Este trabalho foi apoiado pelo financiamento para DJJ por meio de projeto DFG # JA2108 / 2-1.

NOTA: Os passos seguintes descrevem o nosso método para a realização de uma experiência in situ em estágios embrionários e larval de L. stagnalis. Quando uma etapa envolve o uso de um produto químico perigoso o facto é indicado pela palavra &quot;CUIDADO&quot; e todos os procedimentos de segurança adequados devem ser adoptadas. Links para folhas de MSDS representativos para os produtos químicos perigosos são fornecidos no Documento Suplementar 1. Receitas para todos os reagentes são fornecidos no Documento Suplementar 2. 1. Montagem de Decapsulation Apparatus <ol><li> Para fazer isso, ligar uma seringa descartável ml 20 a tubagem de silicone (com um diâmetro interior de 1 mm e um diâmetro externo de 3 mm) usando um corte de ponta P1,000 para um comprimento adequado, como mostrado na Figura 2A. </li><li> Tape uma lâmina de microscópio padrão a uma grande placa de Petri invertida. Tape o tubo de silicone imediatamente adjacente à lâmina de microscópio, como mostrado na figura60; 2C e 2D. </li><li> Descansar uma agulha de vidro puxado sobre a lâmina do microscópio e suavemente inseri-lo no tubo de silicone até que a ponta da agulha fica saliente cerca de 20% do caminho através do diâmetro interior do tubo (ver figura 2C e 2D). Uma vez que a agulha se encontra na posição de fita-o para baixo para a placa de Petri. </li><li> Permitir que a extremidade livre do tubo de silicone para descansar na outra placa de Petri que irá recolher o material desencapsulado. </li></ol> 2. Amostra Recolha, Fixação e Decapsulation NOTA: Todos os passos são realizados à TA, a menos que indicado de outra maneira. <ol><li> Recolher cuidadosamente cordas de ovos de as paredes de um aquário. Para fazer isso, use um pedaço de plástico flexível como uma espátula para raspar a cadeia de ovo fora do substrato, e usar um coador de chá de plástico para pescar a cadeia de ovo flutuando para fora da água. Fase e ordenar o material sob um microscópio usando o guia proporcionado na Figura1. </li><li> Coloque a cadeia de ovo em uma toalha de papel e fazer uma incisão longitudinal ao longo da massa de ovos usando a pinça pluma. Rolar as cápsulas de ovos para fora da cadeia de ovo e remover o máximo do material gelatinoso possível de cada cápsula, empurrando-os em torno da toalha de papel usando a pinça pluma. </li><li> Usando a pinça pluma, transferir as cápsulas de ovos em uma placa de Petri contendo 5 ml de água da torneira. Continuar a recolher cápsulas de ovos gelatinoso-de dos estágios de desenvolvimento desejados para este prato. Recolher cápsulas suficientes de todos os estágios de desenvolvimento para o experimento WMISH planejado seguida, avance para a próxima etapa. </li><li> Ao trabalhar com larvas mais desenvolvidas (5 dias após a primeira clivagem (CPFD) e mais velhos) anestesiar-los antes da fixação. NOTA: Isso vai evitar que os músculos se contraiam o que torna a interpretação dos em padrões de coloração in situ muito difíceis. <ol><li> Relaxe larvas (enquanto eles ainda estão em seu capsules) em uma solução a 2% w / v de MgCl2 • 6H 2 O durante 30 min antes da fixação. </li><li> Avaliar o grau de relaxamento após 30 min, submergindo várias larvas enquanto ainda em suas cápsulas de ovos na solução fixadora e monitorar a sua resposta sob um microscópio. Incompletamente larvas relaxado será recolhido em seus escudos, enquanto as larvas totalmente relaxado não vai responder. Uma vez que estas larvas foram relaxadas avançar para a próxima etapa. </li></ol></li><li> Transferir as cápsulas de ovo usando uma pipeta de orifício largo para um tubo de plástico selável que fornece 10 vezes o volume das cápsulas de ovo (por exemplo., 1 ml de cápsulas liquidados exigiria um tubo 10+ ml). </li><li> Aspirar o máximo de líquido possível do tubo e substitua com um volume de solução de fixação que é 10 vezes o volume das cápsulas de ovos liquidados. Gire gentilmente as cápsulas de ovos em fixador à TA, durante o tempo apropriado para cada estágio de desenvolvimento (veja a Figura 1). </li><li> Discontinrotação ue e permitir que as cápsulas para afundar e aspire a solução fixadora em um recipiente adequado de lixo. </li><li> Lavam-se as cápsulas de ovos, substituindo a solução fixadora com tampão fosfato com 0,1% de Tween-20 (PBTw) e rodando à TA durante 5 min. Aspirar o PBTw e repetir duas vezes. </li><li> Remover os embriões e larvas das suas cápsulas utilizando o aparelho (ver secção 1 para detalhes) mostrado na Figura 2. Desenhar as cápsulas para a seringa de 20 ml, conectar o tubo e depois dissipar as cápsulas através da tubagem e passado a agulha de vidro para fora o prato coleção. NOTA: Normalmente, a maioria (&gt; 90%) de todas as cápsulas devem precisar apenas uma passagem através do dispositivo. Em muitos casos, a membrana de cápsula é danificado mas embriões e larvas permanecem no interior da cápsula rompida. Reprocessar este material, simplesmente puxando-o para dentro da seringa