Este trabalho foi financiado pela Agence Nationale de la Recherche (Jeunes Chercheuses / Jeunes Chercheurs a EFN), Fondation Voir et Entendre e Fondation Bettencourt Schueller (Grants Jovem investigador EFN), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, posição permanente para EFN) e The National Eye Institute dos Institutos Nacionais de Saúde (R01-EY13295 para SCF). Além disso, o Institut de la Visão é financiado pelo Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Pierre et Marie Curie-Paris 6, Centre National de la Recherche Scientifique e do departamento de Paris.

Este experimento isolamento POS é demorado e pode precisar de até 12 horas para ser concluído se POS são rotulados antes do armazenamento. O protocolo foi adaptado de um artigo publicado pelo RS Molday e colegas em 1987, 31 e modificado por SC Finnemann e colegas em 1997 10. Os animais foram tratados de acordo com a Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) Declaração de Uso de Animais em Oftalmologia e Vision Research. Os protocolos foram revisados ​​e aprovados pelo Comitê de Charles Darwin Ética da Universidade Pierre e Marie Curie em Paris, 06 e Comitê Institucional Animal Care e Uso da Universidade Fordham. 1. Geral Set Up <ol><li> Obter 80 frescas de suíno ou de vaca olhos tão fresco, logo após o abate quanto possível e mantê-los refrigerados no escuro. Fornecer instruções para o provedor para que a empresa procede da mesma maneira. Este protocolo é otimizado para 80 olhos. Paraprosseguir com mais olhos e obter estoques maiores (por exemplo, a partir de 160 olhos), o dobro das quantidades de solução e realizar duas rodadas de ultracentrifugação; amostras de piscina mais tarde, na etapa de coleta (veja o passo 2.2.2). </li><li> Configure no banco a lâmpada safelight vermelho, absorventes, lenços (tabela de materiais). Prepare 15 centímetros pratos e sacos de risco biológico para a recolha de resíduos (partes do olho não utilizado, vítreo ...). Usar apertada labcoat, luvas, mangas de protecção e óculos de proteção. </li><li> Precauções: <ol><li> Pré-chill todas as soluções, em seguida, mantê-los frio durante todas as etapas. Manter os olhos e gradientes refrigeradas em gelo tanto quanto possível. </li><li> Manter os olhos e tecidos derivados no escuro, tanto quanto possível até que o passo de recolha após a ultracentrifugação a fim de evitar a fotodegradação de pigmentos visuais e perda da coloração laranja-rosa da forma activa dos photopigments. </li></ol></li></ol> 2. Protocolo de Ações <ol><li> Preparar soluções e gradientes: <ol><li> Estoque taurina Thaw completamente através de um banho de água a 37 ° C. </li><li> Prepare todas as soluções de soluções de estoque (Tabela 1, soluções de reserva) e misture bem a sacarose com outros ingredientes, usando um agitador magnético para cada solução. <ol><li> Preparar 15 ml da solução de homogeneização a uma concentração final de 20% de sacarose, 20 mM Tris pH 7,2 de etilo, 2 mM de MgCl 2, 10 mM de glicose e 5 mM de taurina. </li><li> Preparar a solução de sacarose a 25% para uma concentração final de sacarose a 25% (utilizando 70% de sacarose estoque), 20 mM de acetato de tris pH 7,2, 10 mM de glicose e 5 mM de taurina. </li><li> Preparar a solução de sacarose a 60% para uma concentração final de 60% de sacarose (usando pó de sacarose), 20 mM Tris pH 7,2 de etilo, glicose 10 mM e 5 mM de taurina. </li><li> Preparar a solução de lavagem para uma concentração final de 20 mM de acetato de tris de pH 7,2 e 5 mM de