The authors have nothing to disclose.

1. Preparação de C. elegans embriões para Lapso de tempo Microscopia usando Microbeads <ol><li> Transferência de vermes adultos grávidas usando uma picareta verme (fio de platina) em uma gota de tampão M9 e limpar as bactérias pela primeira vigorosamente agitando e, em seguida, transferindo cada worm para uma queda adjacente de M9 usando um chicote do olho montada em uma picareta do dente / ponteira ou use um capilar de vidro aguçado. </li><li> Dilui-se a dispersão contendo as 20 uM esferas de poliestireno diâmetro de 10-vezes em tampão M9 (1 tampão G M9 contém 3 g de KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, e, depois de autoclavagem (20 min, 120 ° C), adicionar um adicional de 1 ml de uma solução 1 M 4 MgSO). </li><li> Adicione uma pipeta de boca a partir de qualquer tipo de capilar de vidro fina (por exemplo, ponto de fusão capilares pontuais ou capilares usados ​​para puxar as agulhas de injecção), cerca de um 0,5 m de comprimento pedaço de borracha, silicone ou material semelhante tubagem (de preferência transparente), A 200 ulponta da pipeta, a tampa de um tubo de PCR de 200 uL, de um filtro hidrofóbico de pequenas seringas (por exemplo., um 0,2-0,45 uM de tamanho de poro de 15-50 mm de diâmetro e de nylon, de PTFE ou material semelhante de filtro), e uma pipeta de 1000 ul ponta . Este tipo de boca pipeta garante que nenhum material biológico pode entrar em contacto com o experimentador. </li><li> Montar a pipeta através da inserção da ponta de uma pipeta de 200 uL com a ponta primeiro para o tubo e ligá-lo com a tampa de um tubo de PCR, que apresenta uma perfuração central que coincide com o diâmetro do capilar utilizado. Uma agulha furador ou preparação muito apontada pode ser usado para gerar a perfuração. </li><li> Desenhe um capilar fino e inseri-lo na perfuração. Inserir o filtro para a outra extremidade do tubo e inserir uma ponta de pipeta 1000 uL como peça de boca (Figura 1). </li><li> Dissecar adultos grávidas cortando transversalmente vermes na vulva com uma lâmina de barbear limpa ou bisturi. NOTA: Geralmente, muitos embriões e seráxpulsed após o corte. No entanto, se houver necessidade de embriões, às vezes eles têm que ser liberados a partir da carcaça usando um chicote do olho ou a agulha pontiaguda. </li><li> Pipetar uma gota da dispersão de bolhas de polistireno diluída (~ 4 mL) para uma tampa de vidro de 24x60 mm e em embriões de transferência de gota utilizando esta pipeta boca. </li><li> Com cuidado, coloque um pequeno (por exemplo, 18x18 ou 20x20 mm) tampa de vidro no topo da gota e certifique-se a queda foi totalmente se espalhar. NOTA: A queda também deve ser pequeno o suficiente para não tocar as bordas da tampa de vidro pequeno. </li><li> Selar a montagem com vaselina liquefeito. Adicionar uma gota de óleo de imersão no lado 24x60 lamínula mm e prossiga para a seção &quot;Lapso de tempo Microscopia &#39;. </li></ol> 2. Preparação de Adulto C. elegans Animais de Lapso de tempo Microscopia usando Nanobeads NOTA: Em geral, o protocolo para a montagem de animais adultos, é uma adaptação do protocolo de ref. 18.Com este protocolo, é possível a realização de microscopia confocal de lapso de tempo de longa duração de animais adultos. <ol><li> Prepara-se uma 1,5% (w / v) de solução de agarose em tampão M9, fervura (1 min, 100 ° C em banho de água ou de microondas). A utilização de maiores concentrações de agarose não é recomendado uma vez que isto pode levar a extrusão do intestino e / ou partes da gónada. </li><li> Atenha-se 2-3 camadas de fita em duas lâminas de microscópio cada. Coloque um slide sem fita entre os dois slides com fita. </li><li> Utilizar uma ponta de pipeta e colocar uma gota da solução de agarose quente no centro da lâmina secundária. Colocar rapidamente uma outra corrediça para a gota de modo que seja suportada pelas camadas de fita de cada lado. Isto irá criar uma almofada redonda e agar apartamento de cerca de 10 mm de diâmetro. </li><li> Colocar uma gota de solução de esferas 100 nm (não diluído, o qual é de 2,6% (w / v)) para a almofada. Transferir 1-10 vermes adultos limpas na gota com uma picareta worm. Selo com 18x18 mm e tampa de vidro de vaselina como explicado no ProtOCOL 1. </li></ol> Microscopia 3. Time-lapse <ol><li> Coloque uma gota de óleo de imersão sobre a lâmina de microscópio ou o sanduíche tampa de vidro. Use campo claro a baixa ampliação (5x ou 10x lentes) para localizar a amostra. NOTA: Limite a exposição à luz azul, tanto quanto possível (em especial para C. elegans embriões), por exemplo, não use microscopia de epi-fluorescência para encontrar / concentrar a amostra, mas usar brightfield vez. </li><li> Mude a maior ampliação (40x ou 60x objetivos), levar a amostra em foco (ou plano central