e dissipando-lo novamente. </li><li> Coletar os embriões descapsulados e larvas em um tubo de 1,5 ml usando um microfoneropipette (a P20 para o 0 - 3 dias larvas de idade, e uma P200 para larvas mais velhas com a extremidade da ponta cortada). NOTA: Uma pausa (até vários meses) no protocolo podem ser feitas nesta fase. Se isso for necessário, o material decapsuled deve ser recolhido num tubo de 1,5 ml para armazenamento (continuar para o próximo passo). Caso contrário, continue imediatamente o Protocolo nº 3. </li><li> Permitir que os embriões e larvas de afundar para o fundo do tubo e aspirar o sobrenadante. Substitua com 33% de etanol (EtOH) em PBTw e deixe descansar por 5 - 10 min. Repita com 66% de EtOH em PBTw e 100% EtOH. Lavar as larvas duas vezes em 100% de EtOH à TA. Armazenar o material a -20 ° C em EtOH a 100%. </li><li> Quando estiver pronto para continuar, re-hidratar as amostras por remoção do EtOH 100% e substituindo com 66% de EtOH em PBTw, deixe descansar por 5 - 10 min. Repita com 33% EtOH em PBTw, deixe descansar por 5 - 10 min. Finalmente lava-se com 3 x 5 min lavagens de PBTw para garantir que todo o EtOH é removido. </li></ol> 3. Proteinase-K, TEA e Pós-fixation NOTA: Encontramos executando as seguintes etapas em pequenos cestos com um piso de malha o método mais eficiente e suave para a troca rápida de soluções críticas de tempo. Embora possa ser feito em casa, usamos cestas (tamanho médio) que são compatíveis com a manipulação de líquidos robô Intavis InSituPro -Vsi (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc). Tais cestos podem ser rapidamente e facilmente movido entre as cavidades de uma placa de cultura de tecidos de 12 (TCD), a fim de soluções de troca, ou a solução pode ser aspirado do poço utilizando uma pipeta. Alternativamente, todas as trocas de solução pode ser realizada sem estes cestos simplesmente por aspiração do sobrenadante a partir das larvas. Neste caso, um movimento rotativo suave irá concentrar-se todos os embriões e larvas para o centro do prato, permitindo-se o sobrenadante para ser removida a partir da borda do poço. O seguinte assume que o usuário está empregando cestas para as trocas de solução. <ol><li> Usando uma pipeta, Transferência de embriões e larvas para um cesto de sentado num TCD 12 poços com 2 ml de PBTw. NOTA:. O número de embriões e / ou larvas que podem ser adicionados depende do estágio de desenvolvimento a ser investigado, no entanto, uma regra geral é manter pelo menos 25% do espaço livre de embriões / larvas (ou seja, não sobrecarregar o cesto). </li><li> Prepara-se uma adjacente bem com 2 ml de solução de proteinase-K apropriado (ver Figura 1), e mais 2 poços com 2 ml de 0,2% de glicina cada. Mover cada cesto para o poço contendo a concentração apropriada de proteinase-K e começar imediatamente a distribuição. </li><li> Após 10 min mover cada cesto dentro de um poço que continha 0,2% de glicina e incubar durante 5 min. Em seguida, mover cada cesto para o segundo poço com 0,2% de glicina e incubar durante 5 min. Lavar a Glycine com 3x 5 mínimo de trocas de 3 ml PBTw. </li><li> Remover a solução PBTw e tratar as amostras uma vez com recentemente preparada Trietanolamina (TEA) Solution por 5 min CUIDADO! Não agite. Substituir com 3 ml de solução de chã recentemente preparado, durante 5 min. Não agite. Aspirar a maioria da solução de chá a partir das amostras. Adicione o Triethanolamine preparada na hora com uma solução de anidrido acético (TEAAA) e incubar por 5 min. CUIDADO! Não agite. </li><li> OPCIONAL - Enquanto o passo acima é a incubação, preparar um outro novo lote de solução de TEAAA e repita o passo acima. NOTA: Este segundo tratamento com TEAAA é opcional, mas pode ajudar a eliminar completamente todo o fundo com sondas propensas a gerar fundo. </li><li> Remover a solução TEAAA, aspirando-o a partir do poço e substituir com 3 ml de PBTw. Não agite. Remover o PBTw e aplicar 3 ml de formaldeído a 3,7% em PBTw. Agite suavemente, ocasionalmente, durante uma incubação de 30 minutos. </li><li> Remover o fixador, aspirando-o a partir do poço e substituir com 3 ml de PBTw. Transferir o material para um tubo de 1,5 ml. REColoque PBTw o tampão de hibridação com e incubar durante 5 min à TA - CUIDADO. </li><li> Colocar os tubos em um bloco quente, à TA, e ajustar a temperatura para a temperatura de hibridização desejado. NOTA: A temperatura de hibridização é sonda específica e terá de ser empiricamente optimizadas, no entanto, achamos 55 ° C até ser uma boa temperatura para inicialmente ensaio. Permitir que o bloco de vir até à temperatura de hibridação, e permitir que as amostras de pré-hibridação durante aproximadamente 15 minutos (isto é, o tempo necessário para preparar as ribossondas, já não é necessária). Prepare os volumes adequados (geralmente 100? L) de ribossondas diluído. Nós concentrações de sonda tipicamente de teste de 100 e 500 ng / ml como uma primeira série. Nós preparamos riboprobes de acordo com a 12. </li><li> Remover o tampão de hibridação a