The authors have nothing to disclose.

1. Preparazione di C. elegans embrioni per time-lapse Microscopia utilizzando microsfere <ol><li> Trasferire vermi adulti gravide utilizzando un pick verme (filo di platino) in una goccia di tampone M9 e pulire i batteri prima vigorosamente agitando e poi trasferire ogni verme a un calo adiacente di M9 utilizzando una sferza occhio montato su un dente di prelievo / puntale o utilizzare un capillare di vetro appuntito. </li><li> Diluire la dispersione contenente 20 micron perline diametro polistirene 10 volte in tampone M9 (1 tampone L M9 contiene 3 g KH 2 PO 4, 6 g di Na 2 HPO 4, 5 g di NaCl, e, dopo autoclavaggio (20 min, 120 ° C), aggiungere un ulteriore 1 ml di una soluzione di 4 1 M MgSO). </li><li> Effettuare una pipetta a bocca da qualsiasi tipo di sottile capillare di vetro (ad esempio, la fusione capillari puntiformi o capillari utilizzati per tirare aghi per iniezione), a circa 0,5 m di lunghezza pezzo di gomma, silicone o materiale simile tubo (meglio se trasparente), a 200 microlitripuntale, il coperchio di un tubo 200 microlitri PCR, un filtro idrofobico per piccole siringhe (ad es., un 0,2-0,45 micron dimensione dei pori e 15-50 mm di diametro nylon, PTFE o materiale simile filtro) punta, e una pipetta 1.000 ml . Questo tipo di bocca pipetta assicura che nessun materiale biologico può entrare in contatto con lo sperimentatore. </li><li> Assemblare la pipetta inserendo la punta della pipetta 200 microlitri con la punta prima nel tubo e collegarlo con il coperchio di un tubo di PCR che ha una foratura centrale che corrisponde al diametro del capillare utilizzato. Un ago punteruolo o preparazione molto rilevato può essere utilizzato per generare la perforazione. </li><li> Disegnare una capillare sottile e inserirla nella perforazione. Inserire il filtro nell&#39;altra estremità del tubo e inserire 1000 microlitri pipetta punta come boccaglio (Figura 1). </li><li> Sezionare adulti gravido tagliando vermi trasversalmente alla vulva con una lama di rasoio pulita o bisturi. NOTA: In genere, molti embrioni saranno postaxpulsed dopo il taglio. Tuttavia, se sono necessarie primi embrioni, a volte devono essere rilasciate dalla carcassa con un occhio sferza o un ago appuntito. </li><li> Pipettare una goccia della dispersione diluita in polistirolo (~ 4 microlitri) su un vetro di copertura 24x60 mm e di trasferimento embrioni in questo calo usando la pipetta bocca. </li><li> Posizionare con cura un piccolo (ad esempio, 18x18 o 20x20 mm) copertura di vetro sulla parte superiore della goccia e assicurarsi che il calo si è completamente estesa. NOTA: Il calo dovrebbe essere abbastanza piccolo da non toccare i bordi del piccolo vetro di copertura. </li><li> Sigillare il monte con vaselina liquefatto. Aggiungere una goccia di olio di immersione in copertina mm 24x60 lato antiscivolo e passare alla sezione &#39;Time-lapse Microscopia&#39;. </li></ol> 2. Preparazione di adulti C. elegans animali per time-lapse Microscopia utilizzando Nanobeads NOTA: In generale, il protocollo per il montaggio animali adulti è un adattamento del protocollo da rif. 18.Con questo protocollo, è possibile effettuare lungo termine microscopia time-lapse confocale di animali adulti. <ol><li> Preparare un 1,5% (w / v) di agarosio in tampone M9, bollire (1 min, 100 ° C a bagnomaria o microonde). L&#39;uso di elevate concentrazioni di agarosio non è raccomandato poiché questo può portare a estrusione del intestino e / o parti di gonade. </li><li> Stick giù 2-3 strati di nastro su due vetrini da microscopio ciascuno. Posizionare un vetrino senza nastro tra le due diapositive con nastro adesivo. </li><li> Utilizzare un puntale e mettere una goccia della soluzione di agarosio caldo al centro della slitta centrale. Introdurre rapidamente un&#39;altra vetrino sul goccia così che sia supportato dagli strati di nastro su ogni lato. Questo creerà un giro e pad agar piatta di circa 10 mm di diametro. </li><li> Mettere una goccia di soluzione di 100 nm tallone (non diluito, che è 2,6% (w / v)) sul pad. Trasferimento 1-10 vermi adulti puliti nel menu a tendina con un pick verme. Sigillare con 18x18 millimetri di vetro di copertura e di vaselina come spiegato in ProtOcol 1. </li></ol> 3. microscopia time-lapse <ol><li> Mettere una goccia di olio di immersione sul vetrino da microscopio o il panino vetro di copertura. Utilizzare campo chiaro a basso ingrandimento (5x o 10x lenti) per individuare il campione. NOTA: limitare l&#39;esposizione alla luce blu il più possibile (in particolare per C. elegans embrioni), ad esempio, non utilizzare la microscopia fluorescenza per trovare / focalizzare il provino ma utilizzare campo chiaro invece. </li><li> Passare alla maggiore ingrandimento (40x o 60x obiettivi), portare il campione a fuoco (o piano centrale o superiore / inferiore piani del campione, a seconda del software di acquisizione). </li><li> Impostare gli intervalli di campionamento a 30 aerei