Os autores gostariam de agradecer Chris Morrow para assistência técnica. O financiamento foi fornecido pelo NIH SBIR (R43) conceder 1R43GM101859-01 (MPI) GRANT10940803.

1. Célula Preparação Cultura <ol><li> Guarde os estoques celulares NIH/3T3 em nitrogênio líquido até que esteja pronto para uso. </li><li> Preparar meio completo para células NIH/3T3 utilizando Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino, tampão HEPES 10 mM, 50 unidades / ml de penicilina, e 50 ug / ml de estreptomicina. </li><li> Descongelar as células para 2-3 min num banho de água com agitação a 37 ° C. </li><li> Ressuspender as células em 5 ml de meio completo e centrifugar a 1500 g durante 3 min. </li><li> Retirar o sobrenadante celular, sem perturbar o sedimento celular. </li><li> Ressuspender as células em 5 ml de meio e contar as células utilizando um hemocitómetro. <ol><li> Retirar 10 mL da suspensão de células e colocar num tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. </li><li> Adicionar 10 ul de azul de tripano para a suspensão de células e agitar com a ponta da pipeta. </li><li> Pipetar 10 ul de células coradas para uma câmara de hemocitómetro. </li><li> Contagem de células em hemocitómetro na 10xampliação. <ol><li> Contar as células vivas (bolas pequenas, brancas) para 4 dos 9 grandes praças. Só contar as células vivas que não aparecem azul escuro da mancha Trypan Blue. </li><li> Calcula-se a média do número de células por quadrado grande, resultando em o número de células de 4 x 10 células / ml na suspensão inicial de células. </li><li> Células de sementeira a uma densidade de 1 x 10 5 células / ml, com um total de 5 mL em cada frasco T25. </li></ol></li><li> Células de cultura para entre 70% e 80% de confluência antes dos experimentos iniciais. Atualizar mídia a cada 2-3 dias ou quando necessário. </li></ol></li></ol> 2. Printing Preparação da Superfície <ol><li> Mark um rectângulo com marcador na parte inferior de uma tratados com cultura de tecidos de poliestireno (TCTPS) placa de 12 poços do tamanho da cabeça de impressão (7 mm × 19 mm). </li><li> Pipetar 50 mL de soro fetal bovino para a área retangular e espalhe-o sobre toda a região com a ponta. </li><li> Deixe a placa de Petrinum estéril biossegurança capuz O / N para permitir que o ponto de soro para secar completamente. Estas placas devem ser preparado não mais do que dois dias antes da utilização. </li></ol> 3. Impressão Submerso <ol><li> Lavar a cabeça de impressão com água destilada. <ol><li> Encha uma 60 milímetros placa de Petri com água destilada e encaixar a cabeça de impressão para a superfície. </li><li> Fluxo de água destilada através de cada uma das linhas de 2 min a 150 mL / min usando uma bomba pneumática. </li><li> Descarte a água da placa de Petri e encha-o com água limpa. </li><li> Mova a cabeça de impressão para cima e para baixo na água três vezes. </li></ol></li><li> Encaixe o centro da cabeça de impressão sobre o local revestido de soro na pré-preparados placa de 12 poços. </li><li> Primeiro a cabeça de impressão com a mídia completas pré-aquecido, a 300 mL por canal. </li><li> Imprimir células suspensas a uma concentração de 50.000 células / mL sobre a superfície e 60 mL / min, 100 ul por canal. </li><li> Coloque a cabeça de impressão, deixou ancorado contra osuperfície, e o colector, num incubador de cultura de células definido para 5% de CO 2 e 37 ° C durante 2 horas. </li><li> Após a incubação de 2 horas, remover a cabeça de impressão e colocar a tampa no prato de cultura. O momento em que a cabeça de impressão removido é considerado o ponto de tempo 0 h. </li></ol> 4. Cultura de Células Padrão <ol><li> Adicionar 1 ml de meio pré-aquecido a uma das TCTPS de 12 poços da placa de soro-manchado, preparado no passo 2. </li><li> Tomar 1 ml da suspensão de células remanescente a partir do passo 2 e da pipeta num único poço de um de 12 poços TCTPS placa. Isto vai produzir uma cultura contendo 50.000 células no recipiente. </li><li> Colocar a placa de cultura de células dentro de uma incubadora a 37 ° C durante 2 horas. </li><li> Após a incubação de 2 horas iniciar a temporização,; para a consistência entre as amostras impressas e semeadura, este é considerado o ponto de tempo 0 h. </li></ol> 5. Visualization Cultura <ol><li> Depois de 0, 2, 24, e 48 horas as células tomada de cada um dos dois métodos described acima e imagem usando um microscópio invertido padrão. <ol><li> Corar as células com iodeto de propídio, um corante vermelho fluorescente que apenas é incorporado no núcleo de células mortas. <ol><li> Lave as células 3 vezes com 1 ml de solução salina tamponada com fosfato com cálcio e magnésio (PBS + +) para remover todos os detritos. </li><li> Adicionar 1 ml de pré-aquecido PBS + + para cada recipiente de cultura. </li><li> Adicionar 1 ml de solução de estoque de iodeto de propídio (1 mg / ml) a cada recipiente de cultura. </li><li> Incubar as células coradas com iodeto de propídio a 37 ° C durante 10 min. </li></ol></li><li> Imagem as células usando um microscópio invertido em 10x e 40x. </li></ol></li><li> Descarte as pilhas em um recipiente apropriado de risco biológico. </li></ol>

