Este protocolo fornece um novo método para uma técnica antiga, e fornecerá uma nova abordagem para um grande número de pesquisadores de ciências básicas. As principais vantagens dessa técnica são sua natureza econômica, bem como sua adaptabilidade a ser usada por um público científico mais amplo. Para preparar uma placa de migração, use um marcador permanente de cor clara para desenhar uma linha no centro da parte de trás de cada poço de uma placa de 48 poços e para desenhar três marcas de hash para dividir cada poço em três áreas de interesse separadas.
Em seguida, a placa de 1,5 a 2 vezes 10 para a quarta passagem única fibroblastos cardíacos em cada poço e cultura as células em condições normais de cultura por 24 a 48 horas até atingirem 90 a 95% de confluência. Quando as células estiverem prontas, remova o sobrenante de cada poço e use uma ponta de pipeta P200 estéril para fazer um arranhão de um passo ao longo das linhas desenhadas. Enxágüe os poços com meio de soro baixo para remover quaisquer fibroblastos cardíacos não ligados e adicionar 500 microliters de baixo soro médio para cada poço.
Se os agentes farmacológicos estiverem sendo utilizados, adicione os agentes aos poços apropriados. Em seguida, use um microscópio invertido com um objetivo de 20x para capturar duas imagens de zero hora por poço usando as marcas para posicionar cada poço para permitir a imagem da metade superior da linha arranhada. Em seguida, mova a placa para posicionar a metade inferior da linha riscada em vista para coletar a segunda imagem e coloque a placa na incubadora de cultura celular por 24 horas.
No final da incubação, lave cada poço com PVS não estéreis e adicione 500 microliters de 4% de paraformaldeído a cada poço em um capô de fumaça. Depois de 10 minutos em temperatura ambiente, lave cada poço três vezes em PBS fresco por cinco minutos por lavagem. Após a última lavagem, permeabilize as células com 300 microliters de solução permeabilizando por bem e suave balanço por 30 minutos em temperatura ambiente.
No final da incubação, substitua a solução permeabilizante por uma mancha azul brilhante de 1%Kumasi para uma incubação de 10 minutos com balanço suave à temperatura ambiente. Seguido por três, cinco minutos lavados na PBS com balanço. Após a última lavagem, adicione 300 microliters de PBS a cada poço e posicione cuidadosamente a placa na mesma posição da imagem de zero hora antes de capturar duas imagens de 24 horas por bem como demonstrado.
No final do experimento, abra as imagens e um programa de análise de imagens apropriado e crie uma nova camada na imagem de zero hora. Clique duas vezes para alterar o nome da nova camada de linha e selecione a ferramenta de pincel. Altere o tamanho do pixel para 10 e a cor para vermelho e desenhe duas linhas separadas para delinear o arranhão.
As linhas não devem tocar em nenhuma célula. Abra a imagem de 24 horas no software de imagem e selecione a ferramenta de movimento. Segurando o botão de controle, clique nas linhas e nas camadas de fundo, clique no centro da imagem de zero hora e arraste ambas as camadas para o meio da imagem de 24 horas.
Na imagem de 24 horas, clique na camada de fundo de zero hora e altere a opacidade para 50%Segurando o botão de controle, clique nas camadas de fundo e linha de zero hora e clique em editar e transformar livremente as camadas Usando a transformação livre, alinhe o plano de fundo de zero hora e as imagens da linha à imagem de fundo de 24 horas para que as linhas de migração da área sejam posicionadas corretamente na imagem de 24 horas. Quando a camada de linha tiver sido sobreposta com sucesso, clique com o botão direito do mouse para excluir a camada de fundo de zero hora. A camada de linha restante pode ser usada para determinar o número de células que migraram para a área de risco ao longo de 24 horas.
Em seguida, salve a nova imagem de migração como um photoshop e um arquivo TIFF ou JPEG. Para quantificar o número de células migratórias, abra a imagem de migração e um programa que aceite arquivos TIFF ou JPEG e conte manualmente o número de células localizadas entre e toque nas duas linhas vermelhas para ambas as imagens para cada poço. Em seguida, registo o número de células migratórias por imagem.
Para determinar a área de migração, abra a imagem de 24 horas que contém as linhas de migração no software de imagem e salve a imagem como imagem da área de migração. Depois de salvar, clique na camada de fundo e clique com o botão direito do mouse para excluir a camada. Use a ferramenta de pincel para preencher a área entre as linhas de risco, com a mesma cor que foi usada para as linhas e clique em imagem, modo e escala cinza para alterar a imagem para preto e branco.
Salve a imagem e abra a imagem da área de migração e um programa de software de análise de imagem apropriado. Clique em editar e inverter. Para determinar a área da linha de migração, clique em imagem, ajuste e limiar.
A área de migração preta ficará vermelha e a área percentual será indicada na caixa de limiares. Em seguida, registo a área percentual para a linha de migração e confirme que esse valor é emparelhado com o número de células migratórias para a mesma imagem. Nesta análise, 46 fibroblastos de corações não diabéticos e 129 fibroblastos de corações diabéticos migraram durante o período experimental de 24 horas.
A medição da área migratória, como demonstrado, revelou que a área de risco não diabético comia 24,78% da área total medida, enquanto a área de risco de migração diabética comia 16,77% da área total medida. A normalização para a área de migração fornece uma avaliação melhor e mais rigorosa da migração celular e nega o potencial erro humano. Por exemplo, se apenas o número de fibroblastos migrados for comparado, pareceria nesta análise que o número de células que migraram nesse poço era o dobro das células migradas no segundo poço.
Quando a área do arranhão foi utilizada para normalizar os dados, no entanto, observou-se que a razão dos fibroblastos para a área de migração foi quase a mesma em ambos os poços. Certifique-se de recapturar a área de migração na imagem de 24 horas, como você capturou na imagem de zero hora. Após este procedimento, a imunohistoquímica pode ser conduzida para examinar a expressão proteica dentro das células.
Acreditamos que essa nova abordagem para o ensaio de migração de arranhões permitirá que mais caminhos da pesquisa científica se abram que anteriormente não estavam disponíveis.