ou planos superiores / inferiores da amostra, dependendo do software de aquisição). </li><li> Defina os intervalos de amostragem para 30 aviões no 1 um espaçamento registrados a cada 1min. No caso de um palco xyz XY ou automatizada está disponível, vários pontos podem ser gravados em uma única sessão. Mudar para imagens de fluorescência e verifique o foco novamente. NOTA: Tente evitar o uso poderes alta de laser, em vez usar um pouco mais longos tempos de exposiçãoa muito baixas intensidades. Medida imagens adquiridas de imediato, quer no programa de aquisição de imagem ou em ImageJ para evitar a saturação, que corta a dinâmica variam e também significa a exposição à radiação excessiva. </li><li> Comece a gravar a série de lapso de tempo. NOTA: Para excluir análise de artefatos, comece com intervalos longos (3-10 min) Tempo entre a digitalização de amostra e aumentar gradualmente a amostragem temporal para os intervalos adequados. Tempo de desenvolvimento, bem como os pontos finais em ambos os casos deve ser semelhante ao realizar uma análise estatística. Além disso, é muitas vezes necessário para avaliar as taxas de sobrevivência e fototoxicidade. Portanto, recuperar espécime da montada após a microscopia de lapso de tempo a longo prazo e verificar se eles continuam a desenvolver / live. </li></ol> 4. Reconstruir um modelo celular Forma 3D com IMOD NOTA: O software IMOD está disponível a partir da página web IMOD: http://bio3d.colorado.edu/imod/. A instalação do software é descreverd lá. Quando utilizar o Windows OS, um conjunto de ferramentas Unix tem de ser instalado, que também pode ser encontrado como um pacote na página IMOD. Além disso, há uma introdução 3dmod excelentemente compilado disponível na página IMOD (http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html). <ol><li> Abra o shell do Unix e digite &quot;imod&quot;. A janela IMOD será aberta. Selecione o arquivo com os dados brutos (idealmente um tif empilhados ou semelhantes), de que para gerar um modelo 3D. </li><li> Localize a parte inferior e superior dos objetos na janela de Zap usando a janela de informações (up &amp; down ferramenta de rolagem). </li><li> Comece traçando os contornos celulares. Importante, garantir que cada célula é um objeto. Comece com o plano superior de cada célula e criar o primeiro contorno lá usando a janela de informações. Role para baixo na z e criar um novo contorno para cada plano z. </li><li> Faça o mesmo para o maior número de células conforme necessário para modelar em 3D. Não se esqueça de criar um novo objeto ao iniciar com uma nova célula. NOTA: Há muitas maneiras diferentes para o rastreamento de contorno e vários plugins votos. Por favor, visite o site IMOD e tutoriais on-line para obter detalhes. No caso mostrado, a configuração padrão foi usado. </li><li> Abra o &quot;Model View&quot; janela para inspecionar os objetos e seus contornos. </li><li> No &quot;Model View&quot; da barra de ferramentas escolher &quot;Editar&quot; - &quot;Objetos&quot;. A janela de edição respectivo será aberta. </li><li> Para modelar células como objectos cheios e fechados, escolha &quot;malha&quot; como &quot;Desenhar tipo de dados&quot; e &quot;Fill&quot; como &quot;estilo do desenho&quot;. Clique em &quot;engrenagens&quot; na seleção de rolagem no canto inferior esquerdo da janela. Marque a opção &quot;Cap&quot; na seleção no canto inferior direito. Confira como muitos objetos, conforme necessário e clique em &quot;Malha All&quot;. O programa irá gerar objetos sólidos das pilhas de contornos. O factor z-amostragem pode ser ajustado mudando &quot;Z-escala&quot; na janela &quot;Ver&quot;. </li><li> Move / girar o objec 3Dt (&quot;Edit&quot; - &quot;Ver&quot;) e salvar instantâneos ou filmes (&quot;File&quot; - &quot;Pressão Tiff como ...&quot; ou &quot;Movie / Montagem&quot;). </li></ol> 5. Rastreamento fluorescente Estruturas rotuladas com Endrov NOTA: De modo a rastrear restos de divisão celular, utilizar uma estirpe com um marcador de membrana nuclear ou plasma para a identificação de células (por exemplo, H2B, Ph-PLC-d1) e um marcador remanescente divisão celular (por exemplo, NMy-2, ZEN-4 ). O marcador nuclear ou de membrana de plasma é importante para determinar qual célula herda o remanescente a divisão celular. <ol><li> Para o carregamento rápido e facilidade de utilização, os dados em bruto tem que ser convertido para um ficheiro TIFF (por exemplo, em ImageJ). Em seguida, abra Endrov e carregar o arquivo a ser analisado, escolhendo a opção &quot;Carregar arquivo&quot; no menu arquivo. Clique no ícone &quot;visualizador 2D&quot; na barra de ferramentas. </li><li> Ajuste do histograma, clicando no ícone &quot;gama Fit&quot; (o ícone azul no canto inferior direitoda tela Endrov). Defina a resolução XYZ, indo para &quot;Data&quot; - &quot;filename&quot; - &quot;ImageSet&quot; - &quot;Channel&quot; - &quot;Definir XYZ-resolução&quot;. Tipo de valores para X, Y, e Z, por exemplo, 5, 5, 1 se resolução X e Y é de 0,2 uM e 1 uM cada amostra em Z. </li><li> Para anotar os núcleos, passar para o plano de interesse e clique em &quot;Visualizador 2D&quot;. Selecione &quot;Lineage&quot; no menu suspenso e escolha &quot;New linhagem&quot;. </li><li> Clicando e arrastando no núcleo, que pode ser marcado. Para nomear o núcleo, clique com botão direito e escolha &quot;Renomear partícula&quot; no menu suspenso. Para aumentar ou diminuir o diâmetro do círculo, arraste o ícone de seta que aparece no lado esquerdo do círculo marcado. Para marcar o plano central do núcleo, clique no ícone à direita. Quando se utiliza um marcador de membrana plasmática, uma grande esfera pode ser desenhada que vai cobrir a maior parte da célula. </li><li> Para continuar no tempo e no avião, escolher o &quot;Frame&quot; e &quot;Z&quot;opções na barra de ferramentas inferior. Depois de passar para o próximo ponto de tempo, ajustar a posição ou o tamanho do círculo que marca o núcleo em conformidade. Repita este procedimento até a célula se divide rastreados. </li><li> Quando há uma divisão celular, marque os núcleos filhos e mudar para &quot;viewer Lineage&quot;. Isso pode ser selecionado clicando no ícone &quot;Windows&quot; na barra de ferramentas superior. Marcar todos os três núcleos simultaneamente, ir até a opção &quot;Lineage&quot; na barra de ferramentas superior e selecione &quot;pai Associado&quot;. </li><li> Quando o rastreamento de pilha for concluído, mude para a marcação do remanescente divisão celular para rastreamento de canal. Para mudar de canal, clique no nome do arquivo no canto inferior esquerdo da barra de ferramentas. O remanescente da divisão celular (ou qualquer outra estrutura) pode ser controlada como acima descrito para o núcleo. </li><li> Ao retornar para o software depois de fechar, é necessário ir a &quot;2D Viewer&quot; - &quot;Lineage&quot; - &quot;Editar&quot; e clique sobre o número linhagem que será editada. </li&gt; </ol> 6. Analisando Cortical actomiosina fluxo com PIVlab NOTA: PIVlab é um software disponível gratuitamente a partir de: http://pivlab.blogspot.de/; ele pode ser chamado de dentro do ambiente de linha de comando Matlab digitando PIVlab_GUI. Ao trabalhar com PIVlab, recomenda-se para salvar a série de imagens em uma pasta separada. <ol><li> Inicie uma nova sessão do menu &quot;Arquivo&quot;. Coloque os arquivos de imagem clicando no botão &quot;Carregar imagens&quot;. </li><li> Selecione o estilo de seqüenciamento 1-2, 2-3, ... e navegue até o diretório que contém a sequência de imagens desejadas. Selecione as imagens e clique no botão &quot;Adicionar&quot; e importação. </li><li> Vá em &quot;configurações de Análises&quot; e selecione &quot;Exclusões (ROI), Máscara&quot;. Como alternativa, pressione &quot;Ctrl + E&quot;. Use o botão &quot;Empate máscara (s) para o quadro atual&quot; para inativar a parte indesejada da imagem / s (ou seja, fora da área do embrião). </li><li> Selecione &quot;Configurações PIV&quot; from o menu &quot;configurações Análises&quot;. Como alternativa, pressione &quot;Ctrl + S&quot;. Escolha &quot;FFT janela deformação&quot;, como o algoritmo PIV desejado. NOTA: transformação de Fourier rápida (FFT) reduz o custo computacional, mas é recomendado apenas o sinal é bem acima do ruído e se o deslocamento das partículas estudadas não excede metade da área de passagem analisado (ver 6.5). </li><li> Entre os seguintes valores para as três passagens, que são a área de interrogação para a correlação cruzada entre a intensidade de imagens subsequentes: Passe 1: Interrogação área de 64 pixels, com uma fase de passagem 32. 2: Interrogação área de 32 elementos de imagem com um passo de 16 . Selecione &quot;linear&quot; da deformação Janela menu suspenso. Escolha forma de 2 * 3 pontos Gaussian para sub-pixel estimativa deslocamento. </li><li> Selecione &quot;Analisar!&quot; a partir do menu Análise e use o botão &quot;Analisar todos os quadros&quot; para começar uma análise. </li><li> Para o processamento pós selecione &quot;Vector validação&quot; de &quot;; Menu de Pós-processamento &quot;e definir o limite de filtro de desvio padrão (Stdev) a 7 e se aplicam a todos os quadros. </li><li> Escolha &quot;derive parâmetros / modificar dados&quot; do menu &quot;Plot&quot;. Selecione &quot;Vectors [px / frame]&quot; do menu suspenso. Ajuste a suavidade de vetores e filtro passa alta e se aplicam a todos os quadros. </li><li> Para calcular vetores médios de todos os quadros, definir os quadros &quot;usado&quot; para 1: final e clique no botão &quot;Calcular vetores médios&quot;. </li></ol>

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+torque+generation+by+the+actomyosin+cell+cortex+drives+left-right+symmetry+breaking.">Active torque generation by the actomyosin cell cortex drives left-right symmetry breaking.</a> Elife. 3, e04165 (2014).</li><li>Kaletta, T., Schnabel, H., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binary+specification+of+the+embryonic+lineage+in+Caenorhabditis+elegans.">Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 390 (6657), 294-298 (1997).</li><li>Schnabel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cell+sorting+in+the+C.+elegans+embryo+defines+a+new+mechanism+for+pattern+formation.">Global cell sorting in the C. elegans embryo defines a new mechanism for pattern formation.</a> Dev. Biol. 294 (2), 418-431 (2006).</li><li>Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lineaging+of+fluorescently-labeled+Caenorhabditis+elegans+embryos+with+StarryNite+and+AceTree.">The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1468-1476 (2006).</li><li>Giurumescu, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+semi-automated+analysis+of+morphogenesis+with+single-cell+resolution+in+complex+embryos.">Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos.</a> Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).</li><li>Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndecan+defines+precise+spindle+orientation+by+modulating+Wnt+signaling+in+C.+elegans.">Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans.</a> Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).</li><li>Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+normal+embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+4D+microscope:+variability+of+development+and+regional+specification.">Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification.</a> Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).</li></ol>

