Agradecemos a Anne de Jong e Siger Holsappel para obter ajuda com o DNA microarrays produção slide. O apoio da Anne de Jong para análise bioinformática também é apreciado. Agradecemos também a Jelle Slager para a revisão do papel. Muhammad Afzal e Irfan Manzoor são suportados pela Universidade GC, Faisalabad, Paquistão sob o programa de desenvolvimento do corpo docente da HEC Paquistão.

1. Preparação de Mídia e Cultura de Células <ol><li> Crescer S. pneumoniae D39 estirpe selvagem 21 como descrito anteriormente 11. Inocular células armazenadas a -80 ° C em glicerol a 10% (com razão de 1/100 em tubos de 50 ml estéreis) em 50 ml de meio definido quimicamente (CDM), com um pH final de 6,4 15, mas omitir L-serina a partir do aminoácido mistura. Nota: Foram utilizados dois diferentes MDL; uma contendo uma concentração mínima de L-serina (150 uM) e o outro contendo uma concentração máxima de L-serina (10 mM). Esta concentração mínima é, basicamente, a concentração de L-serina em plasma de sangue humano e o objectivo é comparar a expressão de genes de S. pneumoniae estirpe D39 sob estas duas condições. </li></ol> 2. Isolamento de ARN total <ol><li> Materiais <ol><li> Use fenol ácido, grau de ARN para o isolamento do ARN total. </li><li> Macaloid: <ol><li> Suspender 2 gramas demacaloid em 100 ml de TE e ferver durante 5 min. Arrefecer até à TA e sonicado até macaloid gels.Centrifuge a solução a 2000 × g durante 5 min à temperatura ambiente, ressuspender em 50 ml de TE, pH 8 e armazenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Soluções: <ol><li> Trate todas as soluções com pyrocarbonate etílico (DEPC). Adicionar 100 ul DEPC / 100 ml de solução, incubar O / N a 37 ° C e à autoclavagem durante 15 minutos. </li></ol></li></ol></li><li> Metodologia <ol><li> Cresça 50 ml de S. cultura de células pneumoniae D39 em tubos de 50 ml a 37 o C (sem agitação) até a fase mid-exponencial (OD ~ 0,3). Culturas de centrifugação a 4 ° C em 10.000 × g durante 2 min. Descarte de mídia e congelar imediatamente os sedimentos celulares em nitrogênio líquido. </li><li> Pré-mistura de 300 ul de clorofórmio: IAA (24: 1) e 300 ul de fenol (fenol ácido, grau de ARN). Use 500 ul da fase orgânica no passo 2.2.3. </li><li> Prepare a seguinte mistura de antecedência em tubos com tampa de rosca livre RNA: 00,5 g de esferas de vidro, 50 ul de SDS a 10%, 500 ul de fenol / clorofórmio: IAA (tal como preparado no passo 2.2.2), camada macaloid (150-175 uL, não exacto, uma vez que é muito viscoso). Ressuspender as peletes de células em 400 ul de TE (DEPC) e adicionar as células ressuspensas em tubos com tampa de rosca. </li><li> Para quebrar as células, colocar os tubos com tampa de rosca em um batedor de talão para 2x 60 pulsos &quot;(&quot; homogeneizar &quot;) com 1 min de intervalo no gelo. Centrifugar as amostras durante 10 min a 10.000 x g (4 ° C). </li><li> Transferir a fase superior para um tubo fresco, adicionar 500 ul de clorofórmio: IAA (24: 1) e centrifuga-se durante 5 min a 10.000 x g (4 ° C). </li><li> Transferir 500 mL da fase superior para tubos frescos, adicione 2 volumes (1 ml) de lise / tampão de ligação e misture por pipetagem cima e para baixo. Isolar o RNA total usando o kit de isolamento de ARN e a seguir o protocolo recomendado fabricante. </li></ol></li></ol> 3. Limpeza de RNA &lt;<html> ol&gt; <li> Para remover a contaminação de ADN do ARN total, adiciona-se 100 ul mistura DNAseI (90 ul de tampão de ADNase e 10 ul DNAseI) e incubar durante 20-30 min a 15-25 ºC. </li><li> Lavar limpos RNA usando o kit de RNAse. Obter 50 ul de volume de eluído. </li></ol> 4. Análise de ARN <ol><li> Determinar a concentração de ARN num espectrofotómetro. Determinar a qualidade do RNA usando um ensaio do seguinte modo (Figura 2). <ol><li> Dilui-se 1 ul de amostra com 50 ul de água com DEPC para obter uma concentração de 20-200 ng / mL. </li><li> Use 1 ul da amostra de RNA diluída para verificar a qualidade do Bioanalyzer de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol></li><li> Nota: uma proporção de 23S: 16S de cerca de 2,0 é considerado bom unidade RNA 1 A260 corresponde a 40 ug / ml.. A quantidade recomendada para a rotulagem é de 10-20 mg. </li></ol> 5. Preparação cDNA e Rotulagem ntent &quot;&gt; NOTA: O protocolo foi seguido o seguinte para a preparação de cDNA e rotulagem. <ol><li> Recozimento <ol><li> Execute reação recozimento em 300 tubos de PCR ul, mantendo a concentração de RNA total de 10-15 mg para slides caseiros ou 5 mg para slides