Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da gastroenterologia sobre o impacto dos membros da microbiota, especificamente os do gênero Helicobacter, sobre inflamação e câncer. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o estudo da infecção por Helicobacter e seu impacto no estômago em condições fisiológicas. As implicações dessa técnica se estendem para o desenvolvimento de terapias para a prevenção ou eliminação da infecção por Helicobacter ou suas consequências, incluindo antibióticos, medicamentos ou vacinas.
Esses métodos fornecem insights específicos para a patogênese da infecção por Helicobacter. No entanto, várias das técnicas podem ser adaptadas ao estudo de outros patógenos gastrointestinais. Geralmente, indivíduos novos neste método lutarão com a preparação de um inóculo bacteriano capaz de estabelecer uma infecção em camundongos.
É imperativo que os isolados helicobacter sejam cepas colonizadoras de camundongos que não sofreram subcultura extensiva in vitro. Além disso, deve ser registrado o número de subculturas in vitro para essas cepas. Adicione suspensões bacterianas a tubos de poliestireno de 15 mililitros e use um laço plástico para transferir uma gota de 10 a 20 micliter de cada cultura para lâminas individuais de microscópio de vidro.
Em seguida, avalie a viabilidade e a motilidade das bactérias sob microscopia de contraste de fase a uma ampliação 100 vezes. Só use o h.pylori inocula se a maioria das bactérias tiver uma forma bacilar. H.felis inocula deve conter principalmente bactérias em forma de helicoidal.
E carregar o inocula em seringas individuais, descartáveis, de um mililitro. Equipar cada seringa com uma agulha de calibre 23, e use filme plástico de parafina para fixar um cateter descartável de polietileno em cada agulha. Em seguida, contenha manualmente um rato específico de seis a oito semanas sem patógenos e sem helicobacter pelo pescoço e cauda, e insira um cateter no centro da mandíbula aberta.
Guie o cateter em uma caudal em direção ao esôfago, estendendo o pescoço do mouse para permitir a facilidade de acesso ao estômago através do esôfago e longe da traqueia até que a maioria ou todo o cateter não esteja mais visível e uma resistência seja sentida. Em seguida, entregue pelo menos uma vez 10 para a quinta bactéria para garantir uma colonização ideal e patologia da doença. No final do experimento, use uma tesoura fina e curva para abrir a cavidade abdominal para excisão do estômago.
Corte o estômago ao longo da curvatura maior, e lave suavemente o órgão duas vezes em um tubo de 50 mililitros de PBS fresco por lavagem para remover qualquer alimento residual. Após a segunda lavagem, coloque o tecido em uma placa de Petri de plástico de seis centímetros para registrar o peso molhado. Depois de achatar o estômago, bissecto a amostra sagitaralmente em dois fragmentos de tecido iguais compreendendo as regiões de antrum, corpo e forestomach não glandular.
Remova a região não glandular e pese metade de cada estômago antes de armazenar o pedaço de tecido na solução apropriada para a análise planejada a jusante. Adicione a outra metade do tecido estomacal a um tubo cônico de 15 mililitros contendo 10% de formalina, achatando os tecidos contra as laterais superiores dos tubos após 10 segundos. Quando os tecidos se tornarem afixados nas paredes do tubo, replmere as amostras na formalina por pelo menos 24 horas.
Para contar o número de H.pylori viável no estômago pós-infecção, homogeneize amostras estomacais armazenadas em BHI, e realize diluições seriais duplicadas dos homogeneados gástricos resultantes em caldo fresco e estéril. Divida o ágar de sangue de cavalo pré-seco, ou HBA, placas complementadas com antibióticos adicionais em três ou quatro segmentos, e, usando uma adaptação da técnica Miles e Misra, adicione de 10 a 100 microliters de cada diluição homogênea do estômago em um segmento de cada placa de ágar. Espalhe os homogeneizadores com laços plásticos estéreis e deixe as placas secarem.
Em seguida, coloque as placas em posição invertida em potes de gás anaerobe contendo uma placa de água petri e um pacote de gás. Em seguida, incubar os frascos a 37 graus Celsius por quatro a sete dias. Quando as colônias podem ser observadas, enumerar os segmentos contendo entre 10 e 100 colônias isoladas.
Após a eutanásia, o estômago é colhido dos animais e pesado. A região não glandular é removida, e o estômago é dividido em duas metades iguais que compreendem o antrum e o corpo. A colonização bem sucedida é tipicamente confirmada pela realização de contagem viável e enumeração subsequente de colônias individuais de homogeneizadores gástricos listrados em placas de HBA.
Note que a presença de bactérias contaminantes da microbiota gástrica do camundongo ou um grande número de colônias H.pylori pode complicar a enumeração das CFUs H.pylori. Alternativamente, o PCR pode ser empregado para verificar a infecção usando primers validados específicos direcionados a uma região de par de 325 bases dos genes H.felis e H.pylori ureB. Neste experimento representativo, os camundongos C57 Black-6 apresentaram sinais moderados de inflamação, incluindo hiperplasia e atrofia da glândula aos seis meses após a infecção com H.felis, bem como infiltração celular da submucosa.
Inflamação mais grave é observada em camundongos nocautes ao mesmo tempo, com a presença adicional de folículos linfoides observados nas proximidades dos infiltrados celulares. As bactérias H.felis também podem ser visualizadas em seções manchadas de Giemsa de tecido estomacal infectado. Após este procedimento, outros métodos como PCR quantitativo, imunohistoquímica ou imunofluorescência podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre os tipos de respostas do hospedeiro induzidas durante a infecção por Helicobacter.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da microbiologia e gastroenterologia explorarem o papel causador de Helicobacter pylori na doença estomacal em humanos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como infectar camundongos com espécies helicobacter e estudar a patologia associada à infecção. Não se esqueça que as cepas de Helicobacter utilizadas neste protocolo são infecciosas e, portanto, os procedimentos padrão de biossegurança devem ser sempre seguidos enquanto trabalham com essas bactérias.
