jpg" /> Figura 2. nucleótidos etiquetados com o methylanthraniloyl fluoróforo (mant) são usadas para isolar diferentes etapas do ciclo de volume de ATP. (A) Estrutura do mantATP mostrando a posição do fluoróforo mant conjugado a qualquer um dos 2 &#39;ou 3&#39; da ribose em posição. (B) os espectros de fluorescência e normalizado para mantATP mantADP em solução (PMAX) e uma mantATPd mantADP em complexo com o kinesina MCAK (MATP + MCAK e MADP + MCAK). Os espectros mantATP são normalizados para a fluorescência no máximo de mantATP em solução e os espectros mantADP são normalizados para a fluorescência máxima para mantADP em solução. Os espectros dos nucleotídeos mant misturados com MCAK são coletados em 1 min pós mistura. A concentração dos reagentes e as configurações fluorímetro são como descrito no protocolo de passos 1.1 e 1.2. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig3highres.jpg" /> Figura 3 Medição da constante de velocidade de associação de mantATP. (A) Diagrama esquemático que descreve a reacção que tem lugar pela mistura de pós de fluxo parado: mantATP (MATP) se liga ao nucleótido-livre cinesina. A intensidade de fluorescência do grupo mant aumenta aquando da ligação à proteína. (B) mudança do sinal de fluorescência (preto) observada após a mistura mantATP (25 M) com MCAK (5 M nulivre-cleotide,). Este é o ajuste dos dados (tracejado vermelho) para uma função exponencial, mais uma linha de inclinação negativa constante, o qual representa a fotodegradação do fluoróforo mant (ver discussão) Inserção:. Sumário das seringas antes da mistura no fluorímetro de fluxo parado. (C) constantes de velocidade (k obs) determinados para a reação de mantATP com MCAK sem ação conspiraram contra concentração de mantATP. Este terreno terá uma região linear com o gradiente sendo a constante de velocidade de associação (Figura 1, k 1) com unidades de M -1 s -1 e a intercepção y ser a constante de velocidade de dissociação (Figura 1, k-1) com unidades de s -1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> . Figura 4 Medição da constante de velocidade de dissociação para mantADP (A) esquemática que descreve a reacção que tem lugar pela mistura de pós de fluxo parado: cinesina pré-carregado com mantADP é diluída em um excesso de ATP não marcado. Dissociando mantADP passa a ATP não marcado, impedindo desse modo a reacção de associação para trás mantADP (ver discussão). A intensidade de fluorescência do grupo mant diminui mediante a dissociação da proteína. Redução (B) A fluorescência observada mediante a dissociação de mantADP da cinesina MCAK. O sinal de fluorescência (preto) é a conta para a fotodegradação do grupo mant (ver discussão) apto (tracejado vermelho) a uma única exponencial além de uma linha de inclinação negativa constante. A constante de velocidade determinada é a constante de velocidade para a dissociação de mantADP (Figura 1, k4) Inset.:. Índice das seringas antes da mistura em um fluorímetro de fluxo interrompido <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig4highres.jpg" target="_blank">por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

As cinesinas são caracterizados pela interacção dependente de nucleótido com microtúbulos: um ciclo de facturação ATP acoplado a um ciclo de interacção dos microtúbulos. Aqui, nós descrevemos protocolos para analisar a cinética da transição de nucleótidos individuais do ciclo de facturação de uma quinesina ATP utilizando nucleótidos marcados com fluorescência e fluorescência de fluxo parado.

Uso de Nucleotídeos stopped-flow de fluorescência e rotulados para analisar o ciclo de rotatividade ATP de cinesinas

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

15.4K visualizações.  University of Nottingham.  As cinesinas são caracterizados pela interacção dependente de nucleótido com microtúbulos: um ciclo de facturação ATP acoplado a um ciclo de interacção dos microtúbulos. Aqui, nós descrevemos protocolos para analisar a cinética da transição de nucleótidos individuais do ciclo de facturação de uma quinesina ATP utilizando nucleótidos marcados com fluorescência e fluorescência de fluxo parado. 

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Preparation and Use of Samarium Diiodide (SmI2) in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and Ni(II) Salts in the Samarium Barbier Reaction

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of molecular iodine to samarium metal in THF.1,2-3 It is a mild and selective single electron reductant and its versatility is a result of its ability to initiate a wide range of reductions including C-C bond-forming and cascade or sequential reactions. SmI2 can reduce a variety of functional groups including sulfoxides and sulfones, phosphine oxides, epoxides, alkyl and aryl halides, carbonyls, and conjugated double bonds.2-12 One of the fascinating features of SmI-2-mediated reactions is the ability to manipulate the outcome of reactions through the selective use of cosolvents or additives. In most instances, additives are essential in controlling the rate of reduction and the chemo- or stereoselectivity of reactions.13-14 Additives commonly utilized to fine tune the reactivity of SmI2 can be classified into three major groups: (1) Lewis bases (HMPA, other electron-donor ligands, chelating ethers, etc.), (2) proton sources (alcohols, water etc.), and (3) inorganic additives (Ni(acac)2, FeCl3, etc).3
Understanding the mechanism of SmI2 reactions and the role of the additives enables utilization of the full potential of the reagent in organic synthesis. The Sm-Barbier reaction is chosen to illustrate the synthetic importance and mechanistic role of two common additives: HMPA and Ni(II) in this reaction. The Sm-Barbier reaction is similar to the traditional Grignard reaction with the only difference being that the alkyl halide, carbonyl, and Sm reductant are mixed simultaneously in one pot.1,15 Examples of Sm-mediated Barbier reactions with a range of coupling partners have been reported,1,3,7,10,12 and have been utilized in key steps of the synthesis of large natural products.16,17 Previous studies on the effect of additives on SmI2 reactions have shown that HMPA enhances the reduction potential of SmI2 by coordinating to the samarium metal center, producing a more powerful,13-14,18 sterically encumbered reductant19-21 and in some cases playing an integral role in post electron-transfer steps facilitating subsequent bond-forming events.22 In the Sm-Barbier reaction, HMPA has been shown to additionally activate the alkyl halide by forming a complex in a pre-equilibrium step.23
Ni(II) salts are a catalytic additive used frequently in Sm-mediated transformations.24-27 Though critical for success, the mechanistic role of Ni(II) was not known in these reactions. Recently it has been shown that SmI2 reduces Ni(II) to Ni(0), and the reaction is then carried out through organometallic Ni(0) chemistry.28
These mechanistic studies highlight that although the same Barbier product is obtained, the use of different additives in the SmI2 reaction drastically alters the mechanistic pathway of the reaction. The protocol for running these SmI2-initiated reactions is described.

Preparation and Use of Samarium Diiodide SmI2 in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and NiII Salts in the Samarium Barbier Reaction

A straightforward procedure for the preparation of samarium diiodide (SmI2) in THF is described. The role of two main additives namely hexamethylphosphoramide (HMPA) and Ni(acac)2 in Sm mediated reactions is demonstrated in the Sm-Barbier reaction.

Preparação e Uso de Samário diiodeto (SMI<sub&gt; 2</sub&gt;) Em Organic Synthesis: The Role mecanístico de HMPA e (II) de Ni Sais na Reacção Barbier Samário

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of ...

Química

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization of OGG1 is undertaken to measure the rates of 8-oxoG excision and product release. When the OGG1 concentration is lower than substrate DNA, time courses of product formation are biphasic; a rapid exponential phase (i.e. burst) of product formation is followed by a linear steady-state phase. The initial burst of product formation corresponds to the concentration of enzyme properly engaged on the substrate, and the burst amplitude depends on the concentration of enzyme. The first-order rate constant of the burst corresponds to the intrinsic rate of 8-oxoG excision and the slower steady-state rate measures the rate of product release (product DNA dissociation rate constant, koff). Here, we describe steady-state, pre-steady-state, and single-turnover approaches to isolate and measure specific steps during OGG1 catalytic cycling. A fluorescent labeled lesion-containing oligonucleotide and purified OGG1 are used to facilitate precise kinetic measurements. Since low enzyme concentrations are used to make steady-state measurements, manual mixing of reagents and quenching of the reaction can be performed to ascertain the steady-state rate (koff). Additionally, extrapolation of the steady-state rate to a point on the ordinate at zero time indicates that a burst of product formation occurred during the first turnover (i.e. y-intercept is positive). The first-order rate constant of the exponential burst phase can be measured using a rapid mixing and quenching technique that examines the amount of product formed at short time intervals (&lt;1 sec) before the steady-state phase and corresponds to the rate of 8-oxoG excision (i.e. chemistry). The chemical step can also be measured using a single-turnover approach where catalytic cycling is prevented by saturating substrate DNA with enzyme (E&gt;S). These approaches can measure elementary rate constants that influence the efficiency of removal of a DNA lesion.

