This work was supported by NIH-NINDS grant RO1-NS065895 and NIH-NINDS grant 5-F31-NS076250-02. 
We thank JHU SOM Microscope Facility for the use of the cryostat.

NOTA: Todos os procedimentos com animais descritos neste protocolo foram realizadas de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde 26. O protocolo (MO13M391) foi aprovado pelo Comitê Universidade Animal Care and Use a Johns Hopkins. 1. Neonatal Rato Sacrifício, Dissection, e Fixação <ol><li> Sacrifique um rato neonatal por inalação de CO2. </li><li> Cortar imediatamente o hindlimb acima do joelho. Até o dia pós-natal aproximadamente 7, os ossos da perna são suaves o suficiente para cortar com tesoura grande laboratório ou lâmina afiada e posteriormente seção em um criostato. </li><li> Inserir o membro posterior em 10 mL de gelo frio paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) em um tubo de 15 ml. </li><li> Imersão fixar o membro posterior em paraformaldeído durante 4-24 h a 4 ° C. Tecido embrionário requer apenas algumas horass de fixação. <ol><li> Evite fixação mais de 24 horas, pois isso pode reduzir a eficiência TUNEL ensaio. </li></ol></li><li> Cryoprotect o membro posterior por imersão em solução de sacarose. <ol><li> Mudar de paraformaldeído a 10% de sacarose em PBS no mesmo tubo de 15 ml, incubar durante a noite a 4 ° C. </li><li> Alterar a 30% de sacarose em PBS, incubar durante a noite a 4 ° C ou até que as pias dos membros posteriores para o fundo do tubo. Tecido podem ser deixadas em sacarose a 30% durante um período mais longo, desde que a sacarose tenha sido esterilizada por filtração. </li></ol></li></ol> 2. Inclusão do Tecido <ol><li> Encher um meio caminho marcado molde a incorporação com a incorporação de média. </li><li> Coloque membro posterior no topo do meio de fixação, com o lado do corte tão perto quanto possível a uma parede do molde. Marque a orientação do membro posterior do lado de fora do molde. <ol><li> Incorporar vários membros posteriores e cortar no mesmo bloco. No entanto, é importante para assegurar que todas as hindlimbs do bloco são orientados paralelamente uns aos outros para obter secções em níveis correspondentes ao longo do eixo do membro. </li></ol></li><li> Cubra hindlimbs com a incorporação de média. Se hindlimbs deslocar ao derramar o meio, re-orientá-los com pinças atraumáticas ou um palito. </li><li> Permitir a incorporação de forma a infiltrar-se o tecido à temperatura ambiente durante pelo menos 15 min. </li><li> Coloque moldes diretamente em gelo seco ou em isopentano em gelo seco para congelar a incorporação médio. Certifique-se de manter o nível de moldes em todos os momentos e evitar o deslocamento do tecido incorporado. </li><li> Mantenha moldes congelados a -80 ° C até que esteja pronto para cortar, por até vários meses. </li></ol> 3. cryosectioning incorporado Limbs <ol><li> Ajuste temperatura da câmara de criostato para -20 ° C, temperatura do objecto a -18 ° C; ajustar a temperatura do objeto para baixo, conforme necessário. </li><li> Equilibrar o bloco de tecido no interior da câmara de criostato para, pelo menos, 30 min. Temp bloco corretoratura é crucial para a qualidade do corte. </li><li> Os cortes transversais a uma espessura de 10 pm ou menos. Seções mais espessos não será totalmente penetrado por reagentes TUNEL. Use a placa anti-roll, lâminas, e ângulo de lâmina (geralmente 5 °) recomendado para o criostato. </li><li> Recolhe secções em lâminas de vidro ou gelatin- vectabond-revestidos à temperatura ambiente. Coloque imediatamente em uma caixa de lâminas em gelo seco. Mantenha a caixa de slides em um recipiente separado com gelo seco colocado perto do cryostat ao alcance do braço. <ol><li> Os cortes transversais de série através do longo eixo do membro, pulando 100-200 mm. Coletar pelo menos três seções adjacentes em cada nível de série. </li></ol></li></ol> 4. TUNEL Ensaio sobre Seções hindlimb usando um kit comercialmente disponível (todos os passos à