<ol>
	<li>Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cellular+microarray+platforms:+applications+in+drug+discovery,+toxicology+and+stem+cell+research.">High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research.</a> Trends in Biotechnology. 27, 342-349 (2009).</li><li>Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+assays:+fuelling+drug+discovery.">Cell-based assays: fuelling drug discovery.</a> Anal Bioanal Chem. 398, 227-238 (2010).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+microfluidic+devices+for+in+vitro+cell+culture+for+cell-biology+research.">Recent developments in microfluidic devices for in vitro cell culture for cell-biology research.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 35, 150-164 (2012).</li><li>Geysen, H. 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Chem. 80, 8561-8567 (2008).</li><li>Keighley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+need+for+high+throughput+kinetics+early+in+the+drug+discovery+process.">The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process.</a> , (2011).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+in+vitro+ovarian+cancer+coculture+model+using+a+high-throughput+cell+patterning+platform.">A three-dimensional in vitro ovarian cancer coculture model using a high-throughput cell patterning platform.</a> Biotechnol J. 6, 204-212 (2011).</li><li>Tuckwell, D. S., Weston, S. A., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins:+a+review+of+their+structure+and+mechanisms+of+ligand+binding.">Integrins: a review of their structure and mechanisms of ligand binding.</a> Symposia of the Society for Experimental Biology. 47, 107 (1993).</li><li>Roberts, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mixed+self-assembled+monolayers+presenting+RGD+and+(EG)+3OH+groups+to+characterize+long-term+attachment+of+bovine+capillary+endothelial+cells+to+surfaces.">Using mixed self-assembled monolayers presenting RGD and (EG) 3OH groups to characterize long-term attachment of bovine capillary endothelial cells to surfaces.</a> Journal of the American Chemical Society. 120, 6548-6555 (1998).</li><li>Chandra, R. A., Douglas, E. S., Mathies, R. A., Bertozzi, C. 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Chem. 18, 5717-5721 (2008).</li><li>Onoe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Microfabrication:+Observing+Intercellular+Interactions+Using+Lithographically-Defined+DNA+Capture+Sequences.">Cellular Microfabrication: Observing Intercellular Interactions Using Lithographically-Defined DNA Capture Sequences.</a> Langmuir. 28, 8120-8126 (2012).</li><li>Hsiao, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-Coated+AFM+Cantilevers+for+the+Investigation+of+Cell+Adhesion+and+the+Patterning+of+Live+Cells.">DNA-Coated AFM Cantilevers for the Investigation of Cell Adhesion and the Patterning of Live Cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. 47, 8473-8477 (2008).</li></ol>

Os autores são funcionários e acionistas de Wasatch microfluídica que produz reagentes e / ou instrumentos utilizados neste manuscrito.

A tecnologia de impressão 3D microfluídicos aqui descrito é o único capaz de matrizes de impressão microfluidically de células em um líquido bem cheio, ou seja, uma superfície submersa. Ao imprimir sobre as superfícies submersas, microarrays de célula pode ser produzida que manter o fenótipo celular fisiologicamente relevante das células, bem como a capacidade para multiplexar as células no fundo de um único poço Figura 4. Os resultados deste estudo mostram que microfluidically i...