taurina. </li><li> Preparar a solução de lavagem 2a uma concentração final de 10% de sacarose, 20 mM de acetato de tris de pH 7,2 e 5 mM de taurina. </li><li> Preparar a solução de lavagem de 3 a uma concentração final de 10% de sacarose, 20 mM de fosfato de sódio pH 7,2 e taurina 5 mM. </li></ol></li><li> Firmar o fabricante de gradiente com um agitador magnético e inserir uma barra de agitação na câmara mais próxima da saída, onde a solução de 60% será inserido. Usar uma pipeta de ponta P200 de corte colocado na saída da tubagem para alcançar velocidade de vazamento adequada. </li><li> Fundido gradientes lineares delicadamente por diluição e agitação da solução de sacarose a 60% com o um, 25% a partir de 12 ml de cada solução (isto é, o total de 6 tubos de 80 olhos) em tubos de ultracentrífuga previamente arrefecidos. Mexa bem a solução de sacarose gradualmente-diluição de 60%. Firmar a velocidade do fluxo de gradiente, derramando a solução de forma suave e não muito rápido. NOTA: De modo a obter um gradiente contínuo, linear, manter a ponta da pipeta de abertura à direita na superfície da solução durante todo o gradiente formation. </li><li> Deixe os gradientes de sentar no gelo por cerca de 1 hora para a estabilização. Mantenha os gradientes refrigeradas até carregado. Não agite os tubos para evitar a interrupção do gradiente. </li></ol></li><li> Coleta de tecido: <ol><li> Recolha tecidos sob luz vermelha ofuscante. Tome um olho em uma das mãos e picar a frente com borda de lâmina de barbear, mantendo o olho longe (para evitar respingos; Figura 1). Use a lâmina de barbear para cortar o globo ocular anterior em duas metades (córnea, além de pelo menos 5 mm no esclera). Retire a lente e virar o ocular dentro para fora, de modo que ele pode ser realizada através da ponta de um dedo expondo assim a retina. </li><li> Usando a lâmina em ângulo, raspe a retina, separando facilmente e aparecendo como uma camada rosada, fora da superfície das células do tapete e cortado na cabeça do nervo óptico (Figura 1). Recolha todas as retinas em 2 x 50 ml bisnagas contendo 15 ml de solução de homogeneização sobre gelo. </li><li> Homo Retinahomoge-: <ol><li> Agitar a suspensão vigorosamente à mão durante 2 minutos a fim de interromper as diferentes camadas de células, quebrar POS fora do resto da célula PR, POS fragmento e homogeneizar a suspensão retina. </li><li> Filtrar através de um 3x dupla camada de gaze para remover os fragmentos de tecido grandes e recolher o fluxo de passagem em tubos de 50 ml limpos (Figura 1). A suspensão da retina de ser bastante espessa, para maximizar o rendimento, pressionar suavemente sobre a gaze para libertar restantes tecidos fragmentadas após cada filtração. </li></ol></li></ol></li><li> Fotorreceptores exterior fragmento segmento (POS) de isolamento: <ol><li> Cuidadosamente, coloque o prep retina bruto, cerca de 6-7 ml por tubo, mais de 6 x 30 ml tubos de ultracentrífuga, cada uma contendo 24 ml de frescas, refrigeradas contínua 25-60% gradiente de sacarose (Figura 1). Equilibrar os tubos opostos, conforme apropriado para o rotor a ser utilizado. Ultracentrífuga a 106.000 xg durante 50 min a 4 ° C. </li&gt; <li> Remover a maior parte da solução acima da banda laranja-rosa no terço superior do gradiente por aspiração (Figura 2A). Colher a faixa laranja-rosa com um P1000 ponta de corte para um copo. Descartar o resto depois neutralizar o uso de alvejante (resíduos biológicos). </li><li> Dilui-se com ~ 4 - 5 volumes de gelado de lavagem uma solução. Separa-se em tantos tubos de 30 ml, conforme necessário. Centrifugar a 3.