feitos à empresa. Misturar ARN com 2 ul nonameros aleatórios (1,6 ug / ul) e adicionar água livre de nuclease, se necessário, para manter o volume final da mistura de emparelhamento a 18 ul. </li><li> Manter a mistura de hibridização a 70 ° C durante 5 min. Depois disso, a mistura arrefecer até à temperatura ambiente durante 10 min (recozimento) e, se necessário, rodar para baixo as reacções para a parte inferior do tubo. Inserir os tubos de reacção em gelo durante pelo menos 1 min. </li></ol></li><li> Transcrição Reversa <ol><li> Preparar a mistura de transcriptase reversa da seguinte forma: a mistura de recozimento 18 mL, adicionar 12 mix ul Master (que consiste em 6 mL de buffer 5x First Strand, 3 ul 0,1 M DDT, 1,2 ul 25x-dUTP AA mix / nucleotídeos e 1,8 ul reverter transcriptase (1 ml para slides feitos à empresa). Manter a mistura de reacção durante 2-16 horas a 42 ° C. </li></ol></li></ol> 6. Degradação de ARNm e purificação de ADNc <ol><li> Para degradar o ARNm a partir da mistura de reacção, adicionar 3 mL de NaOH 2,5 M e lugar a 37 ° C durante cerca de 15 min. Seguidamente, adicionar 15 mL de 2M HEPES ácido livre para neutralizar o NaOH. </li><li> Purifica-se a mistura de cDNA por PCR usando colunas de limpeza e seguir o protocolo do fabricante. </li></ol> 7. Medição da Concentração de cDNA <ol><li> Medir as concentrações de cDNA em um espectrofotómetro. Para continuar com a rotulagem, verificar que a concentração de cDNA é de pelo menos 60 ng / mL (lâminas caseiros) ou 20 ng / mL (lâminas feitas pela empresa). </li></ol> 8. Rotulagem de cDNA com Amine-reativa Dye e Purificação <ol><li> Use corante amino-reactivo para rotular o cDNA. Misturar diretamente o cDNA com uma alíquota (5 ul) deamina reactiva do corante. </li><li> Incubar a mistura à temperatura ambiente, no escuro, durante 60 a 90 min e proceder directamente a purificação de ADNc marcado com corante. Purifica-se cDNA marcado com corante por PCR usando colunas de limpeza e seguindo o protocolo do fabricante. Elui-se ADNc em 50 ul de tampão de eluição. </li></ol> 9. Medição de cDNA etiquetado <ol><li> Utilizar um espectrofotómetro para medir a incorporação de corantes reactivos com aminas para o cDNA. Verificar que a concentração de corantes reactivos a amina é de pelo menos 0,5 pmol / mL num volume total de 50 ul. </li></ol> 10. homogeneização das amostras Labelled cDNA <ol><li> Para lâminas caseiros, use todo o cDNA marcado para hibridação com diferença não superior a 30% na concentração de cDNA. Para lâminas feitas pela empresa, use cDNA com não mais do que diferença de 2 vezes na concentração de cDNA. Nota: normalmente, é necessária cerca de 300 ng de cDNA para slides feitos à empresa, o que é muito pouco em comparação com o reqquantidade de cDNA uired para slides caseiros. </li></ol> 11. A hibridação e de lavagem <ol><li> Use os seguintes reagentes: água desmineralizada, etanol 99%, Tímido tampão (caseiro; com levedura RNA 40 mL). Prepare máximo de 1 ml de tímido. </li><li> Aparelhos e soluções de preparação <ol><li> Ligue concentradores de vácuo e aquecedor, pelo menos, 1 hora antes da secagem. Ligue forno de hibridização, com set point ajustado à temperatura de hibridização correta (por microarranjos de DNA de S. pneumoniae, use 45 ° C). Da mesma forma, o pré-aquecimento cassete hibridação e forno durante 30-60 minutos. </li><li> Pré-aqueça tampão TÍMIDO a 68 C durante pelo menos 30 min. </li></ol></li><li> A preparação da amostra (cADN) <ol><li> Combine quantidades iguais de cDNAs marcados (max 30% de diferença). Seca-se a amostra utilizando os concentradores de vácuo a temperatura elevada (aprox. 40 min) até que o volume é menor do que 7 ul. </li></ol></li><li> Lifter-derrapante <ol><li> Use levantador deslizamentos limpas.Nota: ± 30 ul podem ser carregados sobre a lâmina. </li><li> Limpe o levantador deslizamentos com sabão, a abundância de água da torneira e 100% de etanol. Nota: deslizamentos levantador sujos dar alta fundo. </li><li> Air secar o levantador deslizamentos com pistola de ar para soprar as partículas de poeira. Coloque um elevador-derrapante limpo no slide com o revestimento de teflon branco nos lados virados para baixo. </li></ol></li><li> A adição de tampão de hibridação (em cDNA marcado) <ol><li> Dissolve-se as amostras de corantes secos em 7 ul de H2O e incubar a 94 ° C durante 2 min. </li><li> Imediatamente, adicione 35 mL de tampão pré-aquecido TÍMIDO (68 ° C), misture delicadamente e girar a uma velocidade máxima de 1 min para se livrar de precipitados. Pré-aqueça a sonda a 68 C por aproximadamente 5 min até o carregamento. </li></ol></li><li> Deslize-levantador slip-montagem e pré-aquecimento. <ol><li> Coloque o suporte de hibridação de slides em um calor-block a 50 ° C. Colocar as lâminas de microarranjos de DNA com o levantador-slip on titular hibridação de slides aquecida e preaquecer o slide com levantador-derrapante para um minuto. Executar os seguintes passos tão rapidamente quanto possível. </li><li> Adicionar 40 ul da amostra alvo com a extremidade da lâmina. Permita que o fluido flua entre as superfícies de vidro por força de capilaridade. Execute todas pipetagem devagar e com cuidado. </li><li> Mantenha as lâminas com levantador-slip horizontal em todos os momentos e mover-se lentamente para se certificar de que o levantador-slip não se mexeu. </li><li> Tirar a cassete de hibridação pré-aquecido para fora do forno de hibridação e fechar a máquina. Papel-filtro lugar embebido com 3 ml 2x SSC (citrato de soro fisiológico normal) na cassete hibridação. </li><li> Delicadamente, coloque o suporte de slides a hibridação com slides da cassete de hibridização. Feche a gaveta de hibridação e colocar no forno de hibridização novamente (por cerca de 16-18 horas). </li></ol></li><li> Lavagem de slides <ol><li> Prepare frescos lavagens buffers I, II e III (750 ml por etapa de lavagem). Para 500 ml lavar-buffer I, usar 2 x SSC / SDS 0,5%. Para 500 ml de lavar-lustreer II, usar 1 x SSC / SDS a 0,25%. Para 500 ml de tampão de lavagem-III, usar 1 x SSC / SDS a 0,1% (opcional) </li><li> Coloque as lavagens buffers a 30 ° C (para ter certeza de SDS é dissolvido). </li><li> Submergir as lâminas tão rapidamente quanto possível, mas muito suavemente, num tubo Falcon de 50 mL cheio com tampão de lavagem até que o vidro repousa sobre o fundo cónico do tubo. </li><li> Depois de alguns segundos, quando as pias levantador-derrapante para o fundo do tubo, retire o slide com uma pinça sem riscar a matriz e colocar no rack da estação de lavagem. Continuar com a lavagem sem intervalo de tempo. </li><li> Lavam-se as lâminas durante 5 min em 500 ml de tampão de lavagem-I (numa estação de lavagem). Dê-lhe uma segunda lavagem por 20-30 min em 500 ml de lavar-buffer II (em uma estação de lavagem). Da mesma forma, lavar as lâminas durante 5 min em 500 ml de tampão de lavagem-III (opcional) (numa estação de lavagem). </li><li> Secam-se as lâminas durante 2 min a 2000 rpm. </li></ol></li></ol> 12. Análise de Microarray <ol><li> Digitalizar imagenscom os respectivos comprimentos de onda em scanner e salvar em uma pasta &quot;Jove Project&quot;. </li><li> Use software para analisar os arquivos digitalizados, inicialmente, como descrito anteriormente 22. Depois de executar este programa, selecione a guia &quot;Abrir imagem&quot; para carregar o arquivo de imagem vermelho (-.550) como &quot;Vermelho&quot; e arquivo de imagem verde (-.635) como &quot;Green&quot;. Faça o upload do arquivo gal (.gal) com lista de matriz S. pneumoniae no arquivo de imagem, selecionando &quot;lista de matriz Load&quot; guia 22. Nota: esta lista de matriz constituído por 48 redes, em cada grade havia 16 linhas e 15 colunas. Cada ponto na grade representa um único gene e informações pontuais incluindo nome gene é adicionado através de um arquivo de descrição de local. Os números no local são dadas a partir da esquerda para a direita e de cima para baixo. </li><li> Depois de encontrar cuidadosamente as grades, selecione a guia &quot;Find Array, encontrar blocos, Alinhe Features&quot; para alinhar os pontos. Depois de alinhar todos os recursos, analisar a imagem, selecionando o &quot;Analisando&quot; tab. Criar um novo arquivo de ter resultados, histograma e gráfico de dispersão. Salve este arquivo a partir do separador &quot;resultados salvar como&quot; como um arquivo .gpr para análise posterior. </li><li> Realize uma maior normalização e tratamento de dados com in-house desenvolvido pacote de software Microprep como descrito 9. </li><li> Use repetições biológicas independentes para dados microarray de DNA que são trocados-dye. Realizar implementação CyberT de uma variante de t-test1 e calcular as taxas de descoberta de falsas (FDR), como descrito 9. </li><li> Para genes expressos diferencialmente, ter p &lt;0,001 e FDR &lt;0,05 como um padrão. </li><li> Faça o upload de dados de microarrays de DNA na página submissão NCBI para obter um GEO (Gene Expression Omnibus) o número de acesso. </li></ol>

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Bacteriol. 189, 38-51 (2007).</li><li>Molecular Devices, Corp. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners-Use's Guide and Tutorial. , (2005).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Nós descrevemos um protocolo de fácil utilização que pode ser aplicado para realizar a análise de toda transcriptoma de bactérias. O ponto-chave sobre esta técnica particular é que a condição sob a qual as células são colhidas irão variar. Após a colheita de células e o isolamento de ARN, esta técnica torna-se igual para todos os tipos de amostras bacterianas e segue passos exactamente idênticas e, por conseguinte, pode ser aplicado a qualquer tipo de cultura bacteriana. O protocolo é muito simples e conveniente e começa a partir de isolamento RNA. Nosso protocolo de isolamento de ARN (usando um Macaloid e kit de isolamento de ARN) é eficaz de tempo em comparação com fenol-clorofórmio e métodos convencionais Trizol. No passo seguinte, a preparação de ADNc com a enzima transcriptase III é realizada. Em seguida, a rotulagem de cDNA é realizado por primeiro mistura de ADNc com corantes reactivos a amina, e depois purificando o cDNA marcado. A rotulagem também é simples e não leva muito tempo que as amostras devem ser incubados por cerca de 1hr no escuro. Todos estes passos podem ser realizados em qualquer laboratório padrão, pois não exige qualquer equipamento especializado. Um scanner de microarray é necessário para digitalizar slides. Para a digitalização de slides e análise, o programa GenePix Pro é usado, que é um programa muito simples e fácil de usar 22. Depois de fazer todas as experiências, a análise foi realizada utilizando MicroPrep e CyberT. O pacote MicroPrep, é composto por três módulos, ou seja, PrePreP, preparação e PostPreP 9. Este quadro de pré-processamento de dados reduz o tempo para a normalização dos dados e também reduz a quantidade de dados descartados. A facilidade com que o software pode ser utilizado torna possível que o pesquisador se ter uma compreensão dos dados de microarranjo de DNA em tempo mínimo. Leva apenas alguns minutos para converter os dados do sinal brutos em dados de alta qualidade para processamento adicional após análise de imagens de slides é feito. Uma análise mais aprofundada sobre o conjunto de genes regulados no microarray pode ser feito usando diferentes pacotes de software in-house. Eles incluem pimenta 20, FIVA 16, DIVULGAR 18, 17 e PROCURADOR Genome2D 19. Essas ferramentas baseadas em Windows e pacotes de software são de fácil utilização e fornecer uma visão profunda dos dados durante uma investigação mais aprofundada. Estes pacotes de software tornam muito fácil e acessível para os pesquisadores a utilizar esta tecnologia como os dados se torna muito mais significativa e relevante. Os corantes utilizados em microarrays são conhecidos por serem muito susceptíveis a um efeito de ozono, em que os corantes tornar-se instável na presença de ozono e a intensidade do sinal é tão baixo que não pode ser reconhecido pelo scanner. Corantes reactivos com aminas que são menos sensíveis ao efeito do ozono são utilizados para marcar ADNc. A solução para o ozônio e efeito fará com que esta tecnologia ainda melhor. Uma lista de genes foi criado que estavam cima ou regulados negativamente na presença do mínimo de L-sorine concentração, em comparação com o valor máximo (Tabela 2). Os genes regulados positivamente podem ser classificados de acordo com a função do seu produto. Sete deles codificam proteínas hipotéticas, quatro estão envolvidos no transporte e metabolismo de hidratos de carbono, uma proteína DivIB divisão celular, e certos genes de transporte de aminoácidos e de metabolismo. De igual modo, há também certos genes que são regulados negativamente em nossa condição testada. Um LicT regulador transcricional BglG-família, alguns genes de hidratos de carbono e alguns genes específicos de aminoácidos encontram-se entre os genes regulados negativamente. A GrpE proteína de choque térmico também está entre os mais regulada para baixo. Portanto, este estudo fornece uma visão completa dos genes diferencialmente expressos nas condições testadas. Após análise dos resultados, por vezes, a verificação dos resultados é necessário. Isto pode ser feito quer por qPCR ou ensaios β-galactosidase utilizando fusões de lacZ do promotor.

O estudo de todo o conjunto de mRNA abundância (transcriptoma) codificadas pelo genoma de um organismo unicelular ou uma célula eucariótica em um momento específico ou sob uma condição específica, incluindo a superexpressão de genes ou knock-out, é chamado transcriptomics. Transcriptomics nos permite observar em que medida os genes são expressos sob uma condição particular em um ponto X tempo e nos dá informações sobre como fortemente os genes são expressas em relação a uma referência. Uma micromatriz é uma matriz bidimensional em um substrato sólido (geralmente numa lâmina de vidro ou de silício de película fina de células) que podem ser utilizados para ensaiar grandes quantidades de material biológico utilizando rastreio de alto rendimento, e miniaturizado, de processamento e paralelo multiplexado e detecção métodos. Microarrays vêm em vários tipos, inclusive de DNA microarrays, microarrays de proteína, microarrays peptídicos, microarrays de tecidos, microarrays de anticorpos, microarrays celulares e outros. A DNA microarray ébasicamente, um conjunto de manchas de DNA microscópicos fixo a uma superfície sólida, geralmente de vidro. Microarranjos de DNA são usadas para medir os níveis de expressão de um gene ou um conjunto de genes simultaneamente ao genótipo ou várias regiões de um genoma de 2,3. Picomoles (10 -12 moles) de uma sonda estão presentes no interior de cada ponto de ADN que representa uma sequência de ADN específica, também conhecido como um repórter. As moléculas de mRNA rotulados das amostras são chamados «objectivos». Os fluoróforos são usados ​​para medir a hibridação sonda-alvo e detecção de alvos marcados com fluoróforo determina a abundância relativa de sequências de ácido nucleico no alvo. Um experimento de microarray pode realizar vários testes genéticos em paralelo, porque uma matriz pode conter dezenas de milhares de sondas. O layout de um experimento de microarray simples é mostrado na Figura 1. Recentemente, foi criada em nossas e de outros laboratórios que essas matrizes são reutilizáveis, o que torna esta técnica muito boa relação custo-effective. Diferentes técnicas de isolamento e purificação de RNA foram desenvolvidos ao longo dos anos, incluindo C-TAB, SDS e métodos GT 4-8. Além disso, vários kits comerciais também estão disponíveis. Para a expressão do gene de ARN de alta qualidade é muito importante. Portanto, os métodos de isolamento de ARN são modificados para obter uma quantidade máxima de ARN. Da mesma forma, os passos para a preparação de ADNc e rotulagem de cDNA são minimizados. Normalização de dados após rastreamento também é feito de forma eficiente, utilizando-casa construída em pacotes de software e ferramentas 9. O Streptococcus pneumoniae é um agente patogénico humano Gram-positiva que coloniza a nasofaringe e é a causa de infecções múltiplas, tais como pneumonia, sepsis e meningite otite média 10. A bactéria pode utilizar uma ampla variedade de nutrientes necessários para o crescimento e sobrevivência 11,12. Um número de estudos foram realizados sobre ometabolismo do nitrogênio pneumocócica e regulação enfatizando a importância de aminoácidos e seu papel na virulência 13,14. Neste estudo, a resposta do transcriptoma de S. pneumoniae para alterar as concentrações de L-serina, um aminoácido presente em abundância no plasma sanguíneo humano, é descrito, utilizando microarrays de ADN. A resposta do transcriptoma de S. pneumoniae crescida em uma concentração mínima de L-serina (150 uM) foi comparada com a cultivada em uma concentração máxima (10 mM) de serina. Meio quimicamente definido (CDM ou meio mínimo) 15 foi utilizado para este estudo para controlar a concentração de serina. O foco deste estudo é fazer com que esta técnica user-friendly e de fornecer ferramentas diferentes para a normalização e análise de dados. Assim, foram desenvolvidas uma série de ferramentas para análise e interpretação dos dados. FIVA (Functional Information Viewer e Analyzer) fornece uma plataforma para processamento de informações contidas nos conjuntos de genes que têmpadrões de expressão gênica semelhantes e para a construção de perfis funcionais 16. PROCURADOR é um outro pacote de software que facilita a identificação de funções putativas e anotações de genes 17. Ao fazer uso de métodos de agrupamento, DIVULGAR fornece um algoritmo de detecção de local de ligação DNA. Cis -regulatory motivos de genes pode ser projetada usando este algoritmo 18. Genome2D oferece uma plataforma baseada em Windows para visualização e análise de dados de transcriptoma, oferecendo diferentes gamas de cores para caracterizar as alterações nos níveis de expressão de genes em um mapa do genoma 19. O webserver Pepper oferece, além do método de tudo-em-uma análise, uma caixa de ferramentas para mineração para regulons, promotores e ligação do factor de transcrição locais 20. Anotação completa das regiões intergénicas num genoma bacteriano pode ser conseguida utilizando este pacote. Os biólogos podem se beneficiar muito de pimenta, pois oferece-lhes uma plataforma para a concepção de experiências de modo que a informação hipotética pode ser confirmada in vitro 20. Estes pacotes de software de contribuir de forma significativa para a análise de microarray como a maior parte deles estão livremente disponíveis e fazer a normalização de dados e análise muito fiável.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid phenol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P4682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche RNA isolation kit</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>11828665001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td></td>
			<td>105015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Boom</td>
			<td>92013505.1000.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAA</td>
			<td></td>
			<td>106630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>ND-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent BioAnalyser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2940CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III</td>
			<td>Life technologies Invitrogen</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AA-dUTP</td>
			<td>Life technologies Invitrogen</td>
			<td>AM8439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDT</td>
			<td>Life technologies Invitrogen</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First Strand buffer</td>
			<td>Life technologies Invitrogen</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>S8045-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight-550</td>
			<td>Thermoscientiffic</td>
			<td>62262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight-650</td>
			<td>Thermoscientiffic</td>
			<td>62265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHY Buffer</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>H7033-125ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speedvac cooler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>RUGNE3140</td>
			<td>Speedvac concentrator plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Grant Boekel</td>
			<td>Iso-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lifter-slips</td>
			<td>Erie Scientific</td>
			<td>25x60I-M-5439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wipe</td>
			<td>KIMTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>L3771-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>W302600-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genpix autoloader 4200A1</td>
			<td>MSD analytical technologies</td>
			<td></td>
			<td>Microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>104766</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fast and reliable pipeline for bacterial transcriptome analysis case study: serine-dependent gene regulation in streptococcus pneumoniae

