Nosso protocolo fornece um pipeline para integração precisa e detecção visual simples de edições CRISPR, bem como um exemplo de fenotipagem pós-edição. A principal vantagem dessa abordagem é a facilidade de detecção de edição CRISPR, permitindo a identificação eficiente e simplificada de edições bem-sucedidas. Esta abordagem permite a geração e caracterização simples de variantes associadas à doença em peixes-zebra.
Aqui, estamos examinando a síndrome do QT longo. Estudos de acompanhamento sobre terapias farmacêuticas são então viáveis de explorar. Comece projetando dois guias de sgRNA para extirpar a sequência do local alvo de knock-in, identificando o ortolog de peixe-zebra para o gene de interesse.
Use o Ensembl para localizar o local alvo dentro da sequência gênica de interesse, incluindo a sequência de flanco de dois quilobases usada para criar o modelo. Use uma ferramenta de software de design como CRISPOR e selecione espécies de Danio rerio e enzima Cas. Para a abordagem de dois sgRNA, escolha um sgRNA antes do éxon alvo e um segundo sgRNA dentro do íntron a jusante imediato.
Certifique-se de que os sgRNAs selecionados tenham alta especificidade e baixa ligação fora do alvo prevista. Use classificações CRISPOR para identificar guias com o mínimo de vinculação fora do alvo. Agora identifique os locais potenciais fora do alvo mais prováveis para a genotipagem de sequenciamento de Sanger baseada em PCR.
Depois de selecionar os dois sgRNAs, obtenha o complemento reverso para cada um, dois oligos complementares que precedem a mutação e dois oligos complementares a jusante da mutação. Adicione locais de restrição compatíveis em cada oligo para incorporar o guia no plasmídeo de escolha. Para a integração das sequências de guias selecionadas no plasmídeo DR274, crie uma saliência usando um local de restrição BSA1 de cinco primos e projete os locais de reconhecimento BSA1 nas cinco extremidades principais das guias.
Em seguida, projete o modelo exógeno para HDR em peixe-zebra, escolhendo dois fragmentos de sequência que flanquearão o gene repórter YFP venoso M alojado no plasmídeo PKHR5. Divida o modelo em dois segmentos para inseri-lo em ambos os lados do gene do repórter YFP venoso M. Certifique-se de que o local dividido esteja em um íntron para evitar o corte da sequência de codificação.
Incorporar todas as modificações necessárias mencionadas no manuscrito para facilitar a clonagem no plasmídeo PKHR5. Injete os embriões no estágio de uma célula em aproximadamente 40 minutos após a fertilização. Após três dias de fertilização, anestesiar a larva do peixe-zebra, transferindo-a para uma placa de Petri de 25 milímetros contendo 0,3%MS222 até que eles percam o reflexo de auto-endireitamento.
Uma vez anestesiada, transfira a larva para o poço de uma placa de 24 poços. Usando um microscópio capaz de detectar GFP ou YFP, rastreie a fluorescência do gene repórter nos olhos da larva. Depois de capturar as imagens da larva, documente a presença ou ausência da expressão gênica do repórter.
Para confirmar a edição precisa e precisa do gene HDR, realize a genotipagem primeiro anestesiando a larva três dias após a fertilização, conforme demonstrado anteriormente, e isolando o DNA genômico do clipe da cauda usando o método hotshot. Adicione o clipe de cauda excisado a 15 microlitros de hidróxido de sódio 25 milimolares e incube-o a 95 graus Celsius durante 20 minutos, depois neutralize com 1,5 microlitros de ácido trico clorídrico. Centrifugar a 13, 800 vezes G durante 30 segundos e reter o sobrenadante contendo o ADN genómico extraído.
Recupere a larva em meios E3 e devolva-a ao sistema de alojamento se for pretendido um estudo mais aprofundado. Usando o DNA genômico extraído como um modelo, execute o sequenciamento de Sanger baseado em PCR de locais no alvo e potenciais fora do alvo. Certifique-se de que o projeto do primer no alvo capture o local da mutação e o local de ligação do sgRNA mais próximo.
Projete um primer de sequenciamento separado para detectar a transição do braço de homologia inserido e do gene alvo para confirmar a integração no gene de interesse. Projete cartilhas para sequenciar os três principais locais potenciais fora do alvo. Compile genotipagem dentro e fora do alvo, frequência cardíaca, dimensões pericárdicas, fenotipagem de ECG e dados do gene repórter identificáveis para cada peixe-zebra.
A expressão gênica do repórter venoso YFP M foi observada nas ilhas, atuando como um repórter positivo de integração bem-sucedida de modelos. Descobriu-se que os peixes com gene repórter positivo têm a edição precisa G2A, que introduz a variante R56Q no ZKCNH6A. A medida das dimensões pericárdicas como uma proporção da área dos olhos é mostrada aqui.
Uma tendência de bradicardia com edema pericárdico crescente associado aos distúrbios de repolarização cardíaca em peixes-zebra foi observada nas larvas editadas pelo gene R56Q. O registro de ECG de um coração de larva de peixe-zebra três dias após a fertilização é mostrado aqui. O aspecto mais importante dessa abordagem é o design de guias, como é frequentemente o caso nos procedimentos CRISPR.
Guias eficazes são essenciais para edições CRISPR bem-sucedidas. Métodos CRISPR alternativos podem ser seguidos, permitindo mais precisão ou outras funcionalidades. Além disso, genes grandes podem ser inseridos, como um complexo de edição primo, fornecendo um sistema de edição induzível in vivo.