Time courses for the glycosylase activity of 8-oxoguanine DNA glycosylase are biphasic exhibiting a burst of product formation and a linear steady-state phase. Utilizing quench-flow techniques, the burst and the steady-state rates can be measured, which correspond to excision of 8-oxoguanine and release of the glycosylase from the product DNA, respectively.

Steady-state Pré-steady-state, e Single-turnover Medição, Kinetic para DNA glicosilase Atividade

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice through their ice-binding surfaces. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modified technique used to determine the ice planes to which the AFPs bind. FIPA is based on the original ice-etching method for determining AFP-bound ice-planes. It produces clearer images in a shortened experimental time. In FIPA analysis, AFPs are fluorescently labeled with a chimeric tag or a covalent dye then slowly incorporated into a macroscopic single ice crystal, which has been preformed into a hemisphere and oriented to determine the a- and c-axes. The AFP-bound ice hemisphere is imaged under UV light to visualize AFP-bound planes using filters to block out nonspecific light. Fluorescent labeling of the AFPs allows real-time monitoring of AFP adsorption into ice. The labels have been found not to influence the planes to which AFPs bind. FIPA analysis also introduces the option to bind more than one differently tagged AFP on the same single ice crystal to help differentiate their binding planes. These applications of FIPA are helping to advance our understanding of how AFPs bind to ice to halt its growth and why many AFP-producing organisms express multiple AFP isoforms.

Antifreeze proteins (AFPs) bind to specific planes of ice to prevent or slow ice growth. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modification of the original ice-etching method for determination of AFP-bound ice planes. AFPs are fluorescently labeled, incorporated into macroscopic single ice crystals, and visualized under UV light.

Determinando os planos de ligação de gelo de proteínas anticongelantes pela afinidade do plano de gelo baseado em fluorescência

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, yielding results with high accuracy and high reproducibility. In metabolic and nutrition studies GC allows assessment of changes in fatty acid concentrations following interventions or during changes in physiological state such as pregnancy. Solid phase extraction (SPE) using aminopropyl silica cartridges allows separation of the major lipid classes including triacylglycerols, different phospholipids, and cholesteryl esters (CE). GC combined with SPE was used to analyze the changes in fatty acid composition of the CE fraction in the livers of virgin and pregnant rats that had been fed various high and low fat diets. There are significant diet/pregnancy interaction effects upon the omega-3 and omega-6 fatty acid content of liver CE, indicating that pregnant females have a different response to dietary manipulation than is seen among virgin females.

Pregnancy leads to significant changes to the fatty acid composition of maternal tissues. Lipid profiles can be obtained via gas chromatography to allow identification and quantification of fatty acids in individual lipid classes among rats fed various high and low fat diets during pregnancy.

O uso de cromatografia gasosa para analisar composicional Alterações de ácidos graxos no tecido de fígado de rato durante a gravidez

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.

PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

Monitoramento baseado em fluorescência de PAD4 Atividade através de um substrato Analog Pro-fluorescência

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

Preparation and Use of Carbonyl-decorated Carbenes in the Activation of White Phosphorus

Here we present a protocol for the synthesis of two distinct carbonyl-decorated carbenes. Both carbenes can be prepared using nearly identical procedures in multi-gram scale quantities. The goal of this manuscript is to clearly detail how to handle and prepare these unique carbenes such that a synthetic chemist of any skill level can work with them. The two carbenes described are a diamidocarbene (DAC, carbene 1) and a monoamidoaminocarbene (MAAC 2). These carbenes are highly electron-deficient and as such display reactivity profiles that are atypical of more traditional N-heterocyclic carbenes. Additionally, these two carbenes only differ in their electrophilic character and not their steric parameters, making them ideal for studying how carbene electronics influence reactivity. To demonstrate this phenomenon, we are also describing the activation of white phosphorus (P4) using these carbenes. Depending on the carbene used, two very different phosphorus-containing compounds can be isolated. When the DAC 1 is used, a tris(phosphaalkenyl)phosphane can be isolated as the exclusive product. Remarkably however, when MAAC 2 is added to P4 under identical reaction conditions, an unexpected carbene-supported P8&#160;allotrope of phosphorus is isolated exclusively. Mechanistic studies demonstrate that this carbene-supported P8allotrope forms via a [2+2] cycloaddition dimerization of a transient diphosphene which has been trapped by treatment with 2,3-dimethyl-1,3-butadiene.