a 1 micron spaziatura registrato ogni 1min. Nel caso in cui un xy o xyz stadi automatica è disponibile, più punti possono essere registrati in un&#39;unica sessione. Passare a imaging di fluorescenza e controllare di nuovo la messa a fuoco. NOTA: cercare di evitare l&#39;uso di poteri alta del laser, piuttosto utilizzare tempi di esposizione leggermente più lungoa bassissime intensità. Misura immagini acquisite subito, sia nel programma di acquisizione immagini o in ImageJ per evitare la saturazione, che colture variano le dinamiche e significa anche un&#39;eccessiva esposizione alle radiazioni. </li><li> Avviare la registrazione della serie time-lapse. NOTA: Per escludere l&#39;analisi artefatti, iniziare con lunghi intervalli (3-10 min) tempo tra la scansione del campione e aumentare gradualmente campionamento temporale agli intervalli desiderati. Tempi di sviluppo così come i punti finali in entrambi i casi dovrebbero essere simili quando si effettua una analisi statistica. Inoltre, è spesso necessario valutare i tassi di sopravvivenza e fototossicità. Pertanto, recuperare campione dal monte dopo-lungo termine microscopia time-lapse e controllare se continuano a sviluppare / live. </li></ol> 4. Ricostruire un modello delle cellule di figura 3D con IMOD NOTA: Il software IMOD è disponibile dalla pagina web IMOD: http://bio3d.colorado.edu/imod/. L&#39;installazione del software è descrittod lì. Quando si utilizza il sistema operativo Windows, un toolkit Unix deve essere installata, che può anche essere trovato come un pacchetto sul sito IMOD. Inoltre, vi è un&#39;introduzione 3dmod ottimamente compilato disponibili sulla pagina web IMOD (http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html). <ol><li> Aprire la shell Unix e digitare &quot;imod&quot;. La finestra MDI si aprirà. Selezionare il file con i dati grezzi (idealmente un tif impilati o simili) da cui generare un modello 3D. </li><li> Individuare la parte inferiore e superiore degli oggetti nella finestra zap utilizzando la finestra delle informazioni (su e giù strumento scorrimento). </li><li> Avviare l&#39;analisi i contorni delle cellule. È importante sottolineare che, in modo che ogni cella è un oggetto. Inizia con il piano superiore di ogni cella e creare il primo contorno si utilizza la finestra delle informazioni. Scorrere verso il basso in z e creare un nuovo profilo per ogni piano z. </li><li> Fare lo stesso per tutte le celle come necessario per modellare in 3D. Non dimenticare di creare un nuovo oggetto quando si inizia con una nuova cellula. NOTA: Ci sono molti modi diversi per contorno tracciamento e diversi plugin utile. Si prega di visitare la pagina web IMOD e tutorial online per i dettagli. Nel caso qui illustrato, è stata usata l&#39;impostazione predefinita. </li><li> Aprire la finestra &quot;Modello View&quot; per ispezionare gli oggetti e le loro contorni. </li><li> Nella barra degli strumenti &quot;Model View&quot; scegliere &quot;Modifica&quot; - &quot;Oggetti&quot;. La rispettiva finestra di modifica si aprirà. </li><li> Per modellare cellule come oggetti pieni e chiusi, scegliere &quot;Mesh&quot; come &quot;Draw tipo di dati&quot; e &quot;Fill&quot; come &quot;stile di disegno&quot;. Clicca su &quot;mesh&quot; nella selezione scorrimento in basso a sinistra della finestra. Controllare l&#39;opzione &quot;Cap&quot; nella selezione in basso a destra. Controllare il numero di oggetti come necessario e fare clic su &quot;Mesh All&quot;. Il programma genererà oggetti solidi dalle pile di contorni. Il fattore-z campionamento può essere regolata cambiando &quot;Z-scale&quot; nella finestra &quot;View&quot;. </li><li> Sposta / ruotare l&#39;obiet 3Dt (&quot;Edit&quot; - &quot;Vista&quot;) e salvare le istantanee o filmati (&quot;File&quot; - &quot;Snap Tiff con nome ...&quot; o &quot;Movie / Montaggio&quot;). </li></ol> 5. Monitoraggio fluorescente Strutture etichettati con Endrov NOTA: Al fine di tenere traccia di resti divisione cellulare, utilizzare un ceppo con un pennarello membrana nucleare o al plasma per l&#39;identificazione delle cellule (ad esempio, H2B, PH-PLC-d1) e una divisione cellulare marcatore residuo (ad esempio, NMY-2, ZEN-4 ). Il marcatore membrana nucleare o del plasma è importante per determinare quale cella eredita il rimanente divisione cellulare. <ol><li> Per caricamento veloce e facilità d&#39;uso, i dati grezzi deve essere convertito in un file TIFF (ad esempio, in ImageJ). Avanti, aperto Endrov e caricare il file da analizzare, scegliendo l&#39;opzione &quot;Carica file&quot; dal menu file. Fare clic sull&#39;icona &quot;Visualizzatore 2D&quot; nella barra degli strumenti. </li><li> Regolare l&#39;istogramma facendo clic sull&#39;icona &quot;gamma Fit&quot; (l&#39;icona blu nell&#39;angolo in basso a destradello schermo Endrov). Impostare la XYZ risoluzione andando su &quot;dati&quot; - &quot;nomefile&quot; - &quot;ImageSet&quot; - &quot;Canale&quot; - &quot;Set