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante cuidadosamente. </li><li> Ressuspender as pelotas em 10 ml de solução de lavagem 2 e centrifugação a 3000 xg durante 10 min como descrito acima. Ressuspender as pelotas em 15 ml Lavar 3 e roda de novo a 3000 xg durante 10 min. Combinar suspensões de vários peletes para reduzir o número de tubos necessários antes da centrifugação em 2 de lavagem e lava-se três soluções. </li></ol></li><li> POS alíquotas sem rotulagem: <ol><li> Ressuspender POS em 10-20 ml DMEM. Pré-diluir 10 ml em 490 DMEM ul (1:50) e contagem alongados, bem como POS girou em umcâmara de contagem celular (Figura 2B). Calcule o rendimento e concentração em partículas POS por mL. NOTA: O rendimento varia, dependendo principalmente da idade e da estirpe de porcos e vacas / tamanho dos olhos, por exemplo, uma boa preparação varia 5-8 x 10 9 a partir de POS 80 olhos de porco. </li><li> Decidir sobre o volume final de DMEM (tipicamente 10 - 20 ml) e adicionar sacarose para se obter uma concentração final de 2,5% de sacarose. </li><li> Preparar alíquotas do tamanho desejado, por exemplo, 5 x 10 7 POS por tubo para um volume de 2 ml para a ressuspensão de 96 poços de ensaio a 40 ul / poço. Gire uma alíquota de 5 min a 2.300 xg à temperatura ambiente e avaliar o tamanho da pelota. Prepare vários tamanhos alíquotas para diferentes volumes de aplicação como POS não devem ser congeladas e descongeladas duas vezes. </li><li> Congelar alíquotas POS a -80 ° C até à sua utilização. NOTA: As aliquotas são estáveis ​​durante muitos meses. Em nossas mãos, sem rótulo ou rotulados POS podem ser armazenados por pelo menos um ano. </li></ol></li><li> Rotulagem POS e alíquotas: NOTA: De modo geral, utilizar FITC para marcar POS para a quantificação de ensaios de fagocitose, mas outros corantes podem ser usados ​​também em função das necessidades. <ol><li> Ressuspender 1 10 mg de FITC a um frasco de 2,5 mg / ml de concentração em 0,1 M de tampão de carbonato de Na de pH 9,5 por mistura de 2,6 ml de NaHCO3 0,1 M pH 8,4 com 1,4 ml de 0,1 M de Na 2 CO 3 pH de 11,5 (Quadro 2, soluções de reserva). Girar durante 1 hora à temperatura ambiente ao mesmo tempo proteger da luz e centrifugação durante 5 minutos à velocidade máxima, para sedimentar os sólidos não-FITC ressuspensas. </li><li> Ressuspender o sedimento em 10 ml de POS de lavagem de solução de 3 (ou DMEM) e juntar 2 ml de solução de FITC para 80 olhos. Armazenar sobra FITC congelado a -80 ° C. Para rodar, pelo menos, 1,5 horas à temperatura ambiente. Proteger da luz usando papel alumínio. </li><li> Lavar POS marcado duas vezes, utilizando solução de lavagem 3, como descrito na secção 2.3.4, em seguida, uma vez ou duas vezes em DMEM até quase nenhuma FITC livre é visto no sobrenadante frAction. Ressuspender POS em DMEM e proceder como para POS não marcado para contagem e alíquotas (seção 2.4). </li></ol></li><li> Usando POS em experiências: <ol><li> POS Thaw à RT, e mantê-los no escuro, tanto quanto possível, se eles são fluorescently marcado. Girar durante 5 minutos a 2300 xg à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante. </li><li> Imediatamente ressuspender em volume apropriado de solução de ensaio como ditado pela experiência. Em caso de diferentes tempos de desafio POS, loja novamente suspensas no POS RT no escuro entre pontos de tempo por várias horas. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

