Medições quantitativas precisas de proteínas são cruciais para compreender a cooperação dinâmica e espacial entre as proteínas para entender a doença de volta à biologia. O objetivo geral deste experimento é fornecer um fluxo de trabalho de proteômica quantitativa integrada para amostras de tecido, combinando perfis de proteínas sem rótulos e baseados em rótulos para a descoberta de biomarcadores. Neste estudo, utilizamos o instrumento Orbitrap Fusion para quantificar as proteínas usando abordagens baseadas em rótulos e sem rótulos.
A lise tecidual é um dos passos mais cruciais para o sucesso de um experimento LC-MS-MS. Tome 30 mg de tecido em um tubo de batida de contas. Após lavar com o PBS, adicione 300 microliter de tampão de ureia contendo oito ureia molar, Tris, NaCl e MgCl2.
Usando um sônico de sonda, lise o conteúdo do tecido. Repita isso para outro ciclo. Se observar algum tecido intacto na parte inferior do tubo, adicione contas de zircônio ao tubo e homogeneize o tecido usando um batedor de contas por 90 segundos, com cinco minutos de incubação no gelo.
Centrifugar as amostras em torno de 6000 G por 15 minutos a quatro graus Celsius para separar os detritos celulares do supernasce. Colete o supernatante em um tubo fresco e misture a solução uniformemente. Quantifique a concentração de proteína no tecido lysate usando reagente Bradford.
Para isso, meça o OD da amostra em 595 nanômetros e extrapolá-lo usando um gráfico padrão, como mostrado nesta tela. Seguindo a quantificação da proteína, execute 10 microgramas de tecido lysate em gel 12%SDS-PAGE para verificar a qualidade dos lises. O primeiro passo na digestão em solução envolve a redução de ligações de dissulfeto, utilizando TCEP.
Após a adição de TCEP, incubar o conteúdo do tubo por uma hora a 37 graus Celsius. O próximo passo envolve a alquilação para evitar que as ligações de dissulfeto reduzidas se re formem. Adicione um agente alquilante como iodoacetamida e incubar o tubo no escuro por 10 minutos.
Após a incubação, diminua a concentração final de ureia para menos de um molar diluindo com quatro a oito volumes de tampão de diluição. Neste ponto, é aconselhável verificar o pH. O próximo passo envolve a adição de trippsina ao tubo, e incubar o tubo durante a noite para uma digestão eficiente.
No dia seguinte, seque os peptídeos digeridos em um concentrador de vácuo, e prossiga para desalamento. Para realizar a desalar de peptídeos, use dicas de palco C18. Ative a ponta do estágio C18 adicionando 50 microliter de metanol, centrifugar a ponta a 1000 G por dois minutos.
Agora, adicione 50 microliter de acetonitrila em ácido formômico de 0,1% para lavar a ponta do palco, e novamente, centrifugar a ponta. Reconstitua os peptídeos digeridos secos em 50 microliter de ácido fórmico de 0,1%. Adicione os peptídeos reconstituídos na ponta do palco ativado.
Repita este passo pelo menos quatro vezes. Para lavar a amostra, adicione 50 microliter de ácido fórmico de 0,1% e repita a etapa de centrifugação. Para a eluição de peptídeos, adicione 50 microliter de 40% ACN em ácido fórmico de 0,1% e passe-o pela ponta do estágio por centrifugação.
Repita esta etapa com 50% e 60% ACN em ácido fórmico de 0,1% e colete o filtrado em um tubo fresco. Seque os peptídeos desalados usando um concentrador de vácuo. Antes da execução de LC-MS-MS, quantifique os peptídeos usando o método Scopes.
Para isso, carregue dois microliters de amostra reconstituída no poço de uma placa de microdrop, e meça a absorvância em 205 nanômetros e 280 nanômetros. Calcule a concentração da fórmula descrita neste slide. Uma vez que os peptídeos desalados são secos, eles estão prontos para quantificação baseada em rótulos.
Para rotulagem iTRAQ, os peptídeos secos devem ser reconstituídos em 20 microliter de tampão de dissolução, fornecido no kit de rotulagem iTRAQ. Reconstitua os rótulos adicionando etanol do frasco fornecido no kit e misture bem. É aconselhável que todas as etapas sejam executadas de acordo com as instruções do fabricante.
Adicione os rótulos iTRAQ misturados homogêneo aos seus respectivos tubos e permita que a reação de rotulagem ocorra. No final da reação, sacie qualquer rótulo desvinculado no tubo adicionando água de grau MS e incubar por meia hora a uma hora. Agora, transfira todo o conteúdo rotulado para um único tubo e seque os peptídeos rotulados.