XYZ-risoluzione&quot;. Digitare valori X, Y, e Z, per esempio, 5, 5, 1 se la risoluzione X e Y è di 0.2 micron e campionare ogni 1 micron di Z. </li><li> Per annotare i nuclei, passare al piano di interesse e cliccare su &quot;visore 2D&quot;. Selezionare &quot;Lineage&quot; dal menu a discesa e scegliere &quot;Nuovo stirpe&quot;. </li><li> Cliccando e trascinando sul nucleo, può essere marcato. Per assegnare un nome al nucleo, fare clic destro e scegliere &quot;Rinomina particella&quot; dal menu a discesa. Per aumentare o diminuire il diametro del cerchio, trascinare la freccia che appare sulla sinistra del cerchio marcato. Per celebrare il piano centrale del nucleo, fare clic sull&#39;icona a destra. Quando si utilizza un marcatore membrana plasmatica, una grande sfera può trarre che coprirà la maggior parte della cellula. </li><li> Per continuare nel tempo e piano, scegliere il &quot;Frame&quot; e &quot;Z&quot;i pasti presso la barra degli strumenti in basso. Dopo essere andato al successivo punto di tempo, regolare la posizione o la dimensione del cerchio che segna il nucleo di conseguenza. Ripetere questa operazione fino a quando la cellula si divide cingolati. </li><li> Quando c&#39;è una divisione cellulare, segnare i nuclei figli e passare a &quot;spettatore Lineage&quot;. Questo può essere selezionata facendo clic sull&#39;icona &quot;Windows&quot; sulla barra degli strumenti superiore. Segna tutti e tre i nuclei contemporaneamente, passare all&#39;opzione &quot;Lineage&quot; nella barra degli strumenti in alto e selezionare &quot;genitore Associate&quot;. </li><li> Quando il monitoraggio delle cellule è terminata, passare alla marcatura il resto della divisione cellulare per il monitoraggio dei canali. Per cambiare canale, fare clic sul nome del file nell&#39;angolo in basso a sinistra della barra degli strumenti. Il residuo divisione cellulare (o qualsiasi altra struttura) possono essere monitorati come descritto sopra per il nucleo. </li><li> Quando si ritorna al software dopo la chiusura, è necessario andare a &quot;2D Viewer&quot; - &quot;Lineage&quot; - &quot;Modifica&quot; e cliccare sul numero di stirpe che verrà modificato. </li&gt; </ol> 6. Analizzando corticale actomiosina flusso con PIVlab NOTA: PIVlab è un software disponibile gratuitamente da: http://pivlab.blogspot.de/; esso può essere richiamato all&#39;interno dell&#39;ambiente riga di comando Matlab digitando PIVlab_GUI. Quando si lavora con PIVlab, si raccomanda di salvare la serie di immagini in una cartella separata. <ol><li> Avviare una nuova sessione dal menu &quot;File&quot;. Caricare i file di immagine, fare clic sul pulsante &quot;Carica immagini&quot;. </li><li> Selezionare lo stile sequenza 1-2, 2-3, ... e passare alla directory che contiene la sequenza delle immagini desiderate. Selezionare le immagini e fare clic sul pulsante &quot;Aggiungi&quot; e di importazione. </li><li> Vai su &quot;Impostazioni&quot; Analisi e selezionare &quot;Esclusioni (ROI, Maschera)&quot;. In alternativa, premere il tasto &quot;Ctrl + E&quot;. Utilizzare il pulsante &quot;Disegna maschera (s) per fotogramma corrente&quot; per disattivare la parte indesiderata delle immagini / s (cioè, al di fuori dell&#39;area embrione). </li><li> Selezionare &quot;Impostazioni PIV&quot; from il menu &quot;Impostazioni Analisi&quot;. In alternativa, premere il tasto &quot;Ctrl + S&quot;. Scegliere &quot;finestra deformazione FFT&quot;, come l&#39;algoritmo di PIV desiderato. NOTA: trasformazione rapida di Fourier (FFT) riduce il costo computazionale ma è consigliata solo il segnale è ben al di sopra del rumore e se lo spostamento delle particelle studiati non supera la metà della superficie passaggio analizzato (vedi 6.5). </li><li> Inserire i seguenti valori per le tre passaggi, che sono la zona di interrogazione per incrociata intensità correlazione tra immagini successive: Passo 1: interrogazione un&#39;area di 64 pixel con un passo di 32. Passo 2: interrogazione superficie di 32 pixel con un passo di 16 . Selezionare &quot;lineare&quot; dalla deformazione finestra menu a discesa. Scegli il metodo 2 * 3 punti di Gauss per lo spostamento stima sub-pixel. </li><li> Selezionare &quot;Analyze!&quot; dal menu Analysis e utilizzare il pulsante &quot;Analizza tutti i frame&quot; per iniziare un&#39;analisi. </li><li> Per la post-elaborazione selezionare &quot;convalida Vector&quot; da &quot;; Menù post trattamento &quot;e impostare la deviazione standard (Stdev) Soglia di filtro a 7 e si applicano a tutti i fotogrammi. </li><li> Scegliere &quot;Derivare parametri / modificare i dati&quot; dal menu &quot;Plot&quot;. Selezionare &quot;vettori [px / telaio]&quot; dal menu a discesa. Regolare la scorrevolezza dei vettori e filtro passa alto e si applicano a tutti i fotogrammi. </li><li> Per calcolare i vettori medi di tutti i fotogrammi, impostare i &quot;fotogrammi usati&quot; a 1: fine e fare clic sul pulsante &quot;Calcola i vettori medi&quot;. </li></ol>

