Name: a whole mount in situ hybridization method for the gastropod mollusc lymnaea stagnalis
Uploaded: 2016-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo financiamento para DJJ por meio de projeto DFG # JA2108 / 2-1.

NOTA: Os passos seguintes descrevem o nosso método para a realização de uma experiência in situ em estágios embrionários e larval de L. stagnalis. Quando uma etapa envolve o uso de um produto químico perigoso o facto é indicado pela palavra &quot;CUIDADO&quot; e todos os procedimentos de segurança adequados devem ser adoptadas. Links para folhas de MSDS representativos para os produtos químicos perigosos são fornecidos no Documento Suplementar 1. Receitas para todos os reagentes são fornecidos no Documento Suplementar 2. 1. Montagem de Decapsulation Apparatus <ol><li> Para fazer isso, ligar uma seringa descartável ml 20 a tubagem de silicone (com um diâmetro interior de 1 mm e um diâmetro externo de 3 mm) usando um corte de ponta P1,000 para um comprimento adequado, como mostrado na Figura 2A. </li><li> Tape uma lâmina de microscópio padrão a uma grande placa de Petri invertida. Tape o tubo de silicone imediatamente adjacente à lâmina de microscópio, como mostrado na figura60; 2C e 2D. </li><li> Descansar uma agulha de vidro puxado sobre a lâmina do microscópio e suavemente inseri-lo no tubo de silicