We thank Elisha Wood-Charlson, Jackie Mueller, Karen Weynberg, and Kathy Morrow for their help and constructive input on this manuscript. We also thank the crew and captain of the Hanse explorer which provided us with a perfect working environment to conduct large parts of this research. Further we would like to thank the three anonymous reviewers for their time and helpful comments to improve the manuscript. This work was funded by the NSF Dimensions of Biodiversity and PIRE awards DEB-1046413 and OISE/IIA-1243541, respectively, the Gordon and Betty Moore Foundation, Investigator Award 3781, and the CIFAR Integrated Microbial Diversity Fellowship IMB-ROHW-141679, all to FR.

The authors have nothing to disclose.

Os métodos apresentados aqui vai fornecer uma ferramenta para gerar uma avaliação abrangente da dinâmica viral e microbianas em ecossistemas aquáticos. Eles são direcionados para quantificar o estoque de pé de recursos orgânicos e inorgânicos disponíveis para comunidades microbianas e caracterizar a composição da atual comunidade viral e microbiana. Ao lado de quantificação viral abundância ea abundância e biomassa microbiana, informações seqüência genômica revela sua estrutura e função da comunidade. Todos os métodos têm sido desenvolvidos ou modificados para permitir a aplicação de campo em locais remotos. No entanto, a falta de definições controladas de laboratório inerentemente cria algum potencial para erros. Aqui vamos discutir algumas ressalvas associadas a cada um dos parâmetros avaliados. Próximo ao potencial de contaminação durante a manipulação de amostra alguns dos parâmetros também produzir potencial de erro no processo analítico. Carbono Orgânico Dissolvido Carbono contaminação pode ocorrer durante os procedimentos de amostragem (amostragem a jusante, ou na vizinhança de um barco ou um mergulhador), durante a preparação da amostra (a contaminação do equipamento ou manipulação inadvertida), e, mesmo durante o armazenamento da amostra (no congelador outras amostras contendo orgânica Os solventes voláteis /). Para evitar as diversas fontes de contaminação conduta como alguns passos de manuseio quanto possível, uma vez que cada deslocalização amostra representa uma fonte adicional de contaminação. A amostra não deve entrar em contato com qualquer item não ácido lavado ou queimado. Finalmente, designa um congelador de armazenamento exclusivamente para amostras que não contenham substâncias orgânicas voláteis vai garantir a integridade das amostras durante os períodos de armazenagem mais longos. Se as amostras não pode ser mantido congelado durante um período prolongado de viagens de amostras DOC acidificação com HCl concentrado (como descrito 38-41) pode ser uma alternativa aplicável. Para verificar a precisão da medição materiais de referência consenso DOC deve ser usado regcularmente durante a medição DOC é executado. Especialmente água do mar profundo (&gt; 2000 m) referências são importantes na avaliação do desempenho da máquina analítica, pois é muito estável em seu conteúdo DOC 42. Matéria orgânica particulada Além de evitar a contaminação de carbono orgânico, a amostragem POM requer uma atenção especial para garantir a precisão do volume filtrado. Se o volume de 500 ml orientada deve desviar-se por qualquer motivo, este potencial deve ser anotado para relacionar a quantidade de POM capturado no filtro para o filtrado da qual foi derivada. Nutrientes inorgânicos Tal como acontece com a amostragem de carbono orgânico, deve ser dada atenção à possível contaminação da amostra de nutrientes gerados por várias fontes, como barcos ou descargas de águas residuais 12. Filtros usados ​​para a amostragem de carbono orgânico com um tamanho de poros nominais de 0,8 mm, não podem excluir toda a biomassa microbiana e shodia, por conseguinte, ser alterado para filtros de 0,2 um para este passo de filtração. Além disso, os limites de detecção constituem um problema com as amostras de nutrientes; especialmente na água de superfície oligotrófico em torno de muitos locais de recifes de coral (por exemplo, Cotner et al. 43). Os limites de detecção são mais ou menos em torno de 0,1, 0,2, e 0,1 mmol / L para o de amónio, nitrato e nitrito, e orto-fosfato, respectivamente (ver 36,12,37) Microscopia Ao lado de variações na concentração de análise de imagem a partir de amostras de lâminas de microscopia, permite maior potencial de erros. Por exemplo, as imagens podem ficar fora de foco em algumas áreas do campo de visão, e no foco em outros. Como um elevado grau de pureza do filtro matriz de alumina é um tipo de filtro muito rígida, quaisquer detritos sob o filtro pode fazer com que todo o filtro para se sentar em um ângulo para a corrediça. Como resultado, as imagens podem ser consistentemente fora de foco em várias partes do campo de visão para um dado filtro, reindependente- de alinhamento microscópio. Remontagem filtros, assegurando o lado de baixo do filtro está limpo, pode melhorar esta se for observada. Além disso, em alguns casos, pode haver dois planos focais em que os vírus e micróbios podem ser encontrados. Este é o resultado de se tornarem manchadas objectos separado do filtro quando da montagem, e que flutuam até à parte de baixo da lâmina de cobertura que pode tornar as contagens não confiável. Por isso recomenda-se sempre de verificar a qualidade das amostras durante o processo. Citometria de Fluxo Tal como acontece com as amostras de microscopia, pode haver diferenças entre amostras de citometria de fluxo, que exigem ajustamentos do processo analítico que ocorre naturalmente. Por exemplo, dependendo da sensibilidade do instrumento, fracamente as células fluorescentes Prochlorococcus pode ser inferior ao nível de ruído e não irá ser quantificada. Grânulos servir como uma amostra de controlo interno (por exemplo, para confirmar que resp do instrumentoonse de sinais fluorescentes é consistente do dia a dia (e permanece estável durante a própria corrida). Se adicionado à amostra em concentrações conhecidas, que também pode servir como um controlo interno para verificar o volume da amostra de execução. No entanto, recomenda-se rodar sempre uma alíquota de um &quot;padrão&quot; de amostra de água do mar previamente congelada que é descongelada e coradas juntamente com as amostras de interesse para proporcionar um controle biológico adicional para manipulação de amostra entre 96 poços é executado placa. Dependendo da localização, as amostras de água do mar pode parecer muito diferente uma da outra. Classificando populações &quot;representativas&quot; e, em seguida, visualização sob um microscópio de epifluorescência (EM) pode ser uma boa maneira de verificar rapidamente as populações de fitoplâncton como quer Synechococcus sp. Ou eucariotas fotossintéticos. Prochlorococcus células geralmente não são visíveis sob EM porque eles desaparecem muito rápido. Além de clorofila a, Synechococcus sp., Também contêm o phphycoeurythrin otopigment (PE), que emite luz em comprimentos de onda mais curtos (540-630 nm) do que a clorofila A (660-700 nm). Quando as células Synechococcus são excitados com luz azul / verde (470-490 nm), eles vão aparecer de ouro, se visto sob um filtro de emissão que remove todos os comprimentos de onda de luz abaixo de 510 nm. Por comparação, a fracção eucariótica vai ficar vermelha, quando excitado com o mesmo comprimento de onda da luz. Metagenomics virais É importante notar que o processo de armazenamento e concentração de VLP influencia a comunidade recuperado. Perda de partículas virais podem ocorrer em todos os passos do processo, e, assim, a selecção de protocolos de purificação e de enriquecimento virais podem em última análise afectar a composição taxonômica observada e diversidade dos metagenomes virais resultantes 44,45,18. A concentração das amostras pode ser feita utilizando TFF 19 ou 20 à base de floculação química. Na abordagem baseada em química, posittivamente carregado iões de ferro ligar as partículas virais naturalmente carregados negativamente que formam grandes (&gt; 8 mm) complexos de ferro-viral que floculam para fora da solução e pode ser recuperado utilizando filtros de 8 pm. Subsequentemente, o ferro é quelado fora das partículas virais e re-dissolvido através de magnésio, ácido ascórbico, e EDTA, deixando partículas virais concentrados para a extracção de ácido nucleico 20. Depois de comparar estes dois métodos atuais, concluímos que o método de cloreto de ferro é menos demorado do que a concentração viral TFF, mas pode render algumas ressalvas. Descobrimos que a dissociação e a dissolução do ferro-viral requer um duplo solução mais concentrada de magnésio-ácido ascórbico-EDTA 20 do que o relatado para a dissolução, a fim de proceder antes degrada os ácidos ascórbico. Além deste problema, o protocolo purifica partículas virais de fraccionamento por tamanho por si só, a remoção de contaminantes microbianos usando filtração de 0,2 um. Vírus grandes não passam através do filter (por exemplo, Yang et al. 46) e, portanto, não vai ser detectado, no metagenome, enquanto que algumas bactérias fazer (McDole, dados não publicados). Isso resulta em contaminação bacteriana ao discriminar contra vírus grandes. Esse problema específico no entanto, também é relevante para a remoção de micróbios em ligação com a concentração de TFF. Como o tratamento de clorofórmio foi mostrado para remover vírus sensível ao clorofórmio com membranas lipídicas externas 47 alguns estudos sugerem que 0,22 um de filtração pode ser utilizada para remover a maioria de bactérias. Também deve ser notado que o método apresentado tem como alvo principalmente bacteriófago, o transportador mais abundante de material genético em ambientes marinhos. Porque fagos são geralmente pensados ​​para não contêm comumente lipídios 48 eles são mais resistentes ao tratamento clorofórmio. Para o nosso conhecimento de um método &quot;catch-all&quot; não existe até o momento. O método aqui apresentado é uma adaptação da UOexperiência de campo r ao longo dos últimos 10 anos em vários ambientes marinhos medem tropical para sistemas árticas. Microbial Metagenomics A construção de bibliotecas metagenomic de micróbios (por exemplo, bactérias e archaea) é mais simples do que metagenomes virais, uma vez que é mais fácil de gerar as concentrações mínimas de ADN necessárias para a preparação da biblioteca. Amplificação espingarda bibliotecas Linker (LASLs) amplificação 17,49,50 e todo o genoma com base em múltiplos de amplificação de deslocamento (MDA) são os dois métodos mais comumente usados ​​para gerar DNA suficiente para o seqüenciamento. O uso de MDA para obter concentrações mais elevadas de ADN em metagenomes microbianas é por vezes necessário. Este, porém, pode causar artefatos nos dados de seqüência, como a overamplification de minicírculos de dinoflagelados. MDA são conhecidos métodos para amplificar preferencialmente ADN de cadeia simples e circular, resultando em resultados não-quantitativos 51,52. Os LASLs otimizados aproximar 50 pode, assim, serve como uma alternativa melhor na amplificação tanto microbiana e DNA viral metagenômica para o seqüenciamento. É importante notar que a abordagem LASLs tem múltiplos passos, requer equipamento sofisticado, e está limitado aos modelos de dsDNA. Além disso, o estojo de extracção de ADN de tecidos tem sido mostrado para extrair DNA de ambos filos negativo Gram positivas e Gram, mas não foi verificada a taxa microbiana lisar eficazmente recalcitrante ou suas estruturas associadas (por exemplo, certos archaea, endosporos, ou esporos de fungos) . Por conseguinte, pode ser necessário um passo de batimento talão para obter o DNA de certos micróbios. Estas avaliações abrangentes resultará em uma melhor compreensão do funcionamento dos ecossistemas viral e microbiana. Embora poucos estudos têm empreendido um esforço para avaliar todos os parâmetros propostos, muitos têm vindo a investigar os selecionados. Nelson et al. 53 sugeriram uma ligação entreen habitats de recife específico e esgotamento em ambas as concentrações de DOC e bacterioplâncton relativos às águas offshore. Essas mudanças de concentração foram acompanhadas por diferenciações distintos de bacterioplâncton. Dinsdale et al. 5 mostraram que o aumento impacto antropogénico foi acompanhada por 10x maior abundância de células microbianas e partículas semelhantes a vírus. Comunidades microbianas em águas marinhas vizinhas ilhas habitadas também teve frações maiores de heterotróficos e potenciais patógenos 5. Finalmente McDole et al. 4 mostraram, ao introduzir a pontuação microbialization, que as atividades humanas estão mudando energia para os micróbios, em detrimento dos macróbios. Estes estudos, com foco em parâmetros microbiológicos e químicos da água específicos, fornecer novos insights sobre a estrutura bioquímica dos ecossistemas marinhos. Combinando dados tradicionais de esforços de monitoramento de ecossistemas - como valores de temperatura e pH, biomassa de peixes e diversity, cobertura bentônica, ou exposição ao impacto humano - com a química da água e avaliações microbianas, provavelmente resultará em mais sensíveis esforços de monitoramento ambiental, o que pode levar a esforços de conservação, mais especificamente direcionados.

Os ecossistemas marinhos são submetidas a uma ampla gama de perturbações que resultam em alterações de disponibilidade de nutrientes para a biomassa de predadores. Durante a última década, vários estudos têm demonstrado a importância das comunidades microbianas em ecossistemas marinhos 1-4. É evidente que as alterações na comunidade bacteriana e viral estão intimamente associados com a degradação global dos ambientes marinhos 5. Estas alterações podem ser facilitada por geochemistry alterada na coluna de água, tais como a disponibilidade de oxigénio ou de carbono remineralização 6,7. Como resultado da interdependência entre o macroorganismos, química da água e loops de feedback atividade microbiana pode acelerar a taxa de degradação dos ecossistemas 8. Nos anos 1970 e 80, várias tentativas foram feitas para desvendar os ciclos biogeoquímicos em ecossistemas marinhos 11/09. Um dos principais desafios para estes estudos iniciais foi a faltade abordagens padronizadas para medir os parâmetros biogeoquímicos avaliados. Embora houvesse protocolos disponíveis, principalmente sobre os nutrientes da água do mar 12,13, a avaliação da dinâmica de carbono e estrutura da comunidade microbiana foram limitados pelas ferramentas e métodos disponíveis. Com o JGOFS EqPac comparação métodos, a Sharp et al., 14 sugeriram pela primeira vez um protocolo fiável e normalizado para as avaliações (DOC) de concentração de carbono orgânico dissolvido. Até o início da década de 2000 os desafios analíticos para determinar os recursos disponíveis para a comunidade microbiana tinha, assim, em grande parte resolvidos e abordagens para caracterizar comunidades microbianas em ambientes controlados cultura tinha sido estabelecida (ver DeLong 15). Os métodos de sequenciamento tradicionais na época em grande parte se baseou em culturas clonais cultivadas. Seqüenciamento do gene ambiental precoce de amostras naturais revelou, no entanto, que a maior parte da biodiversidade microbiana tinha sido perdida por cultivmétodos baseados em ation 16. Em 2002, Breitbart et al., 17 utilizadas shotgun de sequenciação pela primeira vez para descrever a comunidade viral em amostras de água do mar ambientais que estabelecem um método para sequenciar o genoma inteiro de comunidades virais marinhos não cultivadas. Dentro das avaliações microbianas existentes, os vírus ainda continua a ser particularmente estudado, como a maioria são difíceis de cultura e que falta um marcador universalmente conservado como o 16S RNA ribossomal (rRNA) genes normalmente utilizados para avaliar a diversidade de perfis e comunidades. A abordagem metagenômica sequenciamento fornece uma alternativa aos métodos dependentes de cultura e alvo de genes para analisar comunidades virais complexas. Enquanto os primeiros metagenomes virais geradas a partir de água do mar foram sequenciados utilizando sequenciamento Sanger 17, o desenvolvimento de tecnologias de sequenciamento de última geração e técnicas moleculares melhoria levou a um rápido aumento em estudos metagenomic 18 </sacima&gt;. O fluxo de trabalho laboratorial corrente para metagenomics virais envolve a separação, o enriquecimento, e / ou a concentração de partículas virais, seguido de ácido nucleico (DNA ou RNA) extracção, a preparação da biblioteca, e sequenciação de 19-21. Para aprofundar o conhecimento existente sobre viral, bacteriana e funcionamento bioquímico em ecossistemas aquáticos, comparando conjuntos de dados em vários sistemas ao redor do mundo é essencial. No entanto, os protocolos estabelecidos têm sido largamente desenvolvido para ambientes costeiros com instalações laboratoriais acessíveis. Assim, a falta de métodos de campo padronizados dificulta as comparações entre estes ecossistemas. Aqui apresentamos exaustivamente testado e adaptações de estado dos protocolos de pesquisa de arte bem padronizado para uso em locais de campo remotas. Esses métodos foram provados com sucesso em vários estudos que medem a última década, 5,22 e são usadas atualmente por vários laboratórios marinhos, bem como sobre a NOAAAvaliação Reef e Programa de Monitoramento (RAMP) ao longo do Oceano Pacífico 4. Os protocolos de amostragem incluem parâmetros da água química (concentrações de carbono inorgânico e orgânico, concentração de nutrientes inorgânicos), abundância viral e microbiana (contagem bacteriana direta, contagem viral diretos, e citometria de fluxo para avaliar autotroph vs índices de Heterotroph) e estrutura da comunidade microbiana e viral e potencial metabólico através da análise metagenômica (para uma visão geral veja a Figura 1). Os resultados obtidos a partir dos métodos descritos aqui são necessárias a fim de elucidar principais parâmetros bioquímicos fundo necessários para caracterizar exaustivamente ecossistemas aquáticos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1307">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:217px;">Company</td>
			<td style="width:149px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:325px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Niskin collection and processing units (Hatay Niskins)</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filtration setup&#160;</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">32 &#8211; 36 % Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>A508-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">High-density polyethylene (HDPE) container</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>e.g., 5 Gallon HDPE UN Certified Pail with Snap-On Lid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Combustion oven (550&#176; C)</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 ml HDPE vials&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">02-896-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">25 mm GF/F filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>09-874-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>XX62-000-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile, non-powdered gloves</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">19-170-010B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bilge pump&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>e.g., Thirsty Mate 124PF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 l collapsible low-density polyethylene carboy&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>e.g., Reliance Fold A Carrier II</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tangential flow filter (TFF) ultrafiltration hollow fiber cartridges</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>CFP-2-E-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Platinum-cured silicon tubing for TFF</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>96440-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hose clamps</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>P-68007-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Peristaltic pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-77410-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide (NaOH) solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 &#181;m polycarbonate Track-Etched Membrane filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>09-300-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8.0 &#181;m polycarbonate Track-Etched Membrane filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>09-300-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.22 &#181;m polyvinylidene difluoride cylindrical filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45 &#181;m polyvinylidene difluoride cylindrical filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>SVHV010RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synthetic nylon mesh</td>
			<td>Sefar</td>
			<td>03-125-37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 ml plastic scintillation bottle&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>03-341-72C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clean bucket (10 - 20 L)</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">32 % paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25 % glutaraldehyde</td>
			<td style="width:217px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.02 &#181;m high-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>6809-6002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 &#181;m&#160; high-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>6809-6022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10,000 X SYBR Gold nucleic acid stain&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">DAPI solution 25 &#181;g ml-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular grade water</td>
			<td>sigma aldrich</td>
			<td>W-4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ascorbic Acid</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>BP351-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP399-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>G31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope slide</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>12-550-123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslip</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Delicate task wipe&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slide Station with vacuum pump</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">DNA extraction kit</td>
			<td style="width:217px;">Macherey-Nagel</td>
			<td>740952.1</td>
			<td>Nucleospin tissue kit</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Proteinase K (20 mg ml-1)</td>
			<td style="width:217px;">Lifetechnologies</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200-proof 100% Ethanol</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Red cap: Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45503-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cesium chloride (CsCl)</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>bp1595-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 ml syringe</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>13-6898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.02 &#181;m alumina matrix disposable syringe filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>O992613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">Ultra-clear centrifuge tubes</td>
			<td style="width:217px;">Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra - swinging bucket rotor</td>
			<td style="width:217px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:149px;">333790</td>
			<td>SW41 Ti Rotor&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">DNase I (100 u &#181;l-1)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>260913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EDTA</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP2482-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP228-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycogen</td>
			<td style="width:217px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:149px;">G-1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 % Ethanol (200-proof)</td>
			<td style="width:217px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:149px;">15058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 X Tris-EDTA (TE) pH 8.0</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP2473-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">02674-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">20 &#956;g ml-1 Proteinase K</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP1700-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP1145-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1</td>
			<td style="width:217px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:149px;">p3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP2618-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">50ml Oak Ridge Tube&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">05-562-16B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unraveling the unseen players in the ocean - a field guide to water chemistry and marine microbiology

Aqui apresentamos uma série de protocolos de pesquisa cuidadosamente testados e bem padronizados, adaptados para o uso em ambientes marinhos remotos. Os protocolos de amostragem incluem a avaliação dos recursos disponíveis para a comunidade microbiana (carbono orgânico dissolvido, matéria orgânica particulada, nutrientes inorgânicos), e uma descrição abrangente das comunidades virais e bacterianas (via contagem viral e microbianas diretos, enumeração de micróbios autofluorescentes, e construção de metagenomes virais e microbianos). Usamos uma combinação de métodos, que representam um campo disperso de disciplinas científicas que incluem protocolos já estabelecidos e algumas das técnicas mais recentes desenvolvidas. Técnicas de sequenciamento especialmente metagenomic utilizados para a caracterização da comunidade virais e bacterianas, só foram estabelecidas nos últimos anos, e são, portanto, ainda sujeita a constante melhoria. Isto levou a uma variedade de procedimentos de amostragem e processamento de amostras currently em uso. O conjunto de métodos apresentado aqui fornece uma abordagem até data para coletar e processar amostras ambientais. Parâmetros abordados com estes protocolos produzir o mínimo de informação essencial para caracterizar e compreender os mecanismos subjacentes da dinâmica da comunidade virais e microbianas. Dá fácil de seguir as orientações para a realização de pesquisas abrangentes e discute etapas críticas e possíveis ressalvas pertinentes a cada técnica.

Microscopia Amostras de microscopia pode e deve ser analisado imediatamente para garantir que eles tenham a qualidade desejada. Para medir a abundância ea distribuição de tamanho da comunidade bacteriana, lâminas DAPI será examinado por microscopia de epifluorescência (excitação / emissão: 358/461 nm, ver McDole et al 2012). (Figura 6A). Contagem de células e dimensões podem ser coletados por meio de software de imagem (por exemplo, ImagePro ou ImageJ). A partir de volumes de células medidas de comprimento e largura (V) são derivadas, fazendo a suposição de que todas as células têm a forma de cilindros com as tampas hemisféricas, utilizando a seguinte equação: V = π / 4 × 2 w (L - w / 3) onde L é o comprimento e w é a largura de cada célula 23,4. A biomassa microbiana pode ser estimada utilizando relações dependentes de tamanho previamente estabelecidos for comunidades microbianas marinhas 24. Geralmente bactérias marinhas variam em comprimento 0,1-4 mm, mas ir até ~ 8 mm em alguns locais. Enquanto os filtros (0,2 um) corados com DAPI só irá mostrar as bactérias, os filtros utilizados para a mancha SYBR Gold (0,02 mm) contêm bactérias e vírus. Medindo a abundância de vírus segue o mesmo protocolo como para micróbios, no entanto uma excitação de 325-375 nm vai ser utilizado e o máximo de emissão é de 537 nm (Figura 6B). A fim de gerar dados quantitativa do volume de amostragem pode necessitar de ser ajustado dependendo da abundância viral na amostra original. O volume correto para filtrar é melhor determinado empiricamente para uma dada massa de água. Exemplos de micrografias contendo amostras com diferentes concentrações de vírus encontram-se ilustrados na Figura 7. Os resultados de estudos anteriores sugerem que vírus para Microberatios (VMR) variam geralmente de 1 a 50 em sistemas aquáticos 25-29, e entre 3 e 20, com uma média de cerca de 6 em sistemas de recifes de coral (Knowles dados não publicados). Citometria de Fluxo Além das contagens directas e tamanho estimativa da comunidade microbiana, as avaliações da proporção de autotrófico para micróbios heterotróficas através de citometria de fluxo pode ainda ser extraídos a partir das amostras recolhidas (citometria de fluxo exemplar de saída dada na Figura 8). Para determinar o número de células totais das bactérias, as amostras foram coradas com SYBR Green I e um tubo fotomultiplicador com um filtro de passagem de banda 530/30 é usado para a detecção. Um canal de clorofila (LP volta para espelhos de volta, resultando numa gama de 675-735 nm) e (filtro de passagem de banda 585/42) ficoeriterina é usado para contar a abundância de autotróficos em amostras não coradas. Para determinar a abundância de micróbios heterotróficas, as contagens autotróficas da não-manchado porção são então subtraída a contagem total de SYBR-corados (McDole et al., submetido). Metagenomics virais Metagenômica Viral utiliza uma abordagem molecular independente de cultura com a ecologia viral, utilizando as informações total de seqüência genômica para determinar a estrutura e função da comunidade. Metagenômica vem avançando a nossa compreensão da complexidade e diversidade das comunidades virais a nível local 17 a 30 escalas globais. O recente desenvolvimento de uma ampla gama de ferramentas de bioinformática para análise de dados metagenomic virais diminuiu gargalos computacionais, permitindo uma visão mais abrangente da do virosphere através da lente da metagenômica. Os métodos apresentados aqui realçar o isolamento e enriquecimento de partículas virais a partir de água do mar utilizando uma combinação de pré-filtração com o grande tamanho dos poros da malha de nylon para remover os detritos e material celular, concentração deamostras com TFF (Figura 3) e uma subsequente filtração de 0,45 um para remover as células maiores. Este método produz cerca de um 100x amostra concentrada (Figuras 5B-5E), que nos permite realizar processos a jusante em volumes menores. A fim de evitar o crescimento de quaisquer células microbianas que permanecem no lisado viral e, por conseguinte, muda na abundância viral da amostra durante o longo tempo de trânsito entre a estação de campo e no laboratório, clorofórmio é frequentemente adicionado a uma concentração final de 2% para armazenamento. Após isolamento e purificação de partículas VLP, microscopia de epifluorescência com corantes ácidos nucleicos, tais como SYBR ouro são usados ​​para verificar a presença e pureza das partículas virais (Figuras 5B-5E). Aqui, apresentamos dois metagenomes virais do recife de coral do Sul Linha Island, especificamente, a Starbuck (STAR7) e Millennium (CAR9; anteriormente conhecido como Caroline) ilhas. Um volume total de 120 L sample água foi coletada de cada local, a uma profundidade de 10 metros e processados ​​como descrito na seção 3.7 e 5.2. As VLP purificadas a partir da centrifugação em gradiente de cloreto de césio foram 3,3 x 10 8 de partículas / ml para CAR9 (Figura 5D) e de 2,9 x 10 9 por ml para partículas STAR7 como foi verificado de acordo com o método descrito no ponto 4 (Figura 5B). A quantidade total de DNA isolado a partir destas amostras foram de cerca de 400 ng, com base na medição Nanodrop. O DNA foi amplificado utilizando polimerase phi29 e sequenciados pela facilidade Ambiental Genomics núcleo em 2011. As características da sequência de dados é apresentada na Tabela 1. Com base em pesquisas de similaridade utilizando bases de dados existentes, a maioria (&gt; 70%) das sequências frequentemente terminou descaracterizados, ou seja, origens e funções desconhecidas. Do mesmo modo, as duas viromes aqui apresentados apresentaram mais de 97% das sequências desconhecidas. Como resultado, não banco de dadosanálise dependente foi utilizado para análise e abriu um novo braço de oportunidade de pesquisa sobre a &quot;matéria escura&quot; em metagenômica virais (Seguritan et al. no prelo). Microbial Metagenomics A análise dos metagenomes microbianas permite a caracterização da comunidade microbiana presente ea descrição funcional destas comunidades. Exemplos incluem estimativas da presença de patógenos e virulência 5,22 ou comparações entre as mudanças na estrutura da comunidade microbiana ou nutrientes disponíveis e abundância de espécies e suas vias metabólicas predominantes (Figura 9; Kelly et al 2014).. Química da Água Parâmetros de química da água em geral, tem extensa processamento analítico para gerar os dados desejados; As amostras para análise do COD vai ser medido através de alta temperatura de oxidação catalítica 31,32, matéria orgânica particulada (POM), através de espectrometria de massa de razão isotópica acoplado a um analisador elementar 33-35 e nutrientes inorgânicos pela Flow Injection Analysis 36,12,37. Após a conclusão bem sucedida de todas as análises, informação como mostrado na Tabela 1 irá estar disponível para complementar a caracterização da comunidades microbianas e virais. Esta informação pode ser complementada com proporções de isótopos estáveis ​​de carbono e nitrogênio amostras orgânicas (Veja Haas et al. 35) e relações entre autótrofos e heterótrofos (McDole et al. Submetido). <img alt="A Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. Visão geral dos métodos descritos na seção de protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figu</a>re. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig2highres.jpg" /> Figura 2. Exemplo de configuração do processamento de equipamento. A configuração de filtragem introduzido aqui (desenho esquemático esquerda, quadro painel direito real) não é necessariamente obrigatório para gerar amostras, mas vai acelerar o processo de forma significativa. A instalação é constituída por uma placa de apoio, em que as unidades de Hatay Niskin (1) estão montados. Na saída virada para baixo, as unidades de Hatay Niskin estão ligados com tubagem de silicone para os filtros de suportes (2) em-linha. Estes permitem a passagem de água amostrada através do respectivo filtro para os frascos de amostragem HDPE (3) montada logo abaixo. O processo de filtração é acelerada por meio de ar pressurizado (4), e que regulado por um indicador de pressão (5). Uma doca de expansão impede derramar água durante a troca dos frascos de PEAD ou filtração POM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor,</a>clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig3highres.jpg" /> Água amostra Figura 3. programação filtro de fluxo tangencial (modificado a partir do Thurber et al. 19). Filtrou-se com tela de nylon é bombeado a partir do reservatório (1) através de uma bomba peristáltica (2) a um filtro de fluxo tangencial (3). As amostras de água retorna para o reservatório (1) ao longo da linha de retorno (4), na ausência de pressão de retorno. Quando a pressão de retorno é aplicada através de uma braçadeira de mangueira (5) na linha de retorno, a água passa através do filtro e é descartado ou entregues ao reservatório filtrado (6). Amostra de água é substituído como está concentrada a linha filtrado até toda a água da amostra é concentrado nas linhas de tubagem. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig4highres.jpg" /> 4. Microscópio Figura configuração filtração slide.Para distribuir uniformemente DAPI e SYBR ouro amostras coradas sobre o respectivo filtro de matriz de alumina (1), os filtros necessitam de ser colocado entre a torre de filtro (2) e da haste do colector de filtração e fixada com um grampo (4). Um vácuo regulado de pressão (5) vai acelerar o processo de filtração (top desenho esquemático, painel de fundo a fotografia original). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig5highres.jpg" /> Figura 5. A purificação e concentração de partículas de fago. Um total de 1 ml de cada gradiente de densidade de cloreto de césio é mergulhado em cima uns dos outros antes de levando a amostra pré-tratada (A). Cada camada deve ser marcada no exterior do tubo para facilitar a extracção após ultracentrifugação. Marcas de seta vermelha onde o tubo será perfurada para extrato a fracção de VLP. (BE) Micrografias de concentrados virais: micrografias de epifluorescência 0,45 concentrados virais representativos micrometros de filtrados de STAR7 (B) e CAR9 (D). As grandes partículas, incluindo as células bacterianas eram visíveis a partir dos 0,45 mm a partir de ambos os filtrados-STAR7 (B) e (D) CAR9 amostras, enquanto que apenas as VLP (setas brancas) permanecem após ultracentrifugação de gradiente de cloreto de césio; Estrela 7 (C) e CAR9 (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig5highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="A Figura 6" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig6highres.jpg" /> Figura 6. Exemplo de DAPI e análise micrografia SYBR Gold. Tela a partir da análise de (A) e DAPI (B) SYBR ouro coradas exemplo corrediça. (A) Comprimento e largura (mm) das partículas em destaque todas(= Micróbios) pode ser avaliada com a ajuda de um programa de imagem. Note-se a agregação no centro da imagem. Estes agrupamentos terão de ser excluídos da análise subseqüente. (B) Durante vírus análise e bactérias precisam ser finalmente resolvido por limiares em VLP e faixas de tamanho celular (VLP vermelho, verde celular). Note-se que normalmente há alguns VLP tênues Sem categoria pelo respectivo programa de imagem. Estes VLP que aparecem como pontos brancos leves devem ser contados e adicionados aos contagem viral automatizados manualmente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig6highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig7highres.jpg" /> Figura 7. Concentrações de SYBR ouro manchado amostras. Micrografias de um filtro de 0,02 matriz de alumina contendo vários números de SYBR manchado amostras de vírus. O painel A mostra afILTER contendo uma quantidade adequada de água do mar filtrada, enquanto que as concentrações no filtro mostrados em B são muito altos e em C muito baixo para a contagem de confiança. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig7highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 8" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig8highres.jpg" width="600" /> Figura 8. Os resultados de citometria de fluxo de saída da análise de uma amostra de recife-água. O painel (A) mostra a água de grau molecular só com microesferas amarelo-verdes fluorescentes (0,75 um), utilizadas para verificar a fundo mínima com as configurações do instrumento. Painel (B) mostra a saída do recife amostra de água correr com configurações idênticas e layout como em A. Note-se que as contas ainda podem ser vistos no mesmo local, junto com várias populações de autótrofos. (C) </strong&gt; A mesma amostra como em (B), usado para fazer-gate o citômetro de fluxo, visando eventos positivos SYBR (autotrófica + contagem de heterotróficos) ea minimização de fundo. (D) A amostra representativa recife-água coradas com SYBR Green I. Usando o gating estabelecido em (C), a contagem total de micróbios foram gerados, e micróbios heterotróficas e autotróficas particionado pela clorofila autofluorescência (ver McDole et al. 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig8highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 9" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig9highres.jpg" width="600" /> Figura 9. Exemplo de dados metagenome microbianas. Padrões entre os dados da seqüência metagenomic microbianas e do site variáveis ​​dependentes. Aqui, a abundância relativa de Synechococcus </em&gt; spp. foi positivamente correlacionada com a tampa por cento do coral, enquanto Pelagibacter spp. não foi (painéis da esquerda). A via metabólica para a transferência conjugative foi positivamente correlacionada com as concentrações de nitrato, enquanto que a via metabólica para o reparo do DNA foi consistente entre todos os metagenomes (painéis à direita). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig9highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Estrela 7 </td><td> CAR9 </td></tr><tr><td> Número total de Lê </td><td> 939.311 </td><td> 591.600 </td></tr><tr><td> Número de pré-processados ​​Lê </td><td> 579.664 </td><td> 360.246 </td></tr><tr><td> A média de Sequence Length (pb) </td><td> 395 ± 131 </td><td> 451 ± 159 </td></tr><tr><td> Sequências anotados (%) </td><td> 42,218 (7,3%) </td&gt; <td> 9117 (2,5%) </td></tr><tr><td> Desconhecido (%) </td><td> 537446 (92,7%) </td><td> 351129 (97,5%) </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Características dos dados de dois viromes gerados a partir das Ilhas da Linha do Sul, Starbuck e Millennium. O grau de anotação é baseada em BLAT usando o servidor MG-RAST. <img alt="Tabela 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52131/52131table2.jpg" width="700" /> Tabela 2. Os resultados representativos mostrando dados de vários locais durante uma expedição. Os parâmetros aqui analisados ​​incluem medições química da água emparelhado com microbiana e abundâncias virais. A tabela contém ainda os nomes dos arquivos referentes aos respectivos dados metagenomic para cada local de amostragem. As concentrações de carbono e nutrientes inorgânicos são dadas em nmol / L. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131table2.jpg" target="_blank">Por favor</a>clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.

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Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.

Desvendando os jogadores invisíveis no Oceano - Um Guia de Campo para Química da Água e Microbiologia Marinha

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling ...

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Research

JoVE Journal

Environment

25.2K visualizações.  San Diego State University. Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments. 

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A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is not an appropriate measure for its availability; bioavailability rather depends on the dynamic interplay of potential mass transfer (flux) of a compound to a microbial cell and the capacity of the latter to degrade the compound. In water-unsaturated parts of the soil, mycelia have been shown to overcome bioavailability limitations by actively transporting and mobilizing organic compounds over the range of centimeters. Whereas the extent of mycelia-based transport can be quantified easily by chemical means, verification of the contaminant-bioavailability to bacterial cells requires a biological method. Addressing this constraint, we chose the PAH fluorene (FLU) as a model compound and developed a water unsaturated model microcosm linking a spatially separated FLU point source and the FLU degrading bioreporter bacterium Burkholderia sartisoli RP037-mChe by a mycelial network of Pythium ultimum. Since the bioreporter expresses eGFP in response of the PAH flux to the cell, bacterial FLU exposure and degradation could be monitored directly in the microcosms via confocal laser scanning microscopy (CLSM). CLSM and image analyses revealed a significant increase of the eGFP expression in the presence of P. ultimum compared to controls without mycelia or FLU thus indicating FLU bioavailability to bacteria after mycelia-mediated transport. CLSM results were supported by chemical analyses in identical microcosms. The developed microcosm proved suitable to investigate contaminant bioavailability and to concomitantly visualize the involved bacteria-mycelial interactions.