temperatura ambiente, salvo indicação) <ol><li> Descongele lâminas com cortes à temperatura ambiente e secar durante a noite ou no fim de semana. </li><li> Reidratar seções por immersing lâminas em PBS para 2 x 10 min em uma jarra de Coplin. Seque com um laboratório de limpar, removendo o máximo de líquido ao redor da seção possível. </li><li> Seções permeabilizar <ol><li> Utilizar um não proteolítico, reagente à base de saponina comercial ou 0,5% de Tween 20 e 0,05% de Triton X100 em PBS. </li><li> Coloque o slide em uma câmara de umidade. Uma câmara de humidade é uma simples caixa vazia ponta da pipeta com uma tampa estanque, com água apenas suficiente adicionado para cobrir o fundo da caixa. </li><li> Pipeta reagente suficiente para o slide para cobrir a seção (50 ul é suficiente para membros neonatais do mouse). Não pipete diretamente na seção, como agitação repetida pode causar a seção para retirar a slide. </li><li> Utilizando uma pinça de ponta romba, coloque um pequeno retângulo de parafilm no topo da seção para se espalhar a gota de reagente e cobrir completamente a seção. Se as bolhas de formar sob a parafilm, levante suavemente-lo fora, seca, e reaplicar. </li><li> Incubar as lâminas com permeabilireagente zação durante 1 hora em câmara úmida coberta. Se as secções começam a levantar a partir do slide, tempo de permeabilização pode ser reduzido para 30 min. </li><li> Lavar as lâminas em PBS em uma jarra de Coplin 2 x 5 min. Os rectângulos parafilme deve flutuar para o topo e pode então ser removido e descartados. </li><li> Usando um laboratório de limpeza, seque o máximo de líquido ao redor das seções quanto possível. </li></ol></li><li> Rotulagem pausa DNA TdT mediada <ol><li> Siga as instruções do kit para fazer tampão de marcação 1x TdT, tampão de marcação suficiente pipeta para o slide para cobrir a secção de tecido (50 ul é suficiente para membros neonatais do mouse). Incubar na câmara de humidade durante 5 min. Como alternativa, mergulhe o slide no tampão de marcação TdT em um frasco coplin. </li><li> Siga as instruções do kit para fazer TdT mix rotulagem. O kit inclui cobalto, magnésio, e catiões de manganês; o catião manganês funciona bem em uma variedade de tecidos, incluindo músculo esquelético, sistema nervoso tissues, fígado, pele e osso. </li><li> Para um controlo positivo, adicionar DNase (rotulado &quot;nuclease&quot; no kit) para a mistura de marcação de TdT. Alternativamente, pré-tratamento de uma secção de controlo positivo com ADNase em tampão de nuclease durante 1 hora a 37 ° C, de acordo com as instruções do kit. Mantenha solução DNase e seções tratado com DNase longe de outras seções experimentais para evitar a contaminação cruzada. </li><li> Para um controlo negativo, omitir enzima TdT da mistura de marcação. </li><li> Usar um toalhete de laboratório para remover tanto tampão de marcação a partir do slide TdT quanto possível. Pipeta TdT mistura de marcação sobre a lâmina (50 ul por ponto), cobrir com uma nova rectângulo de parafilme, e incuba-se a câmara de humidade a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Siga as instruções do kit para fazer tampão de paragem 1x. Usar um laboratório de limpar para remover TdT mistura de marcação a partir do slide, e adicionar ul de tampão de paragem 200-300 para cobrir a secção de tecido, e incuba-se a câmara de humidade durante 5 min. Al<html> ternatively, mergulhe o slide em tampão de parada em uma jarra de Coplin. </li><li> Lava-se a corrediça 2 x 2 min em PBS. Usar um toalhete de laboratório para remover o máximo de PBS a partir do slide quanto possível. </li></ol></li><li> Marcação fluorescente <ol><li> Siga as instruções do kit para preparar solução de etiquetagem fluoresceína para rotular dNTPs em quebras de DNA. Pipeta solução para o slide (50 ul por seção), cubra com um novo retângulo de parafilm, e incubar na câmara úmida por 20 min. </li><li> Wash slides para 2 min em PBS em uma jarra de Coplin. Usar um toalhete de laboratório para remover tanto quanto possível PBS a partir do slide. </li><li> Diluir a Hoechst 33258 corante nuclear de 1 ug / ml em PBS e pipeta sobre a lâmina (100-200 uL é suficiente para cobrir a secção). Incubar na câmara de humidade durante 5 min. </li><li> Lavar 3x durante 5 min em PBS. </li><li> Lamela com Antifade meios de montagem de fluorescência e selar as bordas com unha polonês. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 5. Aquisição de Imagem Digital <ol><li> Adquirir imagens usando um microscópio de fluorescência convencional com DAPI, FITC, e filtros de Texas Red (ou equivalente). Use um objetivo maior ampliação (20x ou 40x) para verificar se a rotulagem foi bem sucedida e núcleos (inteiros ou fragmentados) foram marcadas. Uma objectiva 10X é suficiente para a quantificação de pontos lacrimais TUNEL positivo. </li><li> Coletar imagens da coloração Hoechst, TUNEL, e sinal autofluorescent como três canais de cores falsas separadas combinadas em uma única imagem. Se a etiqueta de TUNEL fluoróforo é verde, do sinal de imagem autofluorescente no filtro vermelho, e vice-versa. <ol><li> Mantenha todas as configurações de imagem equivalente entre os slides para thresholding e quantificação subsequente. Para cada filtro, horários predefinidos e exposição registro, ganho e binning (sem binning é melhor); não usar as configurações de exposição ou de ganho automático. </li><li> Use tentativa e erro para encontrar as configurações de exposição e ganho que melhor capturam a gama de intensidades em todas as lâminas coradas. Certifique-se de que não existem pixels saturadas nas imagens adquiridas, já que esta quantificação viés vontade. </li></ol></li><li> Tome imagens de todo o grupo muscular de interesse. Isso pode exigir várias imagens para ser &quot;costurado&quot; juntos. </li></ol> Análise 6. Imagem <ol><li> Use programas de análise de imagem disponíveis no mercado para analisar imagens digitais de coloração TUNEL. Análise utilizando software comercial é mostrado aqui. Em alternativa, o software ImageJ livre de NIH pode ser usado para analisar a coloração TUNEL. </li><li> Manchar uma seção ao lado da seção manchada de TUNEL com HE (H &amp; E) e dar uma imagem digital de seção plena com um microscópio de campo claro convencional. Use esta imagem H &amp; E em combinação com um atlas de anatomia 5,18,19 traçar as estruturas anatômicas a serem quantificados. </li><li> Com o canal de TUNEL desligado, rastrear manualmente o contorno da área a ser quantificado, utilizandoHoechst e canais autofluorescência de orientação. Converter a área rastreada em uma máscara (um conjunto de pixels selecionados coordena a ser analisado). </li><li> Ligue o canal de TUNEL. Usando a intensidade função limiarizar no programa de análise de imagem, definir o limite inferior a excluir qualquer sinal autofluorescência. </li><li> Aplicar as mesmas configurações de limite para todas as imagens no set estudo. Converso seleções limiarizadas em máscaras. </li><li> Para cada imagem, combinar a máscara da área do músculo ea máscara TUNEL. A nova máscara combinação irá representar sinal TUNEL dentro apenas a área do músculo rastreado. </li><li> Realizar a quantificação da máscara na máscara de combinação para determinar o número de objectos e da área do sinal de TUNEL dentro da área muscular rastreada objeto. Realize esta usando a função de analisador de partículas em ImageJ. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Um método para detectar e analisar quantitativamente a apoptose do ADN associada a danos no músculo esquelético de rato está descrito. O procedimento inclui a colheita de tecidos, coloração TUNEL, aquisição de imagem digital e análise de imagens. Fornecimentos histológicos comuns e ferramentas são necessárias, e um kit especial TUNEL comercial é necessária. Os itens de equipamento grandes essenciais necessários são um criostato, microscópio de epifluorescência, com capacidade de imagem digital, e um si...

Terminal desoxinucleotidilo transferase (TdT) dUTP nick marcação terminal (TÚNEL) é o processo de utilizar a enzima TdT para anexar dUTP a 3 &#39;da dupla e ADN de cadeia simples quebra 12,23. O método TUNEL para detecção de apoptose e DNA dano foi relatada pela primeira vez mais de 20 anos atrás por Gavrieli et al. 1,12,24. Desde então, foi avaliado e otimizado em diferentes preparações de tecido 7,23,27,40. TUNEL foi usado para estudar a morte celular induzida por isquemia de neurónios 6,14,29 e cardiomiócitos 43,44, morte celular neuronal excitotóxica 30,31, e como biomarcador no tratamento da artrite 39. Também tem sido utilizada como um factor de prognóstico e marcador de células tumorais em vários cancros humanos 2,3,15,32,37,38,42. Existem métodos alternativos para a detecção de danos ao DNA e morte celular, mas eles têm desafios técnicos e advertências. Southern blotting pode ser usado para quantifdanos no DNA y em tecido lisados ​​inteiras 7,9-11, mas este método não fornece resolução de nível celular e é difícil de quantificar. O ensaio do cometa é um método baseado em células alternativa que requer a extração de núcleos preservados a partir de células 4,20,28,36. Embora o ensaio do cometa funciona bem em células de cultura isoladas, é muito mais difícil de preparar os núcleos intactos a partir de tecido muscular esquelético 8,21. Tal como acontece com Southern blot, o ensaio do cometa não fornece informações específicas do tipo de células a partir de um homogeneizado de tecido músculo inteiro. Uma outra alternativa para o método de TÚNEL é imuno-histoquímica utilizando anticorpos contra o ADN de cadeia simples 25,33,41 ou contra proteínas que participam em vias de resposta ao dano de ADN e morte celular (por exemplo, p53, H2AX, e caspases) 13,17,22,40. Tais métodos com base em anticorpos requerem caracterização exaustiva de anticorpos e excelente especificidade do anticorpo para se obter uma elevada relação de sinal-para-fundo. Mesmo quando especificaçãoexistem anticorpos ific, podem exigir a desnaturação da proteína-alvo através de procedimentos de recuperação antigênica 34,35. Enquanto discutimos aqui, recuperação antigênica em resultados de tecido muscular em inaceitavelmente elevado autofluorescência. Ao contrário dos métodos alternativos, TUNEL atinge a detecção de danos do ADN com um sinal alto e baixo fundo, excelente especificidade que pode ser testado com os controlos positivos e negativos simples, boa penetração nos tecidos que não necessitam de recuperação de antigénios, e resolução de nível celular. Além disso, o método de TÚNEL demora cerca de 4 horas para se completar, enquanto que os métodos alternativos tipicamente requerem incubações durante a noite. Estudamos a morte de células do músculo esquelético em um modelo de rato de atrofia muscular espinhal (AME) 10 que foi gerado por Hsieh-Li e seus colegas 16. Para quantificar as células apoptóticas no músculo, temos desenvolvido um método de preparação do tecido, de coloração e quantificação que funciona de forma robusta através skele diferenteTal grupos musculares em diferentes pontos de tempo de desenvolvimento em ratinhos. Nós usamos um kit TUNEL-rotulagem comercialmente disponíveis e software de análise de imagem disponível no mercado. Temos também utilizado com sucesso o ensaio TUNEL em combinação com coloração de imunofluorescência na medula espinal 10. Os métodos descritos aqui são úteis para investigadores que desejam apreciar a patologia do tecido, os mecanismos de doença, os mecanismos de envelhecimento, e desenvolvimento (pré- e pós-natal) morte celular no músculo esquelético. A técnica de TUNEL é especialmente útil para estudos de lesão e reparação do ADN e morte celular em sistemas-modelo em que apenas um subconjunto de células é afectado e resolução a nível celular é necessária. Este vídeo descreve a dissecção, processamento de tecidos, corte, e com base em fluorescência TUNEL rotulagem de rato músculo esquelético. Ele também descreve um método de semi-automatizado de TUNEL sinal de quantificação.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="916">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:121px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:460px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:121px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">19202</td>
			<td style="width:460px;">For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 &#176;C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
			<td style="width:460px;">Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">O.C.T. compound&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:119px;">4583</td>
			<td>Embedding medium for cryosectioning.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:121px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">CM 3050S</td>
			<td style="width:460px;">A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 &#956;m sections may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass slides, 25 x 75 x 1 mm</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-552-3</td>
			<td>Slides from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Gelatin</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G-9391</td>
			<td style="width:460px;">Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 mL distilled water, warm to 60 &#176;C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">243361</td>
			<td style="width:460px;">Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectabond tissue adhesion reagent</td>
			<td style="width:121px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">SP-1800</td>
			<td style="width:460px;">Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gellatin-coated slides may be used instead.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tween20</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td style="width:460px;">A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triton X100</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td style="width:460px;">A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptosis detection kit</td>
			<td style="width:121px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">4812-30-K</td>
			<td>Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNase/nuclease</td>
			<td style="width:121px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">4812-30-K</td>
			<td>(included with kit)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNase/nuclease buffer</td>
			<td style="width:121px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">4812-30-K</td>
			<td>(included with kit)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:121px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">780</td>
			<td style="width:460px;">Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DNase-free water</td>
			<td style="width:121px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">351-029-131</td>
			<td>Water from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hoechst 33258</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">94403</td>
			<td style="width:460px;">Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Parafilm M</td>
			<td style="width:121px;">multiple</td>
			<td style="width:119px;">807</td>
			<td style="width:460px;">Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Fluorescent microscope with digital camera</td>
			<td style="width:121px;">&#160;--</td>
			<td style="width:119px;">&#160;--</td>
			<td style="width:460px;">Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vectashield antifade media</td>
			<td style="width:121px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">H-1000</td>
			<td>Antifade media from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">glass coverslips, No.1 thickness</td>
			<td style="width:121px;">Brain Research Labs</td>
			<td style="width:119px;">2222-1</td>
			<td style="width:460px;">Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22x22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nail polish</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">114-8</td>
			<td style="width:460px;">Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and analysis of dna damage in mouse skeletal muscle in situ using the tunel method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Com coloração bem sucedido, sinal TUNEL-positivo deve ser brilhante o suficiente para isolar a partir de autofluorescência definindo limites de intensidade. Objetos TUNEL-positivos em baixa ampliação pode aparecer fragmentos irregulares como brilhantes no músculo esquelético (Figura 1A). No entanto, a maior ampliação, alguns objetos TUNEL-positivo com a morfologia apoptótica clássico deve ser observado, se o tipo de morte celular envolvido é a apoptose (Figura 1B). O control...

