Este protocolo descreve três ensaios in vitro que avaliam coletivamente as funções das células endoteliais periventriculares humanas e sua interação com interneurônios gabaérgicos humanos. Os resultados desses ensaios fornecerão uma visão crítica sobre a ligação entre células endoteliais periventriculares e distúrbios cerebrais. Estes ensaios são simples, de baixo custo e permitem a medição da migração celular na faixa de centímetros, o que não é alcançado por outros ensaios existentes.
Defeitos na migração e distribuição de interneurônios GABAérgicos estão associados a transtornos psiquiátricos, como autismo, epilepsia, esquizofrenia e depressão. Por isso, é fundamental estudar a interação das células endoteliais periventriculares com interneurônios GABAérgicos no contexto humano para enfrentar a patogênese desses transtornos. Comece preparando células humanas para o ensaio.
Permitir que as células endoteliais periventriculares humanas atinjam 70 a 80% de confluência e dissociá-las de acordo com as instruções do manuscrito e contá-las usando o método de exclusão azul trypan. Para preparar interneurônios gabaérgicos humanos, solução de dissociação celular quente e uma alíquota de meio neuronal a 37 graus celsius por 10 minutos. Em seguida, aspire o meio de cada poço contendo células e lave-as com um milímetro de PBS por poço.
Retire as células adicionando 0,5 mililitros de solução de dissociação pré-armada por poço e incubando-as a 37 graus celsius por cinco minutos. Após a incubação, adicione um mililitro de meio neuronal por poço e transfira a solução celular para um tubo cônico de 15 mililitros, triturando suavemente para dissociar aglomerados celulares. Centrifugar as células a 380 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente, aspirar o supernasal e resuspensar a pelota celular em um mililitro de meio neuronal.
Em seguida, conte as células vivas usando a exclusão azul trypan. Prepare o controle das células endoteliais humanas aquecendo a solução de dissociação celular e uma alíquota de meio endotelial a 37 graus celsius, 10 minutos antes do uso. Aspirar o meio de cada poço e lavá-los com um mililitro de PBS por poço.
Retire as células adicionando 0,5 mililitros da solução de dissociação pré-armada a cada poço e incubando a placa em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, adicione um mililitro de meio celular endotelial por poço para neutralizar a solução de dissociação, e transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar as células a 200 vezes G por cinco minutos, aspirar o supernasciente e resuspensar as células em um mililitro de meio celular endotelial.
Em seguida, use o método de exclusão do tripano para contar as células. Prepare uma inserção de cultura bem,cortando três lados de um poço de uma inserção de cultura de silicone de dois poços com uma lâmina estéril. Remova a pastilha com pinças estéreis e coloque-a no centro de um prato poli-L-ornithine e laminin revestido, em seguida, pressione ao longo da borda da inserção para fixá-lo à superfície.
Vire cuidadosamente o prato de cabeça para baixo para verificar se a inserção está firmemente aderida, e marque o limite do compartimento de inserção usando um mercado negro permanente com uma ponta ultra fina. Suspender interneurônios gabaérgicos humanos em células endoteliais periventriculares periventriculares periventriculares e humanas e meio de células endoteliais a uma concentração de 30.000 por 70 microlitadores, em seguida, sementes 70 microliters da solução celular dentro de cada inserção de cultura bem. Adicione um mililitro de meio neuronal ao prato do neurônio para preencher a área ao redor da pastilha e evitar que o revestimento seque.
Da mesma forma, adicione um mililitro de meio celular endotelial ao prato de célula endotelial periventricular. Verifique as células sob um microscópio para verificar se elas não estão vazando do compartimento de inserção e, em seguida, incuba-as a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Após a incubação, verifique novamente as células sob o microscópio para verificar se elas foram devidamente anexadas.
48 horas após a semeadura, remova suavemente a inserção com pinças estéreis e verifique as células sob o microscópio para verificar se a camada celular permanece intacta. Remova o meio tanto do neurônio quanto dos pratos celulares endoteliais periventriculares, e adicione um mililitro de meio fresco a cada prato. Incubar as células a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono por cinco dias.
Em seguida, remova o meio, fixe as células com 4%PFA por 10 minutos e lave-as três vezes com PBS. Para realizar o ensaio de cocultura, suspenda 30.000 interneurônios GABAérgicos e 30.000 células endoteliais periventriculares humanas em 70 microlitrais de meio de co-cultura, em seguida, semeou esta solução celular dentro de um compartimento de inserção de um poço. Após 48 horas, remova a inserção.
Incubar a cocultura a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono por cinco dias. Após a incubação, remova o meio, fixe as células com 4%PFA e lave-as três vezes com PBS. Para realizar o ensaio de quimio-atração, coloque uma inserção de três poços de cultura no centro de um prato de 35 milímetros revestido de poli-L e laminina, vire o prato de cabeça para baixo e marque o limite ao redor do compartimento médio da inserção usando um marcador permanente com uma ponta ultra fina.
Sementes 30.000 interneurônios GABAérgicos em 70 microliters de meio neuronal no compartimento médio, depois sementes 10.000 células endoteliais periventriculares e 10.000 células endoteliais de controle e 70 microliters de seu respectivo meio nos dois compartimentos externos. Adicione um mililitro de meio de co-cultura ao longo do lado do prato para evitar que o revestimento no prato seque. Após 48 horas, remova a inserção e incubar as células a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono por 36 horas.
Após a incubação, remova o meio, fixe as células e lave-as três vezes com PBS. Ensaios migratórios de longa distância e cocultura foram utilizados para investigar as interações entre células endoteliais periventriculares e neurônios GABAérgicos. No ensaio de migração de longa distância, as células começaram como um patch retangular no dia zero, mas por 48 horas, elas migraram para o espaço livre de células.
A coloração imunocitoquímica com anticorpo Caspase-3 anti-ativo, um marcador de apoptose, não mostrou sinal apoptótico nos neurônios semeados. No ensaio de migração da cocultura, quando os interneurônios foram co-semeados com células endoteliais periventriculares humanas, os neurônios percorreram distâncias mais distantes em comparação com quando os interneurônios eram semeados sozinhos ou quando co-semeados com células endoteliais de controle. No ensaio de quimio-atração, um número significativamente maior de interneurônios migraram para células endoteliais periventriculares em comparação com células endoteliais de controle, confirmando que os interneurônios GABAérgicos respondem seletivamente a pistas quimio-atraentes secretadas por células endoteliais periventriculares.
Esses ensaios podem ser modificados usando ligantes, inibidores ou arenes de ensaio para obter insights mecanicistas sobre interações de células endoteliais periventriculares humanas com interneurônios humanos. Eles também podem ser usados para estudar a interação das células endoteliais periventriculares humanas com outras células neurais, como relatado pelo nosso grupo e outros. Ao tentar este procedimento, é importante fixar a inserção firmemente no prato e mantê-lo intacto durante todo o ensaio, caso contrário, pode levar a vazamento celular, descolamento celular ou desalinhamento da inserção com o limite desenhado.
Nosso trabalho indicou papel autônomo celular das células endoteliais periventriculares humanas em patogênese de transtornos psiquiátricos como esquizofrenia, epilepsia e autismo. Esses ensaios permitirão, portanto, a avaliação de células endoteliais periventriculares doentes derivadas de pacientes com esses transtornos usando a tecnologia IPSC.