Research in the lab of CP is funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (EXC 115; FOR 1756) and the LOEWE Research Cluster Ubiquitin Networks. CP is further supported by the European Union Framework Program 7 (Marie Curie Actions Project 326632).

Através de rastreamento em desenvolvimento objecto, em particular de seguimento nuclear, tem sido possível para elucidar os mecanismos centrais de padronização de C. elegans embriogênese 1,23,24. Expandindo essa estratégia para um maior rendimento, tem sido recentemente possível descobrir regras de padronização adicionais e propor um método para deduzir como padronização regras de novo 10. Para muitos mutantes, no entanto, os defeitos de padrões precisos aind...

Com as melhorias estáveis ​​de proteínas fluorescentes, engenharia de genoma, microscopia de luz, e soft e hardware de computador, agora é possível gravar desenvolvimento de muitos organismos modelo em sem precedentes resolução espácio-temporal. Isto permite aos investigadores fazer perguntas que não podem ser abordados anteriormente ou revisitar processos de desenvolvimento conhecidas, a fim de procurar os aspectos negligenciados. Este progresso tem suscitado o campo da biologia do desenvolvimento quantitativo, que visa transformar qualitativos, modelos informais em modelos quantitativos por meio de medições exaustivas e análises estatísticas. Células de rastreamento e estruturas subcelulares tornou possível derivar modelos quantitativos do desenvolvimento embrionário, atividade do sistema nervoso, ou a divisão celular 1-12. Ao rastrear restos de divisão celular durante o desenvolvimento precoce do C. elegans embrião, poderíamos recentemente revelam que eles seguem um aparelho de somdigitado caminho e constituem fatores de polarização importante 13,14. Aqui, os protocolos são apresentados que fazem biologia do desenvolvimento quantitativo aproxima acessível para os não-especialistas. O foco recai sobre três straight-forward, ferramentas livremente disponíveis, que são aplicáveis ​​em qualquer laboratório que tem acesso a microscopia confocal padrão e computadores. Estes incluem um protocolo para gerar formas celulares 3D, um protocolo para rastrear restos de divisão celular, e um protocolo para descrever quantitativamente dinâmica actomiosina corticais. O nemátodo C. elegans é usado como um caso exemplar, no entanto, os métodos e ferramentas discutidas aqui são adequadas para uma variedade de questões em outros modelos biológicos, por exemplo, as células cultivadas, explantes de tecido, Organóides ou esferóides, outros embriões, etc. Geralmente, algumas das análises mostrados aqui também pode ser realizada com a ferramenta aberta fonte populares ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html; ou FIJI, os &quot;baterias incluídas&quot; versão do ImageJ, http://fiji.sc/Fiji) para os quais muitos plugins para diferentes análises quantitativas estão disponíveis. No entanto, os programas aqui discutidos são projetados para resolver problemas específicos. Em primeiro lugar, IMOD, um processamento de imagem, modelagem e suite do display pode ser usado para as reconstruções 3D de cortes seriados de elétron ou microscopia de luz 15. IMOD também contém ferramentas para visualizar os dados 3D a partir de qualquer orientação. Em segundo lugar, Endrov, um programa Java projetado para executar análise de imagem, processamento de dados, e anotação de redes ou faixas (entre outros), com base em uma arquitetura de plugins extensa, com ImageJ compatibilidade de encaixe 16. Ele contém mais de 140 operações de processamento de imagem e uma interface de usuário extensível em que modelo e dados brutos são exibidos separadamente. Seu código fonte pode ser encontrada em https://github.com/mahogny/Endrov. Em terceiro lugar, PIVlab, um HAtlab ferramenta para partículas de imagem digital velocimetria que permite que o usuário quantitativa e qualitativamente analisar campos de fluxo de partícula 17. O uso deste programas requer uma licença MATLAB, que inclui a Imagem Processing Toolbox (http://mathworks.com). PIVlab é um programa desenhado para descrever quantitativamente o fluxo. Ele calcula a distribuição de velocidade, magnitude, vorticidade, divergência ou de cisalhamento dentro de pares de imagens ou séries. Para isso, cross-se correlaciona pequenas áreas de imagens (chamado de &quot;passes&quot; na seção de protocolo) de um par de imagens para derivar o deslocamento de partículas mais provável. Esta correlação cruzada produz uma matriz de correlação que pode ser analisada, no espaço de domínio de frequência ou utilizando qualquer correlação cruzada directa ou uma transformação rápida de Fourier (FFT), respectivamente. O equipamento utilizado é um microscópio invertido equipado com uma Nipkow (&#39;fiação&#39;) do disco, uma EMCCD, 488 e 561 nm padrão sólido-lasers de estado, e 20x ou 40x de ar ou 60x plano / Apochromat objectivos óleo ou água-de imersão. No entanto, é também possível realizar imagem de lapso de tempo com outras modalidades de imagiologia, por exemplo, ponto-, linha- ​​ou microscopia de varrimento de folha à base de laser, microscopia multi-fotão, bem como microscopia de epi-fluorescência combinado com desconvolução ou estruturada iluminação. A vantagem de utilizar um sistema de disco de Nipkow é a aquisição de imagem extremamente rápida, especialmente se um modo de fluxo contínuo (movimento contínuo e de varrimento do objecto na dimensão Z) está disponível. Além disso, para melhorar a resolução, um extensor de aumento de 1,5 vezes na parte dianteira do EMCCD pode ser usado.

<table><tbody><tr><td>Stereo microscope</td><td>Motic/VWR</td><td>OT4005S</td><td>Stereo microscope for dissection and mounting</td></tr><tr><td>Polybead Polystyrene Microspheres,&amp;nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>18329</td><td>Embryo mounting</td></tr><tr><td>20 &amp;micro;m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybead Polystyrene Microspheres,&amp;nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>876</td><td>Adult animal mounting</td></tr><tr><td>0.1 &amp;micro;m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>VWR</td><td>631-0902</td><td>Adult animal mounting</td></tr><tr><td>Cover glass 18x18 mm</td><td>VWR</td><td>631-1331</td><td>Embryo/adult mounting</td></tr><tr><td>Cover glass 24x60 mm</td><td>VWR</td><td>631-1339</td><td>Embryo mounting</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>VWR</td><td>233-5455</td><td>Embryo dissection</td></tr><tr><td>Silicone tubing</td><td>VWR</td><td>228-1501</td><td>Tubing for mouth pipette</td></tr><tr><td>30 mm PTFE membrane filter</td><td>NeoLab</td><td>Jul-01</td><td>Filter for mouth pipette</td></tr><tr><td>Capillary tubes</td><td>VWR</td><td>621-0003</td><td>Pipette tip for mouth pipette</td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Roth</td><td>E746.1</td><td>Embryo/adult mounting</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Roth</td><td>5210.5</td><td>Adult animal mounting</td></tr><tr><td>Potassium-di-hydrogenphosphate</td><td>Roth</td><td>P018.2</td><td>M9 buffer</td></tr><tr><td>Di-sodium- hydrogenphosphate</td><td>Roth</td><td>P030.2</td><td>M9 buffer</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Roth</td><td>3957.1</td><td>M9 buffer</td></tr><tr><td>VisiScope Spinning Disc Confocal System</td><td>Visitron Systems</td><td>n/a</td><td>Confocal microscopy</td></tr></tbody></table>

tracking and quantifying developmental processes in c. elegans using open-source tools

Quantitativamente capturar processos de desenvolvimento é crucial para derivar modelos mecanicistas e chave para identificar e descrever os fenótipos mutantes. Aqui são apresentados os protocolos para a preparação de embriões e adultos C. elegans animais para microscopia de lapso de tempo curto e longo prazo e métodos de rastreamento e quantificação dos processos de desenvolvimento. Os métodos apresentados são todos baseados em C. cepas elegans disponíveis a partir do Centro de Genética Caenorhabditis e no software de código aberto que pode ser facilmente implementado em qualquer laboratório independentemente do sistema de microscopia usado. A reconstrução de um modelo de célula-forma 3D usando o IMOD software de modelagem, o rastreamento manual de estruturas subcelulares fluorescente-etiquetados usando o multi-purpose programa de análise de imagem Endrov, e uma análise de fluxo contrátil cortical usando PIVlab (resolvida no tempo Velocimetry Digital Imagem de Partículas Ferramenta para MATLAB) são mostrados. Discute-se como esses métodos também podem ser implantados to quantitativamente capturar outros processos de desenvolvimento em diferentes modelos, por exemplo, rastreamento de linhagem celular e rastreamento, monitoramento do fluxo de vesícula.

Usando protocolos 2, 3, e 4, com intervalo de tempo de imagem das gônadas em selvagem tipo C. elegans adultos é realizada (OD58 estirpe (UNC-119 (ED3) III; ltIs38 [PAA1; pie-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + unc-119 (+)]), expressando um marcador de membrana a partir de um promotor da linha germinal ). Centrando-se no turno da gônada, um modelo 3D das células germinativas é gerada a partir dos dados de microscopia (Figura 2). Este modelo permite analisar alterações no tamanho da célula, enq...

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Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Rastreamento e quantificação processos de desenvolvimento em<em&gt; C. elegans</em&gt; Como usar as ferramentas de código aberto

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

tracking-quantifying-developmental-processes-c-elegans-using-open

Research

JoVE Journal

Biology

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

8.8K visualizações.  Goethe University. Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

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Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

Electrotaxis baseados em microfluídica para análise quantitativa On-demand de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Bioengenharia

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegans Acompanhamento e Medição do Comportamento

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

Neurociência

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

Microscopia de folha de luz isotrópica e análise de linhagem de células automatizadas para catalogar Caenorhabditis elegans Embryogenesis com resolução subcelular

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Biologia do Desenvolvimento

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of diverse human diseases. Worms are particularly well-suited for high-throughput genetic and drug screens to gain deeper insight into therapeutic targets and therapies by exploiting their fast development cycle, large brood size, short lifespan, microscopic transparency, low maintenance costs, robust suite of genomic tools, mutant repositories, and experimental methodologies to interrogate both in vivo and ex vivo physiology. Worm locomotor activity represents a particularly relevant phenotype that is frequently impaired in mitochondrial disease, which is highly heterogeneous in causes and manifestations but collectively shares an impaired capacity to produce cellular energy. While a suite of different methodologies may be used to interrogate worm behavior, these vary greatly in experimental costs, complexity, and utility for genomic or drug high-throughput screens. Here, the relative throughput, advantages, and limitations of 16 different activity analysis methodologies were compared that quantify nematode locomotion, thrashing, pharyngeal pumping, and/or chemotaxis in single worms or worm populations of C. elegans at different stages, ages, and experimental durations. Detailed protocols were demonstrated for two semi-automated methods to quantify nematode locomotor activity that represent novel applications of available software tools, namely, ZebraLab (a medium-throughput approach) and WormScan (a high-throughput approach). Data from applying these methods demonstrated similar degrees of reduced animal activity occurred at the L4 larval stage, and progressed in day 1 adults, in mitochondrial complex I disease (gas-1(fc21)) mutant worms relative to wild-type (N2 Bristol) C. elegans. This data validates the utility for these novel applications of using the ZebraLab or WormScan software tools to quantify worm locomotor activity efficiently and objectively, with variable capacity to support high-throughput drug screening on worm behavior in preclinical animal models of mitochondrial disease.

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

This study presents protocols for two semi-automated locomotor activity analysis approaches in C. elegans complex I disease gas-1(fc21) worms, namely, ZebraLab (a medium-throughput assay) and WormScan (a high-throughput assay) and provide comparative analysis among a wide array of research methods to quantify nematode behavior and integrated neuromuscular function.

Análise comparativa de métodos experimentais para quantificar a atividade animal em Caenorhabditis elegans Modelos de Doença Mitocondrial

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

Comportamento

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

Um método de imagem semi-alta-fonte e um kit de ferramentas de visualização de dados para analisar o desenvolvimento embrionário de C. elegans

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose para Imagem de cálcio a longo prazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imagem C. elegans Os embriões utilizando um microscópio de epifluorescência e Software de Código Aberto

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Biologia

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has proven to be an invaluable model organism in helping to tackle this challenge, from inspiring technological approaches,&#160;building the human brain connectome, to actually shedding light on the specific molecular drivers of basic functional patterns. The bulk of the behavioral studies in C. elegans have been performed on solid substrates. In liquid, animals exhibit behavioral patterns that include movement at a range of speeds in 3D, as well as partial body movements, such as a posterior curl without anterior shape change, which introduce new challenges for quantitation. The steps of a simple procedure, and use of a software that enables high-resolution analysis of C. elegans swim behavior, are presented here. The software, named CeleST, uses a specialized computer program that tracks multiple animals simultaneously and provides novel measures of C. elegans locomotion in liquid (swimming). The measures are mostly grounded in animal posture and based on mathematics used in computer vision and pattern recognition, without computational requirements for threshold cut-offs. The software tool can be used to both assess overall swimming prowess in hundreds of animals from combined small batch trials and to reveal novel phenotypes even in well-characterized genetic mutants. The preparation of specimens for analysis with CeleST is simple and low-tech, enabling wide adaptation by the scientific community. Use of the computational approach described here should therefore contribute to the greater understanding of behavior and behavioral circuits in the C. elegans model.

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

An efficient and simple methodology for computer-based analysis of nematode swimming behavior in liquid is described. The method requires little to no investment for C. elegans laboratories. The hardware used is standard, and the computer software for the behavioral analysis (CeleST) is an open source one.

Análise automatizada de<em&gt; C. elegans</em&gt; Comportamento Swim Usando CELEST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the health and fitness of the animals under study, one typically relies on motility readouts, such as the measurement of the number of body bends or the speed of movement. These measurements usually involve manual counting, making it challenging to obtain good statistical significance, as time and labor constraints often limit the number of animals in each experiment to 25 or less. Since high statistical power is necessary to obtain reproducible results and limit false positive and negative results when weak phenotypic effects are investigated, efforts have recently been made to develop automated protocols focused on increasing the sensitivity of motility detection and multi-parametric behavioral profiling. In order to extend the limit of detection to the level needed to capture the small phenotypic changes that are often crucial in genetic studies and drug discovery, we describe here a technological development that enables the study of up to 5,000 individual animals simultaneously, increasing the statistical power of the measurements by about 1,000-fold compared to manual assays and about 100-fold compared to other available automated methods.

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

We describe protocols for using the wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), which enables high-throughput phenotypic characterization of large populations of Caenorhabditis elegans. These protocols can be used to characterize subtle behavioral changes in mutant strains or in response to pharmacological treatment in a highly scalable fashion.

Análise comportamental de grande c. elegans populações usando um amplo campo de visão de rastreamento plataforma automatizada

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Imunologia e Infecção

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos: Sincronização e observação

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