A expressão gênica e de sua regulamentação são muito importantes para entender o comportamento das células sob condições diferentes. Várias técnicas são usadas hoje em dia para estudar a expressão do gene, mas a maioria são limitados em termos de proporcionar uma visão global da expressão de todo o transcriptoma. Microarranjos de DNA oferecem uma tecnologia de pesquisa rápida e econômica, o que dá uma visão completa da expressão gênica global e têm um vasto número de aplicações, incluindo a identificação de novos genes e fator de transcrição locais, caracterização da atividade transcricional das células e também de ligação ajudar na análise de milhares de genes (numa única experiência). No presente estudo, as condições para a análise do transcriptoma bacteriana desde a colheita de células para análise de DNA microarray foram otimizados. Levando-se em conta o tempo, custos e precisão dos experimentos, esta plataforma de tecnologia revela-se muito útil e universalmente applicabale para estudar transcripto bacterianames. Aqui, vamos realizar a análise de DNA microarray com Streptococcus pneumoniae como um caso de estudo comparando as respostas de transcrição de S. pneumoniae foram cultivados na presença de concentrações variáveis ​​de L-serina no meio. O ARN total foi isolado utilizando um método Macaloid usando um kit de isolamento de ARN e a qualidade do ARN foi verificada usando um kit de controlo de qualidade de ARN. O ADNc foi preparado utilizando transcriptase reversa e as amostras de ADNc foram marcados utilizando um dos dois corantes fluorescentes reactivos a aminas. Caseiros lâminas de microarranjos de DNA foram utilizados para a hibridização das amostras de cDNA marcadas e dados de microarranjos foram analisados ​​usando um quadro de pré-processamento de dados de cDNA microarray (Microprep). Finalmente, Cyber-T foi utilizado para analisar os dados gerados usando Microprep para a identificação de genes expressos diferencialmente estatisticamente significativas. Pacotes de software Além disso, em casa construídas (pimenta, FIVA, divulgar, PROCURADOR, Genome2D) foram utilizados para analisardados.

ARN, o isolamento e análise de cDNA L-serina é um dos aminoácidos essenciais e a sua concentração no plasma sanguíneo humano varia de 60-150 uM em crianças e adultos. O seu papel na biossíntese de purinas e pirimidinas destaca a sua importância no metabolismo e é um precursor de várias aminoácidos (glicina, cisteína e triptofano). Para estudar o impacto da L-serina em todo o transcriptoma de S. pneumoniae D39 estirpe de tipo selvagem, a análise de microarray da estirpe D39 cultivadas em MDL com um mínimo de concentração (150 uM) de L-serina contra que cresceu em uma concentração máxima (10 mM) no mesmo meio foi realizada. Em primeiro lugar, o RNA total a partir de células cultivadas em ambas as concentrações foi isolado. As concentrações de RNA das amostras são dadas na Tabela 1. A qualidade do RNA total foi examinada utilizando o ensaio de controlo de qualidade. O ARN foi tratado com ADNase I antes de realizar esteensaio para remover o ADN genómico possível Figura 2 mostra a qualidade do RNA.; pista L representa a escada, pistas 1 e 2 representam o ARN a partir de 150 um serina e as pistas 3 e 4 representam o ARN a partir de 10 mM de serina. A presença de duas bandas claras correspondentes às duas subunidades de RNA indicou a boa qualidade do RNA e a próxima etapa do método pode ser realizada. Depois de medir a qualidade do ARN, a síntese de cDNA foi realizada. O ADNc foi formada usando nanômetros aleatórios e enzima transcriptase reversa. As concentrações das amostras de cDNA estão apresentados na Tabela 1. Este ADNc foi marcada com corantes reactivos a amina e as concentrações do ADNc marcado e etiquetas de corante são dadas na Tabela 1. Após a marcação, as amostras foram misturadas em conformidade e, em seguida, hibridizadas. Após a lavagem, as lâminas foram digitalizadas usando o scanner, e análise foi realizada utilizando Gene Pix software Pro. A Figura 3 mostra a dispersãoanálise enredo da relação corantes amino-reactivo. Após a análise inicial, os dados foram posteriormente analisados ​​usando o pacote de software PicroPrep (PrePrep, Prep, PostPrep) 9 para reduzir o ruído e Cyber-T foi utilizado para a análise final. A Tabela 2 resume os resultados dos estudos de microarranjos após a aplicação dos critérios de ≥ 2,0 dobrar diferença e valor p &lt;0,001. Um certo número de genes foram expressas diferencialmente na presença de L-serina mínimo em comparação com o valor máximo (Tabela 2). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52649/52649fig1.jpg" /> Figura 1. Uma visão geral da tecnologia de microarranjo de DNA. O ARN é isolado a partir do controlo e das amostras-alvo e cDNA marcado é então hibridado. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52649/52649fig2.jpg" /> Figura 2.Verificação da qualidade do RNA isolado a partir de S. pneumoniae D39 células cultivadas na presença do mínimo (150 uM) e máximo (10 mM), as concentrações de serina. Pista L representa o tamanho escada enquanto que a pista 1 e 2 representam as amostras de RNA isoladas a partir de células crescidas na presença de uma concentração mínima de serina. Da mesma forma, pista 3 e 4 representam amostras de RNA isoladas a partir de células crescidas na presença de concentração máxima serina. As bandas representam a 23S e 16S rRNA. A presença de apenas duas bandas mostra que não existe contaminação ADNg e ARN é de boa qualidade. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52649/52649fig3.jpg" /> Figura 3. Comparação de matriz de dispersão de uma mistura de amostra. Cada ponto no gráfico representa o valor médio de expressão (log2) de um gene de uma experiência com um corante sobre o eixo y e corante 2 no eixo-x. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Amostra </td><td> RNA Sample </td><td> Descrição </td><td> A concentração de RNA (ng / mL) </td><td> concentração de cDNA (ng / mL) </td><td> CDNA etiquetado (ng / mL) </td><td> DyLight-550 (pmol / uL) </td><td> DyLight-650 (pmol / uL) </td><td> Esquema de hibridação </td></tr><tr><td> S1 </td><td> R1 </td><td> D39 de tipo selvagem cultivada em MDL + Mínimo L-serina </td><td> 2057 </td><td> 255 </td><td> 225 </td><td> 0,8 </td><td></td><td> R1 + R3 </td></tr><tr><td></td><td> R2 </td><td> D39 de tipo selvagem cultivada em MDL + Mínimo L-serina </td><td> 2566 </td><td> 201 </td><td> 179 </td><td></td><td> 1.2 </td><td> R2 + R4 </td></tr><tr><td> S2 </td><td> R3 </td><td> D39 de tipo selvagem cultivadas em MDL + L-serina máximo </td><td> 2831 </td><td> 292 </td><td> 276 </td><td></td><td> 2.3 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> R4 </td><td> D39 de tipo selvagem cultivada em MDL + Maximum L-serina </td><td> 1867 </td><td> 172 </td><td> 150 </td><td> 1 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Esquema de hibridação das amostras utilizadas na análise de microarray. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Gene um </td><td> Função b </td><td> C Rácio </td></tr><tr><td> SPD0600 </td><td> DivIB proteína divisão celular </td><td align="right"> 4 </td></tr><tr><td> SPD0445 </td><td> Fosfoglicerato quinase </td><td align="right"> 3,5 </td></tr><tr><td> SPD0646 </td><td> Proteína hipotética </td><td align="right"> 3.4 </td></tr><tr><td> SPD0873 </td><td> Proteína hipotética </td><td align="right"> 3.3 </td></tr><tr><td> SPD1223 </td><td> Proteína hipotética </td><td align="right"> 3.3 </td></tr><tr><td> SPD0980 </td><td> Pyrophosphokinase ribose-fosfato </td&gt; <td align="right"> 2.8 </td></tr><tr><td> SPD1628 </td><td> Xanthine fosforibosiltransferase </td><td align="right"> 2,7 </td></tr><tr><td> SPD1011 </td><td> Glicerato quinase </td><td align="right"> 2.4 </td></tr><tr><td> SPD0645 </td><td> Proteína hipotética </td><td align="right"> 2.3 </td></tr><tr><td> SPD0564 </td><td> Proteína hipotética </td><td align="right"> 2.2 </td></tr><tr><td> SPD0641 </td><td> Manose-6-fosfato isomerase, classe I, mana </td><td align="right"> 2.1 </td></tr><tr><td> SPD1333 </td><td> Proteína hipotética </td><td align="right"> 2.1 </td></tr><tr><td> SPD1384 </td><td> Cátions proteína família efluxo </td><td align="right"> 2.1 </td></tr><tr><td> SPD1432 </td><td> UDP-glucose 4-epimerase, Galé-1 </td><td align="right"> 2.1 </td></tr><tr><td> SPD1866 </td><td> -N-acetil-glucosamina-6-fosfato deacetylase, Naga </td><td align="right"> 2.1 </td></tr&gt; <tr><td> SPD0104 </td><td> Proteína do domínio LysM </td><td align="right"> 2 </td></tr><tr><td> SPD0140 </td><td> ABC transporter, proteína de ligação de ATP </td><td align="right"> 2 </td></tr><tr><td> SPD0261 </td><td> A aminopeptidase C, PepC </td><td align="right"> 2 </td></tr><tr><td> SPD1350 </td><td> Proteína hipotética </td><td align="right"> 2 </td></tr><tr><td> SPD1822 </td><td> Ribossomal grande subunidade pseudouridina sintase, proteína RluD subfamília </td><td align="right"> 2 </td></tr><tr><td> SPD0453 </td><td> Tipo I sistema de restrição-modificação, S subunidade </td><td align="right"> -2 </td></tr><tr><td> SPD0459 </td><td> Calor GrpE proteína de choque </td><td align="right"> -2 </td></tr><tr><td> SPD1006 </td><td> Adeniltransferasa glicose-1-fosfato </td><td align="right"> -2 </td></tr><tr><td> SPD1799 </td><td> Sensor de histidina quinase putativa </td><td align="right"> -2.1 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> SPD0387 </td><td> Beta-hydroxyacyl- (acil-transportador-proteína) desidratase fabz </td><td align="right"> -2.2 </td></tr><tr><td> SPD1494 </td><td> Sugar ABC transporter, proteína permease </td><td align="right"> -2.2 </td></tr><tr><td> SPD0974 </td><td> Classe I amidotransferase glutamina, putativo </td><td align="right"> -2.4 </td></tr><tr><td> SPD1600 </td><td> Fosforibosiltransferase Antranilato </td><td align="right"> -2.5 </td></tr><tr><td> SPD1472 </td><td> Isoleucil-tRNA sintetase </td><td align="right"> -2.6 </td></tr><tr><td> SPD0681 </td><td> Proteína hipotética </td><td align="right"> -2.7 </td></tr><tr><td> SPD0501 </td><td> Antiterminator Transcrição, Lict </td><td align="right"> -3.4 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Lista de genes regulados na comparação transcriptoma de S. pneumoniae D39 estirpe selvagem cultivada em CDM 15 com uma concentração mínima de L-serina e MDL 15 com a concentração máxima de L-serina. Um número de genes referem-se a marcas de D39 do locus. Anotação b D39 / TIGR4 anotação 21. C Rácio representa a dobra aumento / diminuição da expressão de genes no CDM-máxima, em comparação com CDM-mínimo (sinal de menos indica regulação baixa).

