O Crio-EM tornou-se uma técnica padrão para a determinação da estrutura de proteínas e seus complexos. Este protocolo descreve as melhores práticas de como obter conjuntos de dados Cryo-EM de alta resolução a partir dos microscópios TEM de 200 kV de gama média. O Crio-EM pode determinar a estrutura proteica em condições quase nativas em solução para vários estados conformacionais e estados funcionais simultaneamente, o que é evasivo para outras técnicas estruturais.
Informações estruturais obtidas podem ser utilizadas para a elucidação de mecanismos moleculares da função proteica, bem como para o desenho de medicamentos baseados em estruturas. Por exemplo, uma publicação recente na estrutura de fibrilas amiloides revelou vários locais de ligação de um ligante vital. No entanto, neste protocolo, usamos as amostras padrão de apoferritina e proteasome para demonstrar os passos críticos na obtenção de dados Cryo-EM de alta resolução.
A operação de um Crio-TEM tornou-se mais fácil nos últimos anos, especialmente devido à introdução de recursos avançados de automação. No entanto, para a primeira sessão, aconselhamos que você tenha um treinamento com usuários mais experientes. A partir daí, a progressão na técnica é relativamente rápida.
Demonstrando o procedimento estará Adrian Koh, que é cientista sênior de aplicação da Thermo Fisher Scientific. Insira grades automáticas no do carregador automático em condições de nitrogênio líquido. Insira o com grades automáticas em uma cápsula de transferência de nitrogênio líquido resfriado.
Insira ainda a cápsula no microscópio e clique no botão Dock na interface do microscópio UI para carregar o da cápsula no carregador automático do microscópio. Clique no botão Inventário para verificar a presença de grades automáticas no carregado. Em seguida, clique nos botões Carregar e Descarregar para inserir as grades automáticas na coluna para imagens TEM.
Selecione a guia Atlas e clique no botão Nova Sessão para abrir uma nova sessão. Preencha detalhes como nome da sessão e localização de armazenamento de dados e clique no botão Aplicar. Selecione as grades de interesse selecionando uma caixa de seleção ao lado do número de grade correspondente.
Clique no botão Iniciar para iniciar uma coleção totalmente automatizada de atlas de todas as grades selecionadas. Quando a coleção for concluída, clique em etiquetas de grade para revisar os atlases adquiridos. Selecione a guia EPU e vá para Nova Sessão para criar uma nova sessão no painel esquerdo.
Selecione a opção Nova sessão para usar as predefinições ópticas do conjunto atual. Preencha o nome da sessão. Selecione o tipo manual da sessão para ter controle sobre a seleção de furos individuais e quadrados de grade selecionados para coleta de dados posteriormente no protocolo.
Selecione o modo de aquisição mais rápido para usar a mudança de imagem livre de aberração para coleta de dados. Em seguida, digite o local para salvar os metadados. Clique no botão Aplicar para criar uma nova sessão.
Selecione a tarefa de seleção quadrada no painel esquerdo para mostrar o atlas coletado da grade. Identifique os quadrados da grade com papel alumínio de suporte intacto sem danos, gelo fino e buracos de papel alumínio, contaminação de gelo cristalino insignificante no quadrado da grade e gradiente de brilho mínimo em toda a grade quadrada e dentro de buracos de folha individuais. Selecione os quadrados de grade para coleta de dados, seja no atlas completo ou em imagens de ladrilhos de alta qualidade.
Clique com o botão direito do mouse em um quadrado de grade de interesse e escolha toda a tarefa de seleção. Clique no botão Auto Eucentric para mover-se automaticamente para o primeiro quadrado de grade selecionado. Ajuste a altura eucêntrica e adquira uma imagem quadrada da grade para encontrar furos de papel alumínio.
Clique no botão Encontrar buracos para encontrar furos de papel alumínio na imagem. Clique no botão Remover buracos para fechar o botão da barra de grade para desmarcar orifícios perto das barras de grade. Ajuste os limites no histograma de brilho do filtro de gelo para remover todos os orifícios com gelo muito grosso e todos os orifícios vazios.
Clique com o botão direito do mouse em um buraco na imagem quadrada da grade e selecione mover o estágio para o local mover o palco aqui. Selecione a tarefa de definição de modelo no painel esquerdo. Clique no botão Adquirir para adquirir uma imagem inteira.