partir das amostras e adicionar a sonda em tampão de hibridização para as amostras. Sobreposição com 100 ul (ou um volume adequado de modo a formar uma fase acima da-manhã de hibridaçãor), do óleo mineral. NOTA: O óleo mineral impede extensa condensação que formarão durante o passo de hibridização longa. Extensa condensação irá alterar de forma significativa tanto a composição química da solução de hibridação e a concentração da sonda. </li><li> Desnaturar a sonda e o alvo de ARN por aquecimento das amostras a 75 ° C durante 10 min, em seguida, reduzir o calor para a temperatura de hibridização desejado. Permitir a hibridação prosseguir durante um mínimo de 12 hr (S / N) ou mais longos (24 - 48 h). </li><li> Durante a hibridação remover um único tubo do bloco de calor, girá-lo rapidamente entre o polegar eo indicador para suspender as larvas sem perturbar a fase de óleo, e substituí-lo no bloco de calor. Repita este uma vez a cada 6-12 horas ou assim. </li></ol> 4. Hot Lava e imunodetecção NOTA: Enquanto nós usamos um robô de manipulação de líquido para as etapas seguintes, estes também podem ser facilmente feito manualmente. Neste caso, embriões e larvas should ser mantido nos tubos de 1,5 ml foram hibridizadas em. Todas as trocas de solução subsequentes são aspirado e adicionado com uma pipeta P1,000. Quando realizada manualmente cada um dos passos que se seguem devem empregar 1 ml de cada solução. <ol><li> os volumes adequados de calor (3 ml cada uma para cada amostra) do 4x, 2x e 1x soluções de lavagem à temperatura de hibridação. </li><li> Lavar todas as amostras três vezes em tampão de lavagem 4x durante 15 minutos cada à temperatura de hibridação. Lavar todas as amostras três vezes em tampão de lavagem 2x durante 15 minutos cada à temperatura de hibridação. Lavar todas as amostras três vezes em 1X tampão de lavagem durante 15 minutos cada à temperatura de hibridação. </li><li> Lavar uma vez com todas as amostras de tampão 1x Cloreto de sódio Citrato de sódio + 0,1% de Tween (SSC + 0,1% de Tween) à temperatura de hibridação. Deixar as amostras de arrefecer até à TA. </li><li> Lave todas as amostras duas vezes em 1x SSC + 0,1% Tween durante 15 min Substitua esta solução SSC 1x com tampão de ácido maleico (MAB) e deixe descansar por 10 min Repita o MAB wcinza. Substituir o MAB com solução de bloqueio e incubar durante 1,5 h. </li><li> Trocar a solução de bloqueio para solução de anticorpos (1: 10000 de anticorpo numa solução de bloqueio) e incubar durante 12 horas (O / N) à temperatura ambiente com agitação suave. </li></ol> 5. Desenvolvimento de cores e de montagem <ol><li> Aspirar a solução de anticorpos e lavagem 15 vezes com PBTw durante 10 min cada. Substituir PBTw com 1x tampão de fosfatase alcalina (AP) e incubar durante 10 min. </li><li> Enquanto o passo de incubação acima receitas, preparar a solução de coloração AP (ver Documento Suplementar 2) - CUIDADO. Transferir o material em um TCD poço e substitui a solução de AP 1x com solução de coloração de AP. Note-se a tempo de forma que o período de tempo a cor da reacção tem lugar durante pode ser gravada. Monitorar o desenvolvimento do padrão de coloração até que o sinal à relação de fundo é óptima. </li><li> Para parar o desenvolvimento da cor, remova a solução de coloração 1x AP (descarte na estavas apropriadae container), e aplicar 2 ml de PBTw e observe o tempo agora. Lavar mais duas vezes com PBTw durante 5 minutos cada. Usar um destes enxaguamentos para transferir o material para um tubo de 1,5 ml. </li><li> Remover o PBTw e aplicar 1 ml de 3,7% de formaldeído em PBTw e agita-se ou rodar em menos de 30 min à temperatura ambiente (isto pode também ser feito S / N). </li><li> Lavar o fixador com 3 lavagens de PBT (descartar o fixador de resíduos em um recipiente adequado de lixo). Lavam-se as amostras 3 vezes a 50 ° C em água desionizada. NOTA: Estas lavagens eliminar a precipitação de sais que podem tornar-se visível durante a limpeza e as etapas de visualização. </li><li> Decidir se as amostras devem ser montados em benzoato de benzilo: Álcool benzílico (BB: BA, também conhecido como clara de Murray) ou glicerol. NOTA: Nós preferimos o mais poderoso agente de compensação BB: BA como L. stagnalis embriões são um tanto opaca. As amostras a serem montados no BB: BA primeiro precisa ser desidratado através de uma série de etanol. As amostras a ser montada em 60%O glicerol pode ser montado imediatamente. </li><li> Transferir as amostras para dentro da solução de montagem (BB: BA ou 60% de glicerol) utilizando uma pipeta. NOTA: Ao montar no BB: BA isso deve ser feito em um copo bem (BB: BA vai derreter o plástico policarbonato). </li><li> Permitir que as amostras para limpar para 5 - 10 min, e depois montá-los sobre uma lâmina utilizando um número apropriado de lamelas empilhados como espaçadores (1 lamela para as amostras &lt;1 CPFD, 2 Lamelas para amostras&gt; 1 CPFD). NOTA: Whole montagens agora pode ser fotografada usando um microscópio composto com DIC óptica. </li></ol>

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C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deployment+of+regulatory+genes+during+gastrulation+and+germ+layer+specification+in+a+model+spiralian+mollusc.">Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc.</a> Dev. Dyn. , (2015).</li><li>Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+patterns+of+engrailed+and+dpp+in+the+gastropod+Lymnaea+stagnalis.">Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis.</a> Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).</li><li>Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-right+asymmetric+expression+of+dpp+in+the+mantle+of+gastropods+correlates+with+asymmetric+shell+coiling.">Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling.</a> EvoDevo. 4 (1), 15 (2013).</li><li>Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ancient+animal+microRNAs+and+the+evolution+of+tissue+identity.">Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity.</a> Nature. 463, (2010).</li><li>Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+triple+staining+method+for+double+in+situ+hybridization+in+combination+with+cell+lineage+tracing+in+whole-mount+Xenopus+embryos.">A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos.</a> Dev Growth Differ. 49 (8), 635-645 (2007).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems.">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev. Biol. 11 (1), 43 (2011).</li><li>Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+behaviour+in+Lymnaea+stagnalis.+pond+snails+is+a+maternally+inherited,+lateralized+trait.">Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait.</a> Biol. Lett. 5 (1), 20-22 (2009).</li><li>Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chiral+blastomere+arrangement+dictates+zygotic+left-right+asymmetry+pathway+in+snails.">Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails.</a> Nature. 462 (7274), 790-794 (2009).</li><li>Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body+handedness+is+directed+by+genetically+determined+cytoskeletal+dynamics+in+the+early+embryo.">Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo.</a> Curr. Biol. 14 (16), 1462-1467 (2004).</li><li>Lu, T. Z., Feng, Z. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sodium+leak+current+regulates+pacemaker+activity+of+adult+central+pattern+generator+neurons+in+Lymnaea+stagnalis.">A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis.</a> PLoS One. 6 (4), e18745 (2011).</li><li>Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Splicing+of+an+Invertebrate+Beta+Subunit+(LCav-beta)+in+the+N-Terminal+and+HOOK+Domains+and+Its+Regulation+of+LCav1+and+LCav2+Calcium+Channels.">Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels.</a> PLoS ONE. 9 (4), e92941 (2014).</li><li>Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+evolutionary+relationships+of+molluscs+with+phylogenomic+tools.">Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools.</a> Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).</li><li>Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+genome+size+databases.">Eukaryotic genome size databases.</a> Nuc. Acids. Res. 35 (Database issue), D332-D338 (2007).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O método descrito aqui permite a visualização eficiente de transcrições de RNA com presumivelmente diferentes níveis de expressão dentro de todos os estágios de desenvolvimento de Lymnaea stagnalis. Para remover embriões e larvas de suas cápsulas que trialed uma variedade de produtos químicos, choque osmótico e tratamentos físicos relatados para outra encapsulated- desenvolvimento de organismos-modelo. No entanto, nas nossas mãos o método aqui descrito, é a única técnica de alto rendimento que...

Os moluscos são um grupo de animais que mantêm o interesse de uma ampla diversidade de disciplinas científicas. Apesar da sua diversidade morfológica 1, riqueza de espécies (perdendo apenas para os artrópodes em termos de número de espécies 2) e relevância para uma ampla gama de comerciais 3, médicos e científicos 4 questões 5-8, há relativamente poucas espécies de moluscos que podem reivindicar a ser ambos os modelos científicos bem equipados e fácil de manter em um ambiente de laboratório. Um molusco que é muito usado por disciplinas como a neurobiologia 9, ecotoxicologia 10 e, mais recentemente, a biologia evolutiva 11,12, é Lymnaea stagnalis, principalmente devido à sua ampla distribuição e extrema facilidade de manutenção. Apesar de sua popularidade como um organismo &quot;modelo&quot; e sua longa história de uso por biólogos do desenvolvimento 13-19, o alcance e poder de ferramentas moleculares disponíveis para a L. stagnalis comunidade científica encontra-se muito atrás da de modelos mais tradicionais de origem animal (Drosophila, rato, ouriço do mar, nemátodos). O nosso desejo de desenvolver Lymnaea como um modelo molecular surge do interesse nos mecanismos moleculares que orientam a formação de shell. Isso nos motivou a refinar um conjunto de técnicas que permitam a visualização eficiente, consistente e sensível da expressão de genes durante o desenvolvimento de Lymnaea. Montagem inteira de hibridização in situ (WMISH) é amplamente utilizado para uma variedade de organismos-modelo e tem sido usado por mais de 40 anos 20. Nas suas diferentes formas, ISH pode ser empregue para localizar espacialmente loci específicos nos cromossomas, ARNr, ARNm e micro-ARN. Um dos desafios que precisávamos para resolver antes da refinação um método WMISH para L. stagnalis foi a questão do cuidado e de forma eficiente extração embriões e larvas de diferentes estágios de tele cápsulas de ovos em que são depositadas. Esta extracção, ou &#39;desencapsulamento&#39;, tem de ser conseguida de forma eficiente, a fim de recolher o material adequado para uma determinada experiência in situ, enquanto, ao mesmo tempo mantendo a integridade morfológica e celular. Enquanto outros organismos modelo também submetidos a um desenvolvimento encapsulado, em nossas mãos nenhum dos métodos descritos para as espécies poderia ser empregada com sucesso em L. stagnalis. Os objetivos gerais deste método são, portanto: para extrair L. stagnalis embriões e larvas de suas cápsulas em uma forma de alto rendimento, para aplicar tratamentos pré-hibridação que optimizam o sinal WMISH, para preparar embriões e larvas com WMISHsignals satisfatórios para a imagem latente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2203">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Featherweight forceps</td>
			<td style="width:173px;">Ehlert &#38; Partner</td>
			<td style="width:104px;">#4181119</td>
			<td style="width:1547px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon tubing</td>
			<td>Glasger&#228;tebau OCHS GmbH</td>
			<td>760070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillaries</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>1403547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 well tissue culture dishes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CE55.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">37% Formaldehyde</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P733.1</td>
			<td>CAUTION - May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediamine tetraacetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN06.3</td>
			<td>CAUTION - CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9127.1</td>
			<td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll type 400</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN90.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4607.1</td>
			<td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease freeBovine Serum Albumin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8895.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Salmon sperm</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5434.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7692.1</td>
			<td>CAUTION - ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase-K</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7528.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3790.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionised formamide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P040.1</td>
			<td>CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard formamide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6749.3</td>
			<td>CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triethanolamine</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6300.1</td>
			<td>CAUTION - Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetic anhydride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4483.1</td>
			<td>CAUTION - CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Maleic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K304.2</td>
			<td>CAUTION - Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6630-250ML</td>
			<td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10,800-6</td>
			<td>CAUTION - Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3783.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blocking powder</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti DIG Fab fragments AP conjugated</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-HCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9090.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide&#160;</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4421.3</td>
			<td>CAUTION - May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A155.3</td>
			<td>CAUTION - Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-acetyl cysteine</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4126.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908.1</td>
			<td>CAUTION - May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tergitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NP40S</td>
			<td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN30.3</td>
			<td>CAUTION - Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4.2H2O)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4984.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7.2H2O)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3580.1</td>
			<td>CAUTION - May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Mineral oil&#160;</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td style="width:104px;">HP50.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">InSituPro-Vsi&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Intavis</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a whole mount in situ hybridization method for the gastropod mollusc lymnaea stagnalis

Montagem inteira de hibridização in situ (WMISH) é uma técnica que permite a resolução espacial das moléculas de ácidos nucleicos (ARNs mensageiros) muitas vezes dentro de uma preparação de tecido &#39;todo de montagem &quot;, ou fase de desenvolvimento (tais como um embrião ou larva) de interesse. WMISH é extremamente poderoso, pois pode contribuir significativamente para a caracterização funcional de genomas metazoários complexos, um desafio que está se tornando mais um gargalo com o dilúvio de dados de sequências de próxima geração. Apesar da simplicidade conceptual da técnica muito tempo é muitas vezes necessária para optimizar os vários parâmetros inerentes às experiências WMISH para novos sistemas de modelo; diferenças subtis nas propriedades celulares e bioquímicas entre tipos de tecidos e estágios de desenvolvimento significa que um único método WMISH pode não ser apropriada para todas as situações. Temos desenvolvido um conjunto de métodos WMISH para o modelo de gastrópode Lymnaea stagnalis reemergentes que geram consistente esinais WMISH claras para uma variedade de genes, e em todos os estágios de desenvolvimento. Estes métodos incluem a atribuição de larvas de idade cronológica desconhecido para uma janela ontogênica, a remoção eficaz dos embriões e larvas das suas cápsulas de ovos, a aplicação de um tratamento de proteinase-K apropriado para cada janela ontogênica, e hibridação, de pós-hibridação e imunodetecção passos. Estes métodos proporcionam uma base a partir da qual o sinal resultante para um dado transcrito de ARN pode ser adicionalmente refinado com ajustes específicos de sonda (sonda principalmente a concentração e a temperatura de hibridação).

Os padrões de coloração WMISH representante mostrados na Figura 3 foram geradas utilizando a técnica acima descrita, e refletem uma variedade de padrões de expressão espacial para genes envolvidos em uma variedade de processos moleculares que variam de formação de concha (novo gene 1, 2, 3 e 4), à sinalização célula-célula (DPP) para regulação da transcrição (Brachyury) através de uma série de estágios de desenvolvi...

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A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

A Monte Whole<em&gt; In Situ</em&gt; Método de hibridação para o molusco gastrópode<em&gt; stagnalis Lymnaea</em

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

a-whole-mount-situ-hybridization-method-for-gastropod-mollusc-lymnaea

Research

JoVE Journal

Biology

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

8.7K visualizações.  Georg-August University of Göttingen. The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

Vídeo: A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biologia

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Método para coloração Whole Mount anticorpos em Pintainho

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish Whole Mount Alta Resolução Duplo Fluorescente In Situ Hibridização

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

Usando Monte Whole In situ Hibridação a ligação de Biologia Molecular e Organísmicos

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Monte todo In Situ Hibridação de E8.5 de Embriões E11.5 rato

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

Hibridização In Situ para a localização precisa de transcrições em Plantas

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Todo o Monte RNA Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; A hibridação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridação em embriões de Mount inteiros e histologia de células Adaptado para Elasmobrânquios Marinhos

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Alta resolução Monte Whole<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização dentro embriões Zebrafish para estudar a expressão gênica e função

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

A Monte Whole

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Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

Método para coloração Whole Mount anticorpos em Pintainho

Zebrafish Whole Mount Alta Resolução Duplo Fluorescente In Situ Hibridização

Usando Monte Whole In situ Hibridação a ligação de Biologia Molecular e Organísmicos

Monte todo In Situ Hibridação de E8.5 de Embriões E11.5 rato

Hibridização In Situ para a localização precisa de transcrições em Plantas

Todo o Monte RNA Fluorescente

RNA

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência

Alta resolução Monte Whole