Três degraus ou condições são cruciais para uma purificação optimizado: qualidade da carcaça de gradiente e manipulação delicada tubos de gradiente, mantendo tecidos refrigerada e no escuro até que o passo de recolha, a força de agitação de homogenatos da retina para se obter o isolamento POS adequado do restante da PR célula. Se algumas questões surgem em ver a banda laranja corretamente, eles são provavelmente devido a uma das três razões acima (ver também o segundo parágrafo da seção Res...

Na retina, a visão é desencadeada por isomerização de moléculas fotossensíveis chamados opsinas, antes de ser transformado em um sinal que pode ser transmitido entre os neurónios para cima para as áreas visuais no cérebro. Estas moléculas são incorporados em pilhas de discos que se assemelham panquecas membranosas que constituem as partes segmentares exterior de células fotorreceptoras (RP). Sendo submetido a constante exposição à luz e, portanto, os níveis consideráveis ​​de estresse oxidativo, PRs renovar continuamente os seus segmentos externos para limitar o dano oxidativo potencial. Segmentos externos fotorreceptoras estão em contato próximo com microvilosidades apical das células do epitélio pigmentado da retina vizinhos (RPE). Células RPE constituem a parte exterior da barreira hemato-retiniana e garantir inúmeras tarefas que são cruciais para fotorreceptores saúde e função 1, como o que extingue os raios de luz através de pigmentos de melanina, re-isomerização do retinal componente opsina fotorreactivo, fornecendo nutrientes e gCRESCIMENTO fatores, participando de eliminação PR metabólito. Além disso, as células de RPE eliminam gasto POS e reciclar seus componentes, uma ocupação diária, que é regulada pelo ritmo circadiano na retina de mamíferos 2,3. A folga de galpão POS é absolutamente necessário para a sobrevivência PR. Quando ele está completamente revogada, POS detritos se acumulam e PRs degenerar causando 4,5 perda de visão rápida. Se o perfil rítmico é perdida e substituída por uma actividade constante, defeitos PR e RPE acumular com 6 anos de idade. Portanto, é muito importante para caracterizar a regulação molecular de EPR fagocitose in vitro, a fim de compreender fenótipos ligados à sua disfunção. Curiosamente, a maquinaria molecular em células RPE é muito semelhante à utilizada pelos macrófagos para eliminar as células apoptóticas e ambos dependem do reconhecimento de fosfatidilserina exposta em detritos fagocítica 7-9. Ainda, as células de RPE e macrófagos regular o pHagocytosis de forma diferente, como macrófagos optar pela eliminação imediata das células em apoptose em tempo de encontro, enquanto as células RPE ritmicamente engolfar POS apenas uma vez por dia, apesar de estarem em contato permanente com segmentos externos. Isto sugere mecanismos de regulação específicos que ainda não são totalmente compreendidos. Muitas das moléculas envolvidas na maquinaria de EPR fagocítica foram identificados e validados graças à utilização de POS isolado e ensaios de fagocitose de cultura de células. O receptor de integrina alphavbeta5 localizado na superfície apical de células RPE, em coordenação com o seu ligando MFG-E8, liga-se especificamente ao POS 10-12, que são então internalizado através do receptor tirosina-quinase MerTK 13-15. O scavenger receptor CD36 tem sido mostrado para participar na ingestão de POS e influenciar a sua velocidade de 16,17, e poderá servir como um sensor de fosfolípidos oxidados na superfície POS 18. Internalização precisa o recrutamento de F-citoesqueleto de actina-assproteínas, tais como a anexina ociated 2 19, 20 e miosina II miosina VIIA 21,22. POS Native ou oxidado in vitro também são utilizados para entender o envelhecimento fenótipos de células RPE in vivo ligados ao acúmulo de mal digeridos POS oxidado 23-28. A geração de células epiteliais pigmentares derivadas de células-tronco deu início a uma nova aplicação para o isolado POS que são usados ​​para provar a funcionalidade das células antes de serem transplantadas para animais ou pacientes 29,30,27. Descrita pela primeira vez por Molday e colegas em 1987, 31, o protocolo para o isolamento de POS bovina combina um passo ultracentrifugação de homogeneizados de retina em gradientes de sacarose contínuas com observação da aparência laranja característico de fotopigmento retinal crus (levando 11- retinal cis). Nos últimos 10 anos, devido a precauções tomadas, a fim de minimizar o risco de doença da vaca louca, o uso de olhos de porco tornou-se increasingly proeminente. O protocolo aqui descrito mostra como obter grandes quantidades de POS de porcina ou bovina olhos que podem ser distribuídos em alíquotas e armazenados por longos períodos de tempo. Isto elimina a necessidade de preparar a partir de POS de roedores olhos, o que exige a utilização de um grande número de animais em cada preparação e ensaio de POS 32,33,21,22. Além disso, detalhes sobre rotulagem POS antes de armazenamento utilizando moléculas fluorescentes são dadas, para quantificar e visualizar POS de uma forma simplificada e comparáveis ​​para algumas aplicações, em comparação com a rotulagem POS após o ensaio de fagocitose 32,10. Portanto, estes grandes existências permitir a reprodutibilidade e facilidade de utilização, em muitos tipos diferentes de experiências.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="811">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:311px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:108px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:291px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Specific Material/Equipment</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">2-chamber gradient maker</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>gradient maker with 30-ml chambers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">3-mm diameter silicone tubing</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>tubing for gradient casting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">small size magnetic stir bar</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>stir bar fitting the gradient maker chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">red safelight lamp</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>inactinic lamp for dissection in the dark</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Clear 25x89 cm tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344058</td>
			<td>ultracentrifugation tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PP Oak Ridge tubes</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3119-0050</td>
			<td>30-mL centrifugation tubes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima LE-80K&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>365668</td>
			<td>ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW 32Ti swing rotor</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>369694</td>
			<td>swing rotor for ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Avanti J-26 XP</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>393124</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JA-25.50 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>363058</td>
			<td>rotor for Avanti J-26 XP centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">FITC Isomer I</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>F-1906</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Other Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">counting chamber (such as Neubauer or Malassez)</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dark ice buckets with lids</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">scales</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">magnetic stirrer and upholding pole</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">refrigated microcentrifuge</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">37 &#176;C water bath</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">-80 &#176;C freezer</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">labcoat</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Health and safety</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gloves</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sleeve protectors</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">googles</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">absorbent pads</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">biohazard trash bags and bins</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Weck-Prep blades (60-mm/2.25-in wide razor blades)</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-cm plastic dish</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sterile gauze sheets</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15- and 50-mL tubes</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Common consumables</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microtubes</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">aluminum foil</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale purification of porcine or bovine photoreceptor outer segments for phagocytosis assays on retinal pigment epithelial cells