Here, we present a protocol for the synthesis of two carbonyl-decorated carbenes. The protocol makes these interesting compounds readily available to chemists of all skill levels. In addition to the synthesis of these two carbenes, their use in the activation of white phosphorus is also described.

Preparação e Utilização de carbenos Carbonyl decorados na ativação de fósforo branco

Here we present a protocol for the synthesis of two distinct carbonyl-decorated carbenes. Both carbenes can be prepared using nearly identical procedures ...

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET radiopharmaceuticals. Due to their multi-day biological half-life, antibodies must be labeled with positron-emitting radionuclides with relatively long physical decay half-lives. Traditionally, the positron-emitting isotopes 124I (t1/2 = 4.18 d), 86Y (t1/2 = 14.7 hr), and 64Cu (t1/2 = 12.7 hr) have been used to label antibodies for PET imaging. More recently, however, the field has witnessed a dramatic increase in the use of the positron-emitting radiometal 89Zr in antibody-based PET imaging agents. 89Zr is a nearly ideal radioisotope for PET imaging with immunoconjugates, as it possesses a physical half-life (t1/2 = 78.4 hr) that is compatible with the in vivo pharmacokinetics of antibodies and emits a relatively low energy positron that produces high resolution images. Furthermore, antibodies can be straightforwardly labeled with 89Zr using the siderophore-derived chelator desferrioxamine (DFO). In this protocol, the prostate-specific membrane antigen targeting antibody J591 will be used as a model system to illustrate (1) the bioconjugation of the bifunctional chelator DFO-isothiocyanate to an antibody, (2) the radiosynthesis and purification of a 89Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate, and (3) in vivo PET imaging with an 89Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate in a murine model of cancer.

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described.

O bioconjugação e radiossíntese de 89 Anticorpos Zr-DFO-rotulados

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass spectrometer, it is necessary to characterize and understand the physical principles of the source. Most commercial ambient ionization sources utilize jets of nitrogen, helium, or atmospheric air to facilitate the ionization of the analyte. As a consequence, schlieren photography can be used to visualize the gas streams by exploiting the differences in refractive index between the streams and ambient air for visualization in real time. The basic setup requires a camera, mirror, flashlight, and razor blade. When properly configured, a real time image of the source is observed by watching its reflection. This allows for insight into the mechanism of action in the source, and pathways to its optimization can be elucidated. Light is shed on an otherwise invisible situation.

This paper presents a protocol for the visualization of gaseous streams of an ambient ionization source using schlieren photography and mass spectrometry.

Visualização de ambiente Espectrometria de Massa com o uso da fotografia Schlieren

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient radiolabeling of DBCO-group-functionalized gold nanoparticles using a copper-free click reaction. Radioiodination of the stannylated precursor (2) was carried out by using [125I]NaI and chloramine T as an oxidant at room temperature for 15 min. After HPLC purification of the crude product, the purified 125I-labeled azide (1) was obtained with high radiochemical yield (75 &plusmn; 10%, n = 8) and excellent radiochemical purity (&gt;99%). For the synthesis of radiolabeled 13-nm-sized gold nanoparticles, the DBCO-functionalized gold nanoparticles (3) were prepared by using a thiolated polyethylene glycol polymer. A copper-free click reaction between 1 and 3 gave the 125I-labeled gold nanoparticles (4) with more than 95% of radiochemical yield as determined by radio-thin-layer chromatography (radio-TLC). These results clearly indicate that the present radiolabeling method using a strain-promoted copper-free click reaction will be useful for the efficient and convenient radiolabeling of DBCO-group-containing nanomaterials.

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

A detailed procedure for the synthesis of a 125I-labeled azide and the radiolabeling of dibenzocyclooctyne (DBCO)-group-conjugated, 13-nm-sized gold nanoparticles using a copper-free click reaction is described.

Um protocolo otimizado para a radiomarcação eficiente de nanopartículas de ouro usando um<sup&gt; 125</sup&gt; Marcado com Eu Azida grupo prostético

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing 99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with 99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the 99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

Preparação e Avaliação de<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc-rotulados tridentadas Quelatos de Pré-alvo Usando Bioorthogonal Química

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...