<ol>
	<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).</li><li>Kimmel, C. B., Warga, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+cell+lineages+originate+in+the+gastrula+of+the+zebrafish.">Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish.</a> Science. 231 (4736), 365-368 (1986).</li><li>Nishida, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+analysis+in+ascidian+embryos+by+intracellular+injection+of+a+tracer+enzyme.+III.+Up+to+the+tissue+restricted+stage.">Cell lineage analysis in ascidian embryos by intracellular injection of a tracer enzyme. III. Up to the tissue restricted stage.</a> Dev. Biol. 121 (2), 526-541 (1987).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li><li>Fernandez, R., Das, P., Mirabet, V., Moscardi, E., Traas, J., Verdeil, J. L., Malandain, G., Godin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+plant+growth+in+4D:+robust+tissue+reconstruction+and+lineaging+at+cell+resolution.">Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution.</a> Nat. Methods. 7 (7), 547-553 (2010).</li><li>Olivier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+reconstruction+of+early+zebrafish+embryos+using+label-free+nonlinear+microscopy.">Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy.</a> Science. 329 (5994), 967-971 (2010).</li><li>Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+kinetochore+tracking+reveals+error-prone+homologous+chromosome+biorientation+in+mammalian+oocytes.">Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes.</a> Cell. 146 (4), 568-581 (2011).</li><li>Schr&#246;del, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light.">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nat. Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li><li>Du, Z., Santella, A., He, F., Tiongson, M., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+inference+of+systems-level+mechanistic+models+of+development+from+live-imaging-based+phenotype+analysis.">De novo inference of systems-level mechanistic models of development from live-imaging-based phenotype analysis.</a> Cell. 156 (1-2), 359-372 (2014).</li><li>Amat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+accurate+reconstruction+of+cell+lineages+from+large-scale+fluorescence+microscopy+data.">Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data.</a> Nat. Methods. 11 (9), 951-958 (2014).</li><li>He, B., Doubrovinski, K., Polyakov, O., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+constriction+drives+tissue-scale+hydrodynamic+flow+to+mediate+cell+elongation.">Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation.</a> Nature. 508 (7496), 392-396 (2014).</li><li>Singh, D., Pohl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+rotational+cortical+flow,+asymmetric+midbody+positioning,+and+spindle+rotation+mediates+dorsoventral+axis+formation+in+C.+elegans.">Coupling of rotational cortical flow, asymmetric midbody positioning, and spindle rotation mediates dorsoventral axis formation in C. elegans.</a> Dev. Cell. 28 (3), 253-267 (2014).</li><li>Singh, D., Pohl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+function+for+the+midbody+remnant+in+embryonic+patterning.">A function for the midbody remnant in embryonic patterning.</a> Commun. Integr. Biol. 7, e28533 (2014).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Henriksson, J., Hench, J., Tong, Y. G., Johansson, A., Johansson, D., B&#252;rglin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endrov:+an+integrated+platform+for+image+analysis.">Endrov: an integrated platform for image analysis.</a> Nat. Methods. 10 (6), 454-456 (2013).</li><li>Thielicke, W., Stamhuis, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIVlab+-+Towards+User-friendly,+Affordable+and+Accurate+Digital+Particle+Image+Velocimetry+in+MATLAB.">PIVlab - Towards User-friendly, Affordable and Accurate Digital Particle Image Velocimetry in MATLAB.</a> Journal of Open Research Software. 2 (1), e30 (2014).</li><li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+using+nanoparticle-mediated+immobilization.">Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization.</a> PLoS One. 8 (1), e53419 (2013).</li><li>Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+Cas9-triggered+homologous+recombination.">Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination.</a> Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).</li><li>Schonegg, S., Constantinescu, A. T., Hoege, C., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+GTPase-activating+proteins+RGA-3+and+RGA-4+are+required+to+set+the+initial+size+of+PAR+domains+in+Caenorhabditis+elegans+one-cell+embryos.">The Rho GTPase-activating proteins RGA-3 and RGA-4 are required to set the initial size of PAR domains in Caenorhabditis elegans one-cell embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (38), 14976-14981 (2007).</li><li>Schmutz, C., Stevens, J., Spang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+the+novel+RhoGAP+proteins+RGA-3+and+RGA-4+in+the+germ+line+and+in+the+early+embryo+of+C.+elegans.">Functions of the novel RhoGAP proteins RGA-3 and RGA-4 in the germ line and in the early embryo of C. elegans.</a> Development. 134 (19), 3495-3505 (2007).</li><li>Naganathan, S. R., F&#252;rthauer, S., Nishikawa, M., J&#252;licher, F., Grill, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+torque+generation+by+the+actomyosin+cell+cortex+drives+left-right+symmetry+breaking.">Active torque generation by the actomyosin cell cortex drives left-right symmetry breaking.</a> Elife. 3, e04165 (2014).</li><li>Kaletta, T., Schnabel, H., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binary+specification+of+the+embryonic+lineage+in+Caenorhabditis+elegans.">Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 390 (6657), 294-298 (1997).</li><li>Schnabel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cell+sorting+in+the+C.+elegans+embryo+defines+a+new+mechanism+for+pattern+formation.">Global cell sorting in the C. elegans embryo defines a new mechanism for pattern formation.</a> Dev. Biol. 294 (2), 418-431 (2006).</li><li>Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lineaging+of+fluorescently-labeled+Caenorhabditis+elegans+embryos+with+StarryNite+and+AceTree.">The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1468-1476 (2006).</li><li>Giurumescu, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+semi-automated+analysis+of+morphogenesis+with+single-cell+resolution+in+complex+embryos.">Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos.</a> Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).</li><li>Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndecan+defines+precise+spindle+orientation+by+modulating+Wnt+signaling+in+C.+elegans.">Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans.</a> Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).</li><li>Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+normal+embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+4D+microscope:+variability+of+development+and+regional+specification.">Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification.</a> Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).</li></ol>