Após reconstituir as amostras em ácido fórmico de 0,1%, abra o autosampler de NanoLC e coloque as amostras dentro do autosampler. Uma vez que as amostras tenham sido colocadas no autosampler, é importante definir os parâmetros certos para cromatografia líquida e espectrometria de massa. Aqui, descrevemos os parâmetros tanto para a quantitação sem rótulos quanto para quantificação baseada em iTRAQ usando LC-MS.
Em caso de quantitação sem rótulo, um gradiente de 120 minutos foi usado como uma única amostra não fractionada está sendo injetado. Essa duração pode ser aumentada ou diminuída com base na complexidade da amostra. Neste experimento, foi definido um fluxo de 300 nanoliter por minuto com o seguinte gradiente para solução B, que é 80% de acetonitrilo em ácido fórmico de 1%, neste caso.
Da mesma forma, podemos definir um gradiente para um experimento iTRAQ. Uma vez que as amostras não são fractionadas, um gradiente de 90 minutos foi usado. Os parâmetros de MS para quantificação sem rótulos, bem como quantificação baseada em etiquetas iTRAQ, podem ser vistos aqui.
O primeiro passo envolve definir o modo de aplicativo clicando nos parâmetros globais. Selecione o modo peptídeo e defina a duração do método de acordo com o gradiente LC que está sendo usado. Defina os parâmetros de varredura para o experimento.
Ao clicar na opção MS-OT, os parâmetros ficam visíveis. O tipo de uso do detector está definido como Orbitrap. A outra opção disponível neste instrumento inclui uma armadilha de íons.
A resolução foi definida para 60.000, e pode-se escolher entre diferentes opções disponíveis, dependendo da necessidade e do tipo do experimento. O alcance de massa é normal, e o intervalo de varredura é definido de 375 a 1700. Os outros parâmetros são padrão para o aplicativo MS.
O limiar de intensidade foi definido, e o estado de carga definido na faixa de dois a seis. A exclusão dinâmica foi definida para 40 segundos, e a tolerância em massa foi mantida em 10. O próximo conjunto de parâmetros inclui os parâmetros MS-MS.
O modo de isolamento foi selecionado com quadrupole, conjunto de janelas de isolamento em dois, deslocamento de isolamento foi definido para fora, e o tipo de ativação é geralmente HCD para o experimento de proteômica. A energia de colisão pode ser fixada ou pode ser assistida. Amostras rotuladas requerem maiores energias de colisão, portanto, para experimentos iTRAQ, é aconselhável que a energia de colisão seja definida para 35, enquanto para experimentos LFQ, pode ser definida como 30.
O tipo de detector usado aqui é o Orbitrap. O modo de alcance de varredura será automático. Os outros parâmetros são padrão para experimentos iTRAQ e experimento quantitativo sem rótulos.
Clicar no resumo fornecerá uma visão geral de todos os parâmetros LC e MS usados para o experimento. Você pode dar uma olhada em cada parâmetro e fazer a revisão. Uma vez feito isso, clique no arquivo e salve-o como um arquivo de método.
Uma vez salvo, então você pode executar o método, e você terá os arquivos brutos. E então esses arquivos brutos podem ser analisados usando o software Proteome Discoverer. Este número mostra a cobertura sequencial da BSA em três réplicas técnicas, o que é de 91% nas três réplicas.
Isso indica a reprodutibilidade do instrumento. Agora, este número mostra a uniformidade no número de fósforos espectrais de peptídeos, peptídeos e proteínas identificadas em três diferentes amostras biológicas, o que, mais uma vez, dá uma ideia sobre a reprodutibilidade do instrumento. Aqui, o diagrama de Venn representa as proteínas comuns e exclusivas identificadas em três amostras diferentes em experimentos sem rótulos e experimentos baseados em rótulos.
Estes gráficos de barras mostram o número de fósforos espectrais de peptídeos, grupos de peptídeos, proteínas totais, grupos proteicos e número de proteínas após 1%FDR, identificados no experimento LFQ e iTRAQ. A proteômica tecidual de amostras biológicas nos permite explorar novos biomarcadores potenciais associados a diferentes estágios de progressão da doença. O protocolo descrito para análise proteômica quantitativa tecidual fornece dados de boa cobertura reprodutíveis.
O uso de réplicas técnicas garante boa reprodutibilidade, mesmo que as amostras sejam executadas em diferentes pontos de tempo. Aqui, mostramos a análise de amostras de tecido usando dois métodos de quantitação: proteômica sem rótulos e baseada em rótulos. A seleção de técnicas proteômicas quantitativas pode depender do número de amostras, disponibilidade de plataformas de MS e questão biológica a ser abordada.