Defina os valores para atraso após a mudança de imagem para 0,5 segundos e atraso após o turno para cinco segundos. Clique no botão Encontrar e Centralizar para centralizar um buraco na imagem. Selecione o botão Adicionar área de aquisição e clique na imagem para selecionar o local no buraco centrado onde será feita a aquisição de imagens de alta ampliação.
Selecione o botão Adicionar área de foco automático e clique na imagem para selecionar o local na folha de suporte ao lado do orifício centralado onde o foco automático da imagem será realizado. Clique na área de aquisição verde para definir uma sequência de valores de desfocado na lista de desfocus na seção superior da janela de software. Depois de definir as configurações específicas do foco automático, escolha a opção Depois de centralizar para focar automaticamente no início de cada cluster AFIS.
Escolha a opção Lente Objetiva para foco automático mais rápido e redução de fase de deriva. Clique no botão Preparar todos os quadrados na tarefa de seleção de furos para definir automaticamente a coleta de dados e todos os outros quadrados de grade selecionados de acordo com as configurações usadas neste primeiro quadrado de grade. Selecione a tarefa de definição de modelo, adquira uma nova imagem, mova o palco para uma área limpa na folha de carbono pelo clique com o botão direito do mouse e selecione a opção de menu mover o estágio aqui.
Selecione a guia Funções automáticas. Depois de definir o desfoco e iterado desejados, mude para a predefinição de foco automático e clique no botão iniciar para executar a função de foco automático. Selecione a tarefa Autostigmate, mude para a predefinição do anel de Thon e pressione o botão Iniciar.
Selecione a tarefa Autocoma e pressione o botão Iniciar. Mova o palco para uma área com uma grade quebrada quadrada. Confirme a transparência da área tirando uma única imagem de foco automático.
Abra a interface do usuário Sherpa e selecione o aplicativo Filtro de Energia. Clique no botão Centro e na opção de perda zero para centralizar a fenda do filtro de energia de perda zero. Clique no botão Sintonizar na opção isochromaticity.
Clique na opção Ampliação de sintonia e distorções de sintonia nas distorções geométricas e cromáticas. Vá para a guia EPU, selecione a tarefa Aquisição Automatizada e clique no botão Iniciar Execução para iniciar a coleta de dados totalmente automatizada. A figura mostra grades Cryo-EM exibindo um gradiente de espessura de gelo sobre a superfície da grade.
As grades excluídas da investigação são grade ruim com gelo espesso e uma grade dobrada com gelo ruim e contaminação, enquanto grades aceitáveis são aquelas com bom gradiente de gelo e uma grade típica com gelo fino bom e pequeno gradiente de gelo. A figura mostra a renderização 3D final do mapa Cryo-EM de apoferritina reconstruída. A alta estabilidade e simetria fazem dela uma amostra de referência ideal para imagens e processamento de imagens Cryo-EM de alta resolução.
O polimento bayesiano, o refinamento ctf e a correção da esfera de Ewald resultaram em um mapa de resolução de 1,63 angstrom. A figura mostra uma visão detalhada do mapa crio-EM de apoferritina reconstruída no nível da cadeia lateral do aminoácido individual. A densidade das cadeias laterais de aminoácidos é bem resolvida e o modelo atômico pode ser inequivocamente construído dentro do mapa.
A imagem aqui mostra dois conjuntos de dados diferentes em diferentes valores de desfoco coletados da mesma grade Cryo-EM com quadrados de grade semelhantes com uma fenda totalmente aberta e uma fenda de 10 elétrons volts que indica que a fenda de 10 elétrons volts melhora significativamente o contraste da imagem. A figura aqui mostra uma visão geral do mapa Cryo-EM proteasome 20S com subunidades segmentadas usadas como amostra Cryo-EM padrão. E sua visão ampliada com um modelo atômico equipado representa o núcleo catalítico estável do complexo proteasome com a simetria D7.
O protocolo contém duas etapas críticas. Primeiro, procurando áreas com gelo fino e vítreo contendo partículas homogêneas. E segundo, configurando iluminação paralela para aquisição de dados.
Com reconstruções de alta resolução de proteínas alcançando dois a três angstroms em resolução, você é mais capaz de entender os mecanismos moleculares da doença e melhorar os condutores de drogas. Anteriormente, a cristalização era necessária se você quisesse estudar a base estrutural dos fenômenos biológicos. Hoje com o Cryo-EM, isso não é mais necessário.
E assim, com o Cryo-EM, permitimos que os cientistas estudem uma gama mais ampla de fenômenos biológicos em um nível estrutural.