Research in the lab of CP is funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (EXC 115; FOR 1756) and the LOEWE Research Cluster Ubiquitin Networks. CP is further supported by the European Union Framework Program 7 (Marie Curie Actions Project 326632).

Attraverso oggetto inseguimento in sviluppo, in particolare inseguimento nucleare, è stato possibile per chiarire i meccanismi centrali di patterning C. elegans embriogenesi 1,23,24. Espansione questa strategia per un throughput più elevato, è stato recentemente possibile scoprire regole patterning complementari e di proporre un metodo come dedurre patterning regole de novo 10. Per molti mutanti, tuttavia, l&#39;esatto difetto patterning sono ancora sconosciute. I metodi qui de...

Con i miglioramenti costanti di proteine ​​fluorescenti, ingegneria del genoma, la microscopia ottica, e software e all&#39;hardware, è ora possibile registrare sviluppo di molti organismi modello a risoluzione senza precedenti spazio-temporale. Questo permette ai ricercatori di fare domande che non possono essere affrontate in precedenza o per rivisitare i processi di sviluppo noti per la ricerca di aspetti trascurati. Questo progresso ha scatenato campo della biologia dello sviluppo quantitativo, che mira a trasformare qualitativi, modelli informali in modelli quantitativi da misurazioni approfondite e analisi statistiche. Tracking cellule e strutture subcellulari ha permesso di ricavare modelli quantitativi dello sviluppo embrionale, l&#39;attività del sistema nervoso, o divisione cellulare 1-12. Tracciando resti divisione cellulare durante lo sviluppo iniziale del C. elegans embrione, potremmo recentemente rivelare che seguono un impianto stereodigitato il percorso e costituiscono importanti fattori di polarizzazione 13,14. Qui, i protocolli vengono presentate che rendono la biologia dello sviluppo quantitativo approcci accessibili per i non esperti. L&#39;attenzione si concentra su tre straight-forward, strumenti liberamente disponibili che sono implementabili in qualsiasi laboratorio che ha accesso a microscopia confocale standard ed i computer. Tra questi, un protocollo per generare forme di cellule 3D, un protocollo per monitorare resti divisione cellulare, e un protocollo per descrivere quantitativamente le dinamiche actomyosin corticali. Il nematode C. elegans è usato come un caso esemplare, tuttavia, i metodi e gli strumenti qui descritti adatti per una serie di domande in altri modelli biologici, per esempio, cellule coltivate, espianti di tessuto, organoidi o sferoidi, altri embrioni, etc. In generale, alcune delle analisi indicati qui possono essere eseguite anche con il popolare strumento di ImageJ open source (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html; o FIJI, le &quot;batterie incluse &#39;versione di ImageJ, http://fiji.sc/Fiji) per i quali sono disponibili molti plugin per diversi analisi quantitative. Tuttavia, i programmi qui discussi sono progettati per affrontare i problemi specifici. In primo luogo, MDI, l&#39;elaborazione delle immagini, la modellazione e le suite display può essere utilizzato per le ricostruzioni 3D di sezioni seriali di elettrone o microscopia ottica 15. IMOD contiene anche strumenti per la visualizzazione dei dati 3D da qualsiasi orientamento. In secondo luogo, Endrov, un programma Java progettato per eseguire l&#39;analisi delle immagini, l&#39;elaborazione dei dati, e l&#39;annotazione di reti o brani (tra gli altri), sulla base di una architettura a plugin esteso, con ImageJ compatibilità plug-16. Esso contiene più di 140 operazioni di elaborazione delle immagini e un&#39;interfaccia utente estendibile, in cui il modello ei dati grezzi vengono visualizzati separatamente. Il suo codice sorgente può essere trovato alla https://github.com/mahogny/Endrov. In terzo luogo, PIVlab, un MStrumento Atlab per particella digitale immagine velocimetria, che permette all&#39;utente di analizzare quantitativamente e qualitativamente i campi di flusso di particelle 17. L&#39;utilizzo di questo programma richiede una licenza MATLAB che include l&#39;Image Processing Toolbox (http://mathworks.com). PIVlab è un programma progettato per descrivere quantitativamente il flusso. Calcola la distribuzione di velocità, ampiezza, vorticità, divergenza, o tranciare in coppie di immagini o serie. Per questo, cross-correla piccole aree di immagini (chiamati &#39;pass&#39; nella sezione protocollo) di una coppia di immagini per ricavare lo spostamento delle particelle più probabile. Questa correlazione incrociata produce una matrice di correlazione che può essere analizzato nel dominio spaziale o la frequenza utilizzando cross-correlazione diretta o una trasformazione rapida di Fourier (FFT), rispettivamente. L&#39;apparecchiatura utilizzata è un microscopio rovesciato dotato di Nipkow (&#39;spinning&#39;) del disco, un EMCCD, 488 e 561 nm solido-serielaser a stato, e 20x o 40x o aria 60x piano / apochromat obiettivi di petrolio o di acqua-immersion. Tuttavia, è anche possibile effettuare l&#39;imaging time-lapse con altre modalità di imaging, ad esempio, point, LINE o laser-based microscopia foglio di scansione, microscopia multi-fotoni, così come la microscopia fluorescenza combinata con deconvoluzione o strutturato illuminazione. Il vantaggio di utilizzare un sistema a disco Nipkow è l&#39;acquisizione immagine estremamente veloce, specialmente se una modalità di streaming (movimento continuo e scansione dell&#39;oggetto nella dimensione z) è disponibile. Inoltre, per migliorare la risoluzione, un ingrandimento di 1,5 volte extender davanti alla EMCCD può essere utilizzato.

<table><tbody><tr><td>Stereo microscope</td><td>Motic/VWR</td><td>OT4005S</td><td>Stereo microscope for dissection and mounting</td></tr><tr><td>Polybead Polystyrene Microspheres,&amp;nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>18329</td><td>Embryo mounting</td></tr><tr><td>20 &amp;micro;m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybead Polystyrene Microspheres,&amp;nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>876</td><td>Adult animal mounting</td></tr><tr><td>0.1 &amp;micro;m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>VWR</td><td>631-0902</td><td>Adult animal mounting</td></tr><tr><td>Cover glass 18x18 mm</td><td>VWR</td><td>631-1331</td><td>Embryo/adult mounting</td></tr><tr><td>Cover glass 24x60 mm</td><td>VWR</td><td>631-1339</td><td>Embryo mounting</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>VWR</td><td>233-5455</td><td>Embryo dissection</td></tr><tr><td>Silicone tubing</td><td>VWR</td><td>228-1501</td><td>Tubing for mouth pipette</td></tr><tr><td>30 mm PTFE membrane filter</td><td>NeoLab</td><td>Jul-01</td><td>Filter for mouth pipette</td></tr><tr><td>Capillary tubes</td><td>VWR</td><td>621-0003</td><td>Pipette tip for mouth pipette</td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Roth</td><td>E746.1</td><td>Embryo/adult mounting</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Roth</td><td>5210.5</td><td>Adult animal mounting</td></tr><tr><td>Potassium-di-hydrogenphosphate</td><td>Roth</td><td>P018.2</td><td>M9 buffer</td></tr><tr><td>Di-sodium- hydrogenphosphate</td><td>Roth</td><td>P030.2</td><td>M9 buffer</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Roth</td><td>3957.1</td><td>M9 buffer</td></tr><tr><td>VisiScope Spinning Disc Confocal System</td><td>Visitron Systems</td><td>n/a</td><td>Confocal microscopy</td></tr></tbody></table>

tracking and quantifying developmental processes in c. elegans using open-source tools

Quantitativamente cattura processi di sviluppo è fondamentale per ricavare modelli meccanicistici e la chiave per identificare e descrivere fenotipi mutanti. Qui protocolli sono presentati per la preparazione di embrioni e adulti C. elegans animali per breve e lungo termine microscopia time-lapse e metodi per il monitoraggio e la quantificazione dei processi di sviluppo. I metodi presentati sono tutti basati su C. ceppi disponibili nel Caenorhabditis Genetics Center e sul software open-source elegans che possono essere facilmente implementate in qualsiasi laboratorio indipendentemente dal sistema di microscopia utilizzato. Una ricostruzione di un modello cellulare-forma 3D utilizzando il IMOD software di modellazione, il monitoraggio manuale delle strutture subcellulari fluorescenza marcata con il programma di analisi di immagine multi-purpose Endrov, e un&#39;analisi dei flussi contrattile corticale mediante PIVlab (-Time Risolto Image Velocimetry Particle digitale sono mostrati strumento per MATLAB). Si è discusso di come questi metodi possono anche essere distribuiti to quantitativamente catturare altri processi di sviluppo in diversi modelli, per esempio, di monitoraggio delle cellule e lineage tracing, il monitoraggio del flusso di vescicole.

Utilizzando i protocolli 2, 3, e 4, time-lapse di imaging di gonadi a selvaggio tipo C. elegans adulti viene eseguita (ceppo OD58 (unc-119 (ED3) III; ltIs38 [pAA1, pie-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + unc-119 (+)]), che esprime un marcatore di membrana da un promotore della linea germinale ). Concentrandosi sulla volta della gonade, un modello 3D delle cellule germinali è generato dai dati microscopia (Figura 2). Questo modello permette di analizzare variazioni di dimensione della cella, mentre i...

Watch this Scientific Journal Video about Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools at JoVE.com

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Monitoraggio e quantificazione processi di sviluppo in<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilizzo strumenti open-source

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

tracking-quantifying-developmental-processes-c-elegans-using-open

Research

JoVE Journal

Biology

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

8.8K Views.  Goethe University. Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Video: Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

Electrotaxis microfluidica-based per On-demand analisi quantitativa della<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Ricerca

Bioingegneria

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegans Monitoraggio e valutazione del comportamento

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

Neuroscienze

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

Microscopia isotropica leggera e analisi di lignaggio cellulare automatizzate al catalogo Caenorhabditis elegans embriogenesi con risoluzione subcellulare

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Biologia dello sviluppo

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of diverse human diseases. Worms are particularly well-suited for high-throughput genetic and drug screens to gain deeper insight into therapeutic targets and therapies by exploiting their fast development cycle, large brood size, short lifespan, microscopic transparency, low maintenance costs, robust suite of genomic tools, mutant repositories, and experimental methodologies to interrogate both in vivo and ex vivo physiology. Worm locomotor activity represents a particularly relevant phenotype that is frequently impaired in mitochondrial disease, which is highly heterogeneous in causes and manifestations but collectively shares an impaired capacity to produce cellular energy. While a suite of different methodologies may be used to interrogate worm behavior, these vary greatly in experimental costs, complexity, and utility for genomic or drug high-throughput screens. Here, the relative throughput, advantages, and limitations of 16 different activity analysis methodologies were compared that quantify nematode locomotion, thrashing, pharyngeal pumping, and/or chemotaxis in single worms or worm populations of C. elegans at different stages, ages, and experimental durations. Detailed protocols were demonstrated for two semi-automated methods to quantify nematode locomotor activity that represent novel applications of available software tools, namely, ZebraLab (a medium-throughput approach) and WormScan (a high-throughput approach). Data from applying these methods demonstrated similar degrees of reduced animal activity occurred at the L4 larval stage, and progressed in day 1 adults, in mitochondrial complex I disease (gas-1(fc21)) mutant worms relative to wild-type (N2 Bristol) C. elegans. This data validates the utility for these novel applications of using the ZebraLab or WormScan software tools to quantify worm locomotor activity efficiently and objectively, with variable capacity to support high-throughput drug screening on worm behavior in preclinical animal models of mitochondrial disease.

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

This study presents protocols for two semi-automated locomotor activity analysis approaches in C. elegans complex I disease gas-1(fc21) worms, namely, ZebraLab (a medium-throughput assay) and WormScan (a high-throughput assay) and provide comparative analysis among a wide array of research methods to quantify nematode behavior and integrated neuromuscular function.

Analisi comparativa di metodi sperimentali per quantificare l'attività animale in modelli di caenorhabditis elegans della malattia mitocondriale

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

Comportamento

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

Un metodo di imaging semi-alto e un toolkit di visualizzazione dei dati per analizzare lo sviluppo embrionale C. elegans

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers Agarose per lungo termine Imaging di calcio<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imaging C. elegans Gli embrioni utilizzando un microscopio epifluorescente e Software Open Source

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Biologia

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has proven to be an invaluable model organism in helping to tackle this challenge, from inspiring technological approaches,&#160;building the human brain connectome, to actually shedding light on the specific molecular drivers of basic functional patterns. The bulk of the behavioral studies in C. elegans have been performed on solid substrates. In liquid, animals exhibit behavioral patterns that include movement at a range of speeds in 3D, as well as partial body movements, such as a posterior curl without anterior shape change, which introduce new challenges for quantitation. The steps of a simple procedure, and use of a software that enables high-resolution analysis of C. elegans swim behavior, are presented here. The software, named CeleST, uses a specialized computer program that tracks multiple animals simultaneously and provides novel measures of C. elegans locomotion in liquid (swimming). The measures are mostly grounded in animal posture and based on mathematics used in computer vision and pattern recognition, without computational requirements for threshold cut-offs. The software tool can be used to both assess overall swimming prowess in hundreds of animals from combined small batch trials and to reveal novel phenotypes even in well-characterized genetic mutants. The preparation of specimens for analysis with CeleST is simple and low-tech, enabling wide adaptation by the scientific community. Use of the computational approach described here should therefore contribute to the greater understanding of behavior and behavioral circuits in the C. elegans model.

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

An efficient and simple methodology for computer-based analysis of nematode swimming behavior in liquid is described. The method requires little to no investment for C. elegans laboratories. The hardware used is standard, and the computer software for the behavioral analysis (CeleST) is an open source one.

Analisi automatizzata di<em&gt; C. elegans</em&gt; Comportamento Swim Utilizzando Celest Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the health and fitness of the animals under study, one typically relies on motility readouts, such as the measurement of the number of body bends or the speed of movement. These measurements usually involve manual counting, making it challenging to obtain good statistical significance, as time and labor constraints often limit the number of animals in each experiment to 25 or less. Since high statistical power is necessary to obtain reproducible results and limit false positive and negative results when weak phenotypic effects are investigated, efforts have recently been made to develop automated protocols focused on increasing the sensitivity of motility detection and multi-parametric behavioral profiling. In order to extend the limit of detection to the level needed to capture the small phenotypic changes that are often crucial in genetic studies and drug discovery, we describe here a technological development that enables the study of up to 5,000 individual animals simultaneously, increasing the statistical power of the measurements by about 1,000-fold compared to manual assays and about 100-fold compared to other available automated methods.

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

We describe protocols for using the wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), which enables high-throughput phenotypic characterization of large populations of Caenorhabditis elegans. These protocols can be used to characterize subtle behavioral changes in mutant strains or in response to pharmacological treatment in a highly scalable fashion.

Analisi del comportamento di grande c. elegans popolazioni utilizzando un ampio campo di vista Monitoraggio piattaforma automatizzata

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Immunologia e infezioni

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Di base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metodi: sincronizzazione e di osservazione

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Monitoraggio e quantificazione processi di sviluppo in

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Electrotaxis microfluidica-based per On-demand analisi quantitativa della

C. elegans Monitoraggio e valutazione del comportamento

Microscopia isotropica leggera e analisi di lignaggio cellulare automatizzate al catalogo Caenorhabditis elegans embriogenesi con risoluzione subcellulare

Analisi comparativa di metodi sperimentali per quantificare l'attività animale in modelli di caenorhabditis elegans della malattia mitocondriale

Un metodo di imaging semi-alto e un toolkit di visualizzazione dei dati per analizzare lo sviluppo embrionale C. elegans

Microchambers Agarose per lungo termine Imaging di calcio

Imaging C. elegans Gli embrioni utilizzando un microscopio epifluorescente e Software Open Source

Analisi automatizzata di

Analisi del comportamento di grande c. elegans popolazioni utilizzando un ampio campo di vista Monitoraggio piattaforma automatizzata

Di base