Os recentes avanços na indústria farmacêutica têm levado a um interesse crescente no uso de microarranjos de celulares no processo de descoberta de medicamentos para a triagem de drogas e cytotoxicological 1,2,3 análise. O desenvolvimento de ensaios in vitro de alto rendimento e métodos de rastreio utilizando microarrays de células facilitaria o desenvolvimento rápido e de baixo custo de candidatos da droga, bem como avanço a compreensão fundamental da célula 1,4. A abordagem tradicional de triagem com células usa plataformas bem-placa convencionais; No entanto, esta abordagem é limitada devido ao custo elevado, o rendimento limitado, e uma capacidade limitada para fornecer informação quantitativa sobre a função das células de 1,5. Devido a essas limitações, a pesquisa em tecnologias de microarray celular é crescente para a caracterização molecular biológica, engenharia de tecidos, e droga triagem 1,6. As vantagens de microarrays celulares incluem o uso de amostra menor, efeitos mínimos deheterogeneidade fenótipo celular mascarando informações, eo mais importante a capacidade de automatizar ensaios para mais aplicações de alto rendimento 1,7,8. A indústria farmacêutica utiliza atualmente de alto rendimento à base de células testes de rastreio com 2D culturas em monocamada de células para triagem de drogas em locais bem microplacas 9. Células de multiplexagem em poços de placas de microtitulação oferece o potencial para um maior rendimento com opções de experimentação originais. Além disso, as actuais tecnologias de micromatrizes celulares permitem que as células para secar o que poderia alterar dramaticamente o fenótipo das células in vivo a partir de 10,11. A fim de superar estes problemas, o MFCA foi concebido e é mostrado na Figura 1. O design dos fluidos MFCA 3D permite que a ponta da cabeça de impressão da Figura 1 a ser baixada para dentro de um banho e comprimida contra a superfície de modo a formar uma vedação. A ponta de silicone macio da cabeça de impressão se comporta como umjunta e forma uma vedação reversível. A tecnologia MFCA é adequada exclusivamente para fazer a interface com superfícies submersas, que é necessário para ambas as culturas de células e sistemas fatia do tecido, e é difícil ou impossível com a maioria das outras abordagens. Pinos ou impressão a jato de tinta não vai funcionar, e dispositivos microfluídicos 2D não são adequados para a deposição ou interface com grandes conjuntos de pontos discretos. Além disso, ao miniaturizar e localizando o experimento - microarray celular - o MFCA supera os principais problemas associados com a de alto rendimento à base de células de ensaios de rastreio. O CFM utiliza redes de canais 3D para ciclo de pequenas amostras de fluido de volume mais localizações pontuais microscópicas em uma superfície de 12,13. Ao imprimir com fluxo, biomoléculas, as células e os outros reagentes são mantidos em meio líquido durante todo o processo de impressão, permitindo a impressão de biomoléculas sensíveis e células, sem exposição ao ar, o que dificulta as técnicas de impressão de células actuais. É também possível imprimir directamente a partir de material em bruto, tais como sobrenadantes de hibridoma, ou, desde que exista um mecanismo de captura na superfície da matriz. O objetivo deste artigo é explicar em detalhes a impressão submersa de dois tipos de células em uma superfície.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="571">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Continuous Flow Microspotter</td>
			<td style="width:71px;">Wasatch Microfluidics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NIH/3T3 cells</td>
			<td style="width:71px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dubbleco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td>base media for cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">HEPES buffer</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15630-080</td>
			<td>cell media additive (control pH)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11360-070</td>
			<td>cell media additive</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cell media additive</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15250-061</td>
			<td>stain cell sfor counting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Haemocytometer</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">267110</td>
			<td>cell chamber to count cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Nikon Eclipse TS100</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to check on cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Nikon Eclipse TE2000-U</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used for collecting images</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Phosphate Buffered Saline (with calcium and magnesium)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14040-133</td>
			<td>rinsing cells before passaging and before staining with PI</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">TrypLE Express&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A12177-01</td>
			<td>used to remove cells from surface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the submerged printing of cells onto a modified surface using a continuous flow microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell phenotype after printing, poor organization and distribution of desired cells, and the inability to deliver drugs and/or nutrients to targeted areas in the array. Our 3D microfluidic printing technology is uniquely capable of sealing and printing arrays of cells onto submerged surfaces in an automated and multiplexed manner. The design of the microfluidic cell array (MFCA) 3D fluidics enables the printhead tip to be lowered into a liquid-filled well or dish and compressed against a surface to form a seal. The soft silicone tip of the printhead behaves like a gasket and is able to form a reversible seal by applying pressure or backing away. Other cells printing technologies such as pin or ink-jet printers are unable to print in submerged applications. Submerged surface printing is essential to maintain phenotypes of cells and to monitor these cells on a surface without disturbing the material surface characteristics. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays are produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas including cancer, diabetes, inflammation, infections, and cardiovascular disease.

As células NIH/3T3 de linha de células de fibroblastos foram semeados em impressos ou uma superfície submersa. As células foram cultivadas a uma densidade de 5 X 10 4 culas por ml. As células foram semeadas utilizando técnicas de cultura de células tradicional. As células foram impressas utilizando uma grande formato, doze fluxo cabeçote célula, onde os canais são maiores (~ 500 mm) do que a utilizada para CFM proteínas e outras biomoléculas. As células foram semeadas ou impresso sobre uma super...

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The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

This 3D microfluidic printing technology prints arrays of cells onto submerged surfaces. We describe how arrays of cells are delivered microfluidically in 3D flow cells onto submerged surfaces. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays were produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas.

A impressão Submerso de células em uma superfície modificada Usando um contínuo fluxo Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

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Research

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Bioengineering

8.6K visualizações.  Wasatch Microfluidics. This 3D microfluidic printing technology prints arrays of cells onto submerged surfaces. We describe how arrays of cells are delivered microfluidically in 3D flow cells onto submerged surfaces. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays were produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas.