O objetivo geral deste protocolo é analisar aspectos-chave importantes da função ligase E3, incluindo especificidade da enzima E2, seleção de substratos e transferência de ubiquitina. A principal vantagem desta técnica é sua ampla aplicabilidade, uma vez que proteínas de todas as fontes eucarióticas podem ser recombinantemente expressas e estudadas in vitro sem a necessidade de equipamentos especiais. Ao utilizar pela primeira vez a técnica de descarga de liseina, é importante otimizar parâmetros de ensaio, como concentrações de enzimas, para identificar as condições ideais de descarga para a ligadura E3 de escolha.
Para realizar um ensaio de auto-ubinciabilidade in vitro, configure um esquema de pipetação para testar a capacidade funcional de diferentes enzimas E2 e preparar uma mistura mestre no gelo para todas as reações de ubiquização mais uma reação adicional. Em seguida, adicione um micromolar de enzimas E2 aos tubos apropriados e incuba as amostras em um ciclo térmico PCR por duas horas sob as condições indicadas. Após a incubação, adicione o tampão de amostra SDS a cada reação e misture por pipetação várias vezes.
Em seguida, ferva imediatamente as amostras a 95 graus Celsius por cinco minutos e armazene as proteínas desnaturadas a 20 graus Celsius. Para realizar um ensaio de ubiquização substrato in vitro, prepare o esquema de pipetação para todas as reações. Depois de calcular a quantidade de mistura mestre necessária para uma reação, prepare a mistura mestre para todas as reações no gelo e adicione a mistura mestre a cada tubo.
Adicione as respectivas ligaduras E3 individualmente. Em seguida, incubar as amostras no ciclo térmico PCR por duas horas, como demonstrado. No final da incubação, adicione duas vezes o tampão de amostra SDS a cada reação, misture várias vezes por pipetação e ferva as amostras por cinco minutos a 95 graus Celsius.
Para realizar um ensaio de descarga de lise, configure o esquema de pipetação para a reação de carregamento e incubar as reações de carregamento por 15 minutos a 37 graus Celsius. Para parar a reação de carregamento, adicione apirase a uma concentração final de 1,8 unidades por mililitro e incubar a reação por cinco minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, adicione EDTA a uma concentração final de 30 mililitros e use água duplamente destilada para ajustar o volume da reação a 30 microliters.
Para descarregar a ubiquização E2 por E3, configure cinco tubos correspondentes aos pontos de tempo para o experimento, adicione 6,7 microliters de tampão amostral não redutor a cada tubo, remova seis microlitradores da reação de carregamento parado do tubo ponto de tempo zero e ajuste o volume total para 26,7 microliters. Para configurar as reações de descarga, adicione água duplamente destilada, tampão de ubiquização, BSA, lise, ligadura E3 e o E2 carregado a cada reação. Após os períodos de tempo selecionados, transfira amostras de 20 microliter de cada reação de descarga para o tubo amostral correspondente.
Em seguida, imediatamente vórtice as amostras, e colocá-las a 70 graus Celsius por 10 minutos. Nesta análise representativa da mancha ocidental, o CHIP inativo não foi auto-ubiquílado. No entanto, os produtos de ubiquitina independentes da E3 foram formados na presença de CHIP inativos e na ausência de CHIP.
O CHIP do tipo selvagem foi auto-ubiquídeo quando combinado com as proteínas do UBE2D e das famílias UBE2E, enquanto as cadeias gratuitas de poliuubiquitina foram produzidas em cooperação com as proteínas da família UBE2D, mas não com as proteínas da família UBE2E. A vinculação da ubiquitina pela UBE2N/V1 direcionou a formação de cadeias de ubiquitina livre. A auto-ubiquidade e a ubiquização do UNC-45B foram observadas com CHIP tipo selvagem, mas não com o mutante inativos do CHIP, indicando que o UNC-45B atua como um substrato conservado para CHIP.
Quando a atividade catalítica do CHIP foi analisada utilizando um ensaio de descarga de liseina, a enzima UBE2D2 não carregada tinha um peso molecular de 17 kilodaltons e o UBE2D2 carregado com uma única molécula de ubiquitina tinha um peso molecular de aproximadamente 26 kilodaltons. Na hora 0, foi observado todo o rendimento do E2 carregado. Na presença de CHIP inativo, foi detectada uma descarga fraca e3 ligase independente do UBE2D2, mas não a auto-ubiquidade do CHIP.
Na presença de CHIP tipo selvagem, a descarga de UBE2D2 foi rápida e concluída em 60 minutos, e a auto-ubiquidade do CHIP indicou uma transferência de ubiquitina em seus próprios resíduos de lisesina. Devido à capacidade limitada do E2, trabalhe o mais rápido possível e prossiga imediatamente com a reação de descarga seguida por SDS-PAGE e mancha ocidental. Seguindo esses protocolos de onipresença in vitro, os tipos específicos de ligação de ubiquização podem ser identificados sondando as manchas ocidentais com anticorpos específicos de ligação.