A whole cell bioreporter assay with Burkholderia sartisoli RP037-mChe was developed to detect fractions of an organic contaminant (i.e., fluorene) available for bacterial degradation after active transport by mycelia bridging air-filled pores in a water unsaturated model system.

Uma Abordagem Bioreporter celular todo avalie Transportes e biodisponibilidade de contaminantes orgânicos em água insaturadas Sistemas

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is ...

Ambiente

A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with the goal of examining the ecological functions of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. The result has been a progression of protocols that have increasingly refined the ecological relevance of the experimental approach. Here we present the most up-to-date version of a fish-feeding laboratory bioassay that enables investigators to assess the antipredatory activity of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. Organic metabolites of all polarities are exhaustively extracted from the tissue of the target organism and reconstituted at natural concentrations in a nutritionally appropriate food matrix. Experimental food pellets are presented to a generalist predator in laboratory feeding assays to assess the antipredatory activity of the extract. The procedure described herein uses the bluehead, Thalassoma bifasciatum, to test the palatability of Caribbean marine invertebrates; however, the design may be readily adapted to other systems. Results obtained using this laboratory assay are an important prelude to field experiments that rely on the feeding responses of a full complement of potential predators. Additionally, this bioassay can be used to direct the isolation of feeding-deterrent metabolites through bioassay-guided fractionation. This feeding bioassay has advanced our understanding of the factors that control the distribution and abundance of marine invertebrates on Caribbean coral reefs and may inform investigations in diverse fields of inquiry, including pharmacology, biotechnology, and evolutionary ecology.

This bioassay employs a model predatory fish to assess the presence of feeding-deterrent metabolites from organic extracts of the tissues of marine organisms at natural concentrations using a nutritionally comparable food matrix.

A Laboratory Bioassay alimentando-Fish para avaliar a actividade anti-predação de metabolitos secundários a partir de tecidos de organismos marinhos

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA libraries are needed for optimal results from next-generation sequencing. Environmental samples such as water may have low quality and quantities of DNA as well as contaminants that co-precipitate with DNA. The mechanical and enzymatic processes involved in extraction and library preparation may further damage the DNA. Gel size selection enables purification and recovery of DNA fragments of a defined size for sequencing applications. Nevertheless, this task is one of the most time-consuming steps in the DNA library preparation workflow. The protocol described here enables complete automation of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments. 
In this study, we describe a high-throughput approach to prepare high quality DNA libraries from freshwater samples that can be applied also to other environmental samples. We used an indirect approach to concentrate bacterial cells from environmental freshwater samples; DNA was extracted using a commercially available DNA extraction kit, and DNA libraries were prepared using a commercial transposon-based protocol. DNA fragments of 500 to 800 bp were gel size selected using Ranger Technology, an automated electrophoresis workstation. Sequencing of the size-selected DNA libraries demonstrated significant improvements to read length and quality of the sequencing reads.

This manuscript describes an automated gel size selection approach for purifying DNA fragments for next-generation sequencing. The Ranger Technology provides complete automation of the entire process of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments allowing for high-throughput and high quality next-generation sequencing libraries.

Automated Gel seleção de tamanho para melhorar a qualidade das bibliotecas de sequenciação de próxima geração Preparado a partir de amostras de água do ambiente

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated HF183 marker. The EntHF183 duplex dPCR (referred as EntHF183 dPCR hereon) assay uses the same primer and probe sequences as its published individual quantitative PCR (qPCR) counterparts. Likewise, the same water filtration and DNA extraction procedures as performed prior to qPCR are followed prior to running dPCR. However, the duplex dPCR assay has several advantages over the qPCR assays. Most important, the dPCR assay eliminates the need for running a standard curve and hence, the associated bias and variability, by direct quantification of its targets. In addition, while duplexing (i.e. simultaneous quantification) Enterococcus and HF183 in qPCR often leads to severe underestimation of the less abundant target in a sample, dPCR provides consistent quantification of both targets, whether quantified individually or simultaneously in the same reaction. The dPCR assay is also able to tolerate PCR inhibitor concentrations that are one to two orders of magnitude higher than those tolerated by qPCR. These advantages make the EntHF183 dPCR assay particularly attractive because it simultaneously provides accurate and repeatable information on both general and human-associated fecal contamination in environmental waters without the need to run two separate qPCR assays. Despite its advantages over qPCR, the upper quantification limit of the dPCR assay with currently available instrumentation is approximately four orders of magnitude lower than that achievable by qPCR. Consequently, dilution is needed for measurement of high concentrations of target organisms such as those typically observed following sewage spills.

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay that can be used to simultaneously quantify Enterococcus spp. and the HF183 genetic markers as indicators of general and human-associated fecal contamination in recreational waters.

Um ensaio de PCR Duplex Digital para a simultânea Quantificação da<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Ea Human Fecal-associado HF183 marcador no Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Clean Sampling and Analysis of River and Estuarine Waters for Trace Metal Studies

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination control. Developments of some techniques aiming to reduce trace metal contamination in the last couple of decades have resulted in concentrations reported now being orders of magnitude lower than those in the past. These low concentrations often necessitate preconcentration of water samples prior to instrumental analysis of samples. Since contamination can appear in all phases of trace metal analyses, including sample collection (and during preparation of sampling containers), storage and handling, pretreatments, and instrumental analysis, specific care needs to be taken in order to reduce contamination levels at all steps. The effort to develop and utilize "clean techniques" in trace metal studies allows scientists to investigate trace metal distributions and chemical and biological behavior in greater details. This advancement also provides the required accuracy and precision of trace metal data allowing for environmental conditions to be related to trace metal concentrations in aquatic environments.
This protocol that is presented here details needed materials for sample preparation, sample collection, sample pretreatment including preconcentration, and instrumental analysis. By reducing contamination throughout all phases mentioned above for trace metal analysis, much lower detection limits and thus accuracy can be achieved. The effectiveness of "clean techniques" is further demonstrated using low field blanks and good recoveries for standard reference material. The data quality that can be obtained thus enables the assessment of trace metal distributions and their relationships to environmental parameters.