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Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Detecção e análise de danos no DNA em Rato Músculo Esquelético<em&gt; In Situ</em&gt; Usando o método TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

16.1K visualizações.  Johns Hopkins School of Medicine. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling. 

Vídeo: Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal circulation, intact whole muscle, at body temperature. This includes the study of contractile responses like posttetanic potentiation, staircase and fatigue. Furthermore, the consequences of disease, disuse, injury, training and drug treatment can be of interest. This video demonstrates appropriate procedures to set up and use this valuable muscle preparation.
To set up this preparation, the animal must be anesthetized, and the medial gastrocnemius muscle is surgically isolated, with the origin intact. Care must be taken to maintain the blood and nerve supplies. A long section of the sciatic nerve is cleared of connective tissue, and severed proximally. All branches of the distal stump that do not innervate the medial gastrocnemius muscle are severed. The distal nerve stump is inserted into a cuff lined with stainless steel stimulating wires. The calcaneus is severed, leaving a small piece of bone still attached to the Achilles tendon. Sonometric crystals and/or electrodes for electromyography can be inserted. Immobilization by metal probes in the femur and tibia prevents movement of the muscle origin. The Achilles tendon is attached to the force transducer and the loosened skin is pulled up at the sides to form a container that is filled with warmed paraffin oil. The oil distributes heat evenly and minimizes evaporative heat loss. A heat lamp is directed on the muscle, and the muscle and rat are allowed to warm up to 37&deg;C. While it is warming, maximal voltage and optimal length can be determined. These are important initial conditions for any experiment on intact whole muscle. The experiment may include determination of standard contractile properties, like the force-frequency relationship, force-length relationship, and force-velocity relationship.
With care in surgical isolation, immobilization of the origin of the muscle and alignment of the muscle-tendon unit with the force transducer, and proper data analysis, high quality measurements can be obtained with this muscle preparation.

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

This video demonstrates the surgical preparation and procedures needed to study the contractile responses of the rat medial gastrocnemius muscle preparation in situ. This preparation allows measurement of skeletal muscle contractile properties under physiological conditions. The animal is anesthetized and the muscle is separated from surrounding tissue at its distal end. The Achilles tendon is attached to a force transducer, allowing measurement of the muscle&#x2019;s contractile response at 37 degrees C with an intact circulation.

Procedimentos para Rat<em&gt; In situ</em&gt; Propriedades contrátil do músculo esquelético

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Biologia

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Avaliação do cálcio Faíscas intactas fibras musculares esqueléticas

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Isolamento de filtração de Ácidos Nucleicos: Um Método de extracção de DNA simples e rápido

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.

Eletroporação do DNA plasmídeo no músculo esquelético do rato

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

Quantificação da infiltração gordurosa do músculo esquelético via descelularização

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic disorders, and dystrophies. Clinically in human populations, fatty infiltration is assessed using noninvasive methods, including computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), and ultrasound (US). Although some studies have used CT or MRI to quantify fatty infiltration in mouse muscle, costs and insufficient spatial resolution remain challenging. Other small animal methods utilize histology to visualize individual adipocytes; however, this methodology suffers from sampling bias in heterogeneous pathology. This protocol describes the methodology to qualitatively view and quantitatively measure fatty infiltration comprehensively throughout intact mouse muscle and at the level of individual adipocytes using decellularization. The protocol is not limited to specific muscles or specific species and can be extended to human biopsy. Additionally, gross qualitative and quantitative assessments can be made with standard laboratory equipment for little cost, making this procedure more accessible across research laboratories.

Autor em destaque: Quantificação baseada em descelularização da infiltração gordurosa do músculo esquelético  

The present study describes decellularization-based methodologies for visualizing and quantifying intramuscular adipose tissue (IMAT) deposition through intact muscle volume, as well as quantifying metrics of individual adipocytes that comprise IMAT.

Quantificação da Infiltração Gordurosa do Músculo Esquelético Baseada na Decelularização

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic ...

<meta charset="utf8"></head><body>Análise CyTOF de célula única de progenitores miogênicos na regeneração muscular

Identification and Analysis of Myogenic Progenitors In Vivo During Acute Skeletal Muscle Injury by High-Dimensional Single-Cell Mass Cytometry

Skeletal muscle regeneration is a dynamic process driven by adult muscle stem cells and their progeny. Mostly quiescent at a steady state, adult muscle stem cells become activated upon muscle injury. Following activation, they proliferate, and most of their progeny differentiate to generate fusion-competent muscle cells while the remaining self-renews to replenish the stem cell pool. While the identity of muscle stem cells was defined more than a decade ago, based on the co-expression of cell surface markers, myogenic progenitors were identified only recently using high-dimensional single-cell approaches. Here, we present a single-cell mass cytometry (cytometry by time of flight [CyTOF]) method to analyze stem cells and progenitor cells in acute muscle injury to resolve the cellular and molecular dynamics that unfold during muscle regeneration. This approach is based on the simultaneous detection of novel cell surface markers and key myogenic transcription factors whose dynamic expression enables the identification of activated stem cells and progenitor cell populations that represent landmarks of myogenesis. Importantly, a sorting strategy based on detecting cell surface markers CD9 and CD104 is described, enabling prospective isolation of muscle stem and progenitor cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS) for in-depth studies of their function. Muscle progenitor cells provide a critical missing link to study the control of muscle stem cell fate, identify novel therapeutic targets for muscle diseases, and develop cell therapy applications for regenerative medicine. The approach presented here can be applied to study muscle stem and progenitor cells in vivo in response to perturbations, such as pharmacological interventions targeting specific signaling pathways. It can also be used to investigate the dynamics of muscle stem and progenitor cells in animal models of muscle diseases, advancing our understanding of stem cell diseases and accelerating the development of therapies.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Investigando a dinâmica celular e molecular durante a regeneração muscular usando tecnologias de célula única de ponta

The protocol presented here enables the identification and high-dimensional analysis of muscle stem and progenitor cells by single-cell mass cytometry and their purification by FACS for in-depth studies of their function. This approach can be applied to study regeneration dynamics in disease models and test the efficacy of pharmacological interventions.

Identificação e análise de progenitores miogênicos in vivo durante lesão muscular esquelética aguda por citometria de massa de célula única de alta dimensão

Skeletal muscle regeneration is a dynamic process driven by adult muscle stem cells and their progeny. Mostly quiescent at a steady state, adult muscle ...