Este protocolo é significativo, pois permite estudar pela primeira vez o efeito de uma espécie bacteriana em células do sistema nervoso entérico. Como o sistema nervoso entérico não é facilmente acessível, este modelo permite estudar o efeito do microbioma intestinal nas células do sistema nervoso entérico. No futuro, esse modelo pode ser usado para ver como o microbioma intestinal de pacientes doentes afeta células do sistema nervoso entérico, por exemplo, na doença de Parkinson.
Um possível objetivo futuro seria conectar esse modelo a outros modelos de órgão sobre chip para construir um modelo representativo do eixo intestino-cérebro. A demonstração visual dessa técnica é fundamental, pois o protocolo inclui muitas etapas e cada etapa é crucial para a realização bem-sucedida desse modelo. Quem demonstrará esse procedimento será Catherine Sedrani, doutoranda do Laboratório de Ecologia de Sistemas.
Para começar, aperte os parafusos, prendendo as partes superior e inferior da braçadeira, e transfira a tampa de policarbonato inferior revestida e seca da placa de Petri quadrada para o topo da base da braçadeira segurando os quatro parafusos no canto da tampa. Use pinças estéreis para posicionar a junta da câmara epitelial com a membrana voltada para cima na tampa de policarbonato. Alinhe a junta e a tampa com parafusos, garantindo que as portas de entrada e saída do canto estejam alinhadas com as aberturas da junta.
Coloque a junta de sanduíche em cima da junta de colágeno com o lado superior voltado para cima. E, em seguida, coloque a tampa superior de policarbonato em cima da junta do sanduíche. Certifique-se de que as farpas na tampa da braçadeira estejam alinhadas com a entrada e a abertura de saída dos conjuntos de membrana e que os parafusos da tampa inferior se encaixem na abertura da tampa superior.
Para fechar o dispositivo, coloque a tampa da braçadeira em cima da tampa de policarbonato e feche as travas. Para o escorvamento das linhas de tubulação, insira as agulhas de aeração com filtros no septo de cada frasco de entrada e saída. Usando pinças estéreis limpas, insira as agulhas de 120 milímetros nos frascos de soro de 250 milímetros e as agulhas de 80 milímetros nos frascos de soro de 15 milímetros.
Insira as agulhas de 40 milímetros no final de cada linha de tubulação em um frasco de soro de saída. As agulhas de 40 milímetros das linhas de tubos epiteliais e neuronais são conectadas ao mesmo frasco de saída para descarte médio. A linha do tubo bacteriano vai para o segundo frasco de saída.
Insira as linhas de tubulação da bomba nos da bomba. Ajuste a bomba peristáltica para direcionar a mídia da entrada para a garrafa de saída a uma velocidade de cinco RPM e pressione o botão de partida para ligar a bomba. Certifique-se de que as torneiras de três vias das linhas de tubulação estejam todas abertas.
Uma vez que a mídia está caindo nas garrafas de saída, certifique-se de que nenhum vazamento ou bolhas de ar estejam presentes nas linhas de tubulação e pontos de conexão. Quando todas as linhas de tubo caírem nas garrafas de saída, defina a taxa de fluxo para duas RPM para conectar o dispositivo inicial. Para conectar uma linha, feche as válvulas de torneira de três vias, começando pelo lado de saída.
Desconecte a tubulação curta do conector de isca fêmea e conecte-a à porta de saída do dispositivo empurrando a tubulação sobre a farpa. Para uma conexão segura e sem vazamentos, empurre a tubulação até o fim sobre o conector, garantindo que ela entre em contato com a tampa. Abra a torneira quando uma linha estiver completamente conectada ao dispositivo.
Ajuste a vazão da bomba para duas RPM e aumente a velocidade da bomba para um máximo de 2,5 RPM para evitar vazamentos devido ao acúmulo de pressão. Deixe a bomba apertar as câmaras. Reduza a velocidade da bomba para 0,5 RPM quando todas as câmaras estiverem preenchidas com o meio de cultura celular e não permanecerem bolhas no dispositivo.