Special care using "clean techniques" is required to properly collect and process water samples for trace metal studies in aquatic environments. A protocol for sampling, processing, and analytical procedures with the aim of obtaining reliable environmental monitoring data and results with high sensitivity for detailed trace metal studies is presented.

Limpo Amostragem e Análise do Rio e Estuarina Waters de Estudos de metal de rastreamento

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination ...

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

VacuSIP, um método melhorado para Inex<em&gt; In Situ</em&gt; Medição de partículas e dissolvidos compostos Processado por alimentadores de suspensão ativa

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and ...

Protocol for Microplastics Sampling on the Sea Surface and Sample Analysis

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of scientific publications address microplastic pollution of the sea surface. The protocol below describes the methodology for sampling, sample preparation, separation and chemical identification of microplastic particles. A manta net fixed on an &#187;A frame&#171; attached to the side of the vessel was used for sampling. Microplastic particles caught in the cod end of the net were separated from samples by visual identification and use of stereomicroscopes. Particles were analyzed for their size using an image analysis program and for their chemical structure using ATR-FTIR and micro FTIR spectroscopy. The described protocol is in line with recommendations for microplastics monitoring published by the Marine Strategy Framework Directive (MSFD) Technical Subgroup on Marine Litter. This written protocol with video guide will support the work of researchers that deal with microplastics monitoring all over the world.

The protocol below describes the methodology for: microplastics sampling on the sea surface, separation of microplastic and chemical identification of particles. This protocol is in line with the recommendations for microplastics monitoring published by the MSFD Technical Subgroup on Marine Litter.

Protocolo para Microplásticos Amostragem na superfície do mar e análise de amostras

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of ...

Controlled-release of Chlorine Dioxide in a Perforated Packaging System to Extend the Storage Life and Improve the Safety of Grape Tomatoes

A controlled-release chlorine dioxide (ClO2) pouch was developed by sealing a slurry form of ClO2 into semipermeable polymer film; the release properties of the pouch were monitored in containers with or without fruit. The pouch was affixed to the inside of a perforated clamshell containing grape tomatoes, and the effect on microbial population, firmness, and weight loss was evaluated during a 14 day storage period at 20 &#176;C. Within 3 days, the ClO2 concentration in the clamshells reached 3.5 ppm and remained constant until day 10. Thereafter, it decreased to 2 ppm by day 14. The ClO2 pouch exhibited strong antimicrobial activity, reducing Escherichia coli populations by 3.08 log CFU/g and Alternaria alternata populations by 2.85 log CFU/g after 14 days of storage. The ClO2 treatment also reduced softening and weight loss and extended the overall shelf life of the tomatoes. Our results suggest that ClO2 treatment is useful for extending the shelf life and improving the microbial safety of tomatoes during storage without impairing their quality.

Here, we describe a protocol for the application of a novel, slow-release ClO2 product that reduces spoilage and extends the shelf life of fresh fruit. The slow-release ClO2 product was added to standard commercial grape tomato packaging and tested against Escherichia coli and Alternaria alternata.

A libertação controlada de dióxido de cloro em um sistema de embalagem perfurada para prolongar a vida de armazenamento e melhorar a segurança dos Tomates da uva

A controlled-release chlorine dioxide (ClO2) pouch was developed by sealing a slurry form of ClO2 into semipermeable polymer film; the release properties ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment during manufacturing and transport. Because of their environmental persistence, they are widely distributed in the oceans and on beaches all over the world. They can act as a vector of potentially toxic organic compounds (e.g., polychlorinated biphenyls) and might consequently negatively affect marine organisms. Their possible impacts along the food chain are not yet well understood. In order to assess the hazards associated with the occurrence of plastic pellets in the marine environment, it is necessary to develop methodologies that allow for rapid determination of associated organic contaminant levels. The present protocol describes the different steps required for sampling resin pellets, analyzing adsorbed organochlorine pesticides (OCPs) and identifying the plastic type. The focus is on the extraction of OCPs from plastic pellets by means of a pressurized fluid extractor (PFE) and on the polymer chemical analysis applying Fourier Transform-InfraRed (FT-IR) spectroscopy. The developed methodology focuses on 11 OCPs and related compounds, including dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) and its two main metabolites, lindane and two production isomers, as well as the two biologically active isomers of technical endosulfan. This protocol constitutes a simple and rapid alternative to existing methodology for evaluating the concentration of organic contaminants adsorbed on plastic pieces.

Microplastics act as vector of potentially toxic organic contaminants with unpredictable effects. This protocol describes an alternative methodology for assessing the levels of organochlorine pesticides adsorbed on plastic pellets and identifying the polymer chemical structure. The focus is on pressurized fluid extraction and attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy.

Extração de Pesticidas Organoclorados de Pelotização de Plástico e Análise de Tipo de Plástico

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly relevant as a model for the studies of osmoregulatory mechanisms because of its extreme tolerance to low salinity. It is also widely used as a model of settling biology, in particular in relation to antifouling research. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae for studies. A protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus has been developed and a detailed description of all steps in the production line is outlined (i.e., the establishment of adult cultures on panels, the collection and rearing of barnacle larvae, and the administration of feed for adults and larvae). The description also provides guidance on troubleshooting and discusses critical parameters (e.g., the removal of contamination, the production of high-quality feed, the manpower needed, and the importance of high-quality seawater). Each batch from the culturing system maximally yields roughly 12,000 nauplii and can deliver four batches in a week, so up to almost 50,000 larvae per week can be produced. The method used to culture B. improvisus is, probably, to a large extent also applicable to other marine invertebrates with free-swimminglarvae. Protocols are presented for the dissection of various tissues from adults as well as the production of high-quality RNA for studies on gene expression. It is also described how cultured adults and reared cyprids can be utilized in a wide array of experimental designs for examining gene expression in relation to external factors. The use of cultured barnacles in gene expression is illustrated with studies of possible osmoregulatory roles of Na+/K+ ATPase and aquaporins.

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is a model for studying osmoregulation and antifouling. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae. Here, a protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus is described, including the production of larvae. The use of cultured barnacles in gene expression studies is illustrated.

A craca Balanus improvisus como modelo Marine - cultivo e expressão gênica

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...