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A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages.

A Pipeline rápido e confiável para estudo de Análise de Caso bacteriana transcriptoma: Regulamento Gene Serina-dependente em<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

Gene expression and its regulation are very important to understand the behavior of cells under different conditions. Various techniques are used nowadays ...

a-fast-reliable-pipeline-for-bacterial-transcriptome-analysis-case

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

10.3K visualizações.  University of Groningen. This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages. 

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Análise de Expressão Gênica Utilizando bacteriana Microarrays

Biologia

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolamento de Ribossomos ligados a polipeptídeos nascentes<em&gt; In vitro</em&gt; Identificar Sites Pausa translacionais Junto mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Usando Seqüência de Detenção SECM como uma ferramenta para isolar Ribossomos Polipeptídeos encadernados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Do genoma deleções de genes em<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de Alto Rendimento

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Screening siRNA identificar Ubiquitin e ubiquitina-como reguladores do sistema de caminhos biológicos em células de mamíferos cultivadas

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Eficiente de Ácido Nucleico Extração e sequenciamento genético 16S rRNA para Bacteriana Comunidade Caracterização

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Abordagens genéticas e bioquímicas para<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; Avaliação de oligomerização da proteína: A Case Study rianodina Receptor

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

Análise de microbiota usando PCR de duas etapas e sequenciamento do gene 16S rRNA de próxima geração

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Pipeline rápido e confiável para estudo de Análise de Caso bacteriana transcriptoma: Regulamento Gene Serina-dependente em

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