Para as células epiteliais, separar as células Caco-2 do frasco com EDTA de tripsina. Suspenda-os novamente em RPMI 1640 mais 10% FBS e conte-os em um contador de células de Neubauer usando o ensaio de exclusão de azul de tripano. Centrifugar a suspensão das células Caco-2 por três minutos a 300G e descartar o sobrenadante para remover as viagens restantes em EDTA.
Ressuspender as células Caco-2 em RPMI 1640 mais 10% FBS para obter uma suspensão de 0,35 milhões de células por mililitro. Transfira 1,5 mililitros da suspensão celular Caco-2 para uma seringa estéril de dois mililitros e remova as bolhas de ar restantes na seringa. Feche as válvulas de torneira de três vias na tubulação das câmaras bacteriana e neuronal e desconecte a tubulação da bomba removendo os com a respectiva tubulação do rotor.
Abra a tampa da válvula da torneira da tubulação de entrada que leva à câmara epitelial e gire a válvula para redirecionar o fluxo médio do dispositivo para o conector aberto. Deixe o meio fluir até que uma gota do meio apareça na extremidade aberta da válvula de parada. Insira a seringa com células epiteliais no conector aberto usando o método de conexão drop-drop para evitar a introdução de bolhas de ar durante a inserção.
Gire a válvula da torneira para interromper o fluxo do meio a partir do frasco de entrada e permitir o fluxo da seringa conectada para o dispositivo inicial. Desconecte a câmara epitelial da bomba e pressione lentamente a seringa para inocular a câmara epitelial com 1,5 mililitros de suspensão celular. Feche a válvula da torneira de saída e desconecte a seringa.
Feche a extremidade aberta da torneira com a tampa e mantenha a câmara fechada por pelo menos duas horas. Enquanto isso, inocular as células neuronais. Depois de remover o dispositivo da incubadora e remover as linhas de tubulação, abra lentamente a braçadeira e remova a tampa.
Retire a tampa superior de policarbonato com cuidado. Recolha o meio num tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros e coloque-o no gelo. Remova suavemente a junta do sanduíche, enquanto recolhe o meio da câmara epitelial sem tocar na camada celular.
Coloque a junta de sanduíche em uma placa de Petri quadrada e adicione solução estéril de cloreto de sódio a 0,9% e água à câmara bacteriana até que a câmara esteja totalmente coberta. Remova lentamente a junta de colágeno enquanto coleta o meio da câmara neuronal. Depois de transferir o meio para um tubo de microcentrífuga, coloque os tubos no gelo.
Coloque a junta de colágeno em um prato quadrado e adicione suavemente alguns mililitros de PBS à camada de Caco-2 até que a camada de células esteja totalmente coberta. Coloque a tampa inferior de policarbonato em uma placa de Petri quadrada e adicione suavemente aproximadamente dois mililitros de PBS sobre as células neuronais para que elas não sequem durante o processo de amostragem. Centrifugar o tubo de meio por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Depois de transferir os sobrenadantes de cada tubo para um novo tubo de microcentrífuga, coloque-o em gelo seco imediatamente. A contagem de UFC foi avaliada para duas configurações iniciais diferentes do dispositivo. L.reuteri co-cultivada com Caco-2 e L.reuteri no dispositivo de crosstalk microbiano humano.
Em ambos os setups, as contagens de UFC foram significativamente diferentes do inóculo HuMix e das células colhidas, indicando o crescimento das células bacterianas dentro do dispositivo inicial. Para avaliar se a cultura dos neurônios entéricos no dispositivo altera o fenótipo celular, sua morfologia macroscópica foi observada usando um microscópio de contraste de fase invertida. O estabelecimento de uma rede neuronal confluente indicou que as células se aderiram bem à tampa de policarbonato dos dispositivos revestidos.
A borda entre a rede neuronal confluente e a espiral delineada pela junta era claramente aparente. O potencial dos neuro-húmicos está em responder a questões que antes eram desafiadoras de abordar, relativas às interações entre o microbioma humano-intestino e o sistema nervoso entérico devido à falta de um modelo representativo.