Análise de uma das funções vitais do pigmento epitelial da retina (RPE) células, a fagocitose de fragmentos distais envelhecido gasto de segmentos externos de fotorreceptores (POS) pode ser realizado in vitro. Fotorreceptoras segmentos externos com pilhas de discos membranosos que contêm as máquinas phototransduction é continuamente renovado na retina. Passado POS são eliminados diariamente por células RPE. Roedor, suíno / bovino e células RPE humanas reconhecem POS a partir de várias espécies de um modo semelhante. Para facilitar a realização de uma grande série de experiências com pouca variabilidade, um grande stock de POS podem ser isolados a partir de olhos de porcos e armazenado congelado em alíquotas. Este protocolo tira proveito da característica de photopigments que exibem uma cor laranja quando mantidos no escuro. Sob a luz vermelha ofuscante, retinae são coletados em um buffer de viseiras abertas cortadas em metades. A suspensão de células da retina é homogeneizada, filtrada e carregado num gradiente de sacarose contínuo. Após centrifugation, POS estão localizados em uma banda discreta na parte superior do gradiente que tem uma cor laranja característica. POS são então recolhidas, centrifugadas, ressuspensas em tampões de lavagem sequencialmente, contadas e aliquotadas. POS obtidos deste modo podem ser utilizadas para ensaios de fagocitose e análise de activação da proteína, localização ou interacção em vários momentos após o desafio POS. Alternativamente, POS podem ser marcados com fluoróforos, e. G., FITC, antes de alíquotas para posterior quantificação de fluorescência de ligação de POS ou imersão. Outras aplicações possíveis incluem o uso de POS ou POS desafio modificado combinado com condições de estresse para estudar o efeito do estresse oxidativo ou envelhecimento sobre células RPE.

A combinação do gradiente linear de sacarose e a ultracentrifugação permite a separação dos diferentes componentes da suspensão da retina por densidade. As células de RPE e detritos pesados ​​maior da retina para afundar ou perto do fundo do gradiente (Figura 2A). Isqueiro POS e células mais leves individuais ou detritos celulares a partir da retina migram como bandas distintas para alcançar o topo da metade do gradiente até ao final do período de centrifugação. Ao manter os olhos e as...

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Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 &#176;C.

Grande Escala da Purificação de suínos ou bovinos fotorreceptores Outer Segmentos para a fagocitose Ensaios sobre Retinal Pigment células epiteliais

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

large-scale-purification-porcine-or-bovine-photoreceptor-outer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K visualizações.  INSERM, U968. This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 °C.

Vídeo: Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Aplicação de um rato ligado patch Peyer Assay alça intestinal para avaliar absorção pelas células bacterianas M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

O isolamento de células dendríticas mielóides e células epiteliais de timo humano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

High Yield purificação<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoítos Para uso em opsonizantes Anticorpo Ensaios

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

Isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo murino

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Macrófago Colesterol Exaustão e seu efeito sobre a fagocitose de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles (MPs) are one such type of vesicles, ranging in diameter from 0.1 &#956;m to 1 &#956;m, and typically shed from the plasma membrane of eukaryotic cells undergoing activation or apoptosis. Here we describe the generation of T lymphocyte&#8211;derived microparticles (LMPs) from apoptotic CEM T cells stimulated with actinomycin D. LMPs are isolated through a multistep differential centrifugation process and characterized using flow cytometry. This protocol also presents an in situ cell death detection method for demonstrating the proapoptotic effect of LMPs on bronchial epithelial cells derived from mouse primary respiratory bronchial tissue explants. Methods described herein provide a reproducible procedure for isolating abundant quantities of LMPs from apoptotic lymphocytes in vitro. LMPs derived in this manner can be used to evaluate the characteristics of various disease models, and for pharmacology and toxicology testing. Given that the airway epithelium offers a protective physical and functional barrier between the external environment and underlying tissue, use of bronchial tissue explants rather than immortalized epithelial cell lines provides an effective model for investigations requiring airway tract tissue.

Cell membrane&#8211;shed microparticles (MPs) are active biological vesicles that can be isolated and their pathophysiological effects investigated in various models. Here we describe a method for generating MPs derived from T lymphocytes (LMPs) and for demonstrating their proapoptotic effect on airway epithelial cells.

Geração de Lymphocytic micropartículas e Detecção de seu efeito pró-apoptóticos em células epiteliais das vias aéreas

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

Legionella pneumophila Outer Membrane vesículas: Isolamento e Análise do seu potencial pró-inflamatórios em macrófagos

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and inflammatory intractable diseases. We herein developed an experimental method to investigate phagocytosis quantitatively using the fruit fly Drosophila, in which the gene network controlling engulfment reactions is evolutionally conserved from mammals. In order to accurately detect and count engulfing and un-engulfing phagocytes using whole animals, Drosophila embryos were homogenized to obtain dispersed cells including phagocytes and apoptotic cells. The use of dispersed embryonic cells enables us to measure in vivo phagocytosis levels as if we performed an in vitro phagocytosis assay in which it is possible to observe all phagocytes and apoptotic cells in whole embryos and precisely quantify the level of phagocytosis. We confirmed that this method reproduces those of previous studies that identified the genes required for the phagocytosis of apoptotic cells. This method allows the engulfment of dead cells to be analyzed, and when combined with the powerful genetics of Drosophila, will reveal the complex phagocytic reactions comprised of the migration, recognition, engulfment, and degradation of apoptotic cells by phagocytes.

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

We herein describe a phagocytosis assay using the dispersed embryonic cells of Drosophila. It enables us to easily and precisely quantify in vivo phagocytosis levels, and to identify new molecules required for the phagocytosis of apoptotic cells.

Ensaio de fagocitose para células apoptóticas em Drosophila Embriões

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

Ensaios baseados em fluxo laminar para investigar o recrutamento de leucócitos em culturas de células vasculares e plaquetas aderentes

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to restore function of glands damaged by radiation therapies or due to pathologies associated with Sj&#246;gren's syndrome. A second goal of researchers is to define the mechanisms by which viruses replicate within glandular tissue where they can then gain access to salivary fluids important for horizontal transmission. These goals highlight the need for a robust and accessible in vitro salivary gland model that can be utilized by researchers interested in the above mentioned as well as related research areas. Here we discuss a simple protocol to isolate epithelial cells from human salivary glands and propagate them in vitro. Our protocol can be further optimized to meet the needs of individual studies. Briefly, salivary tissue is mechanically and enzymatically separated to isolate single cells or small clusters of cells. Selection for epithelial cells occurs by plating onto a basement membrane matrix in the presence of media optimized to promote epithelial cell growth. These resulting cultures can be maintained as three-dimensional clusters, termed "salispheres", or grown as a monolayer on treated plastic tissue culture dishes. This protocol results in the outgrowth of a heterogenous population of mainly epithelial cells that can be propagated for 5-8 passages (15-20 population doublings) before undergoing cellular senescence.

We present a method for isolating and cultivating primary human salivary gland-derived epithelial cells. These cells exhibit gene expression patterns consistent with them being of salivary epithelial origin and can be grown as salispheres on basement membrane matrices derived from Engelbreth-Holm-Swarm tumor cells or as monolayers on treated culture dishes.

Isolação de pilhas epithelial salivares das glândulas salivares humanas para o crescimento in vitro como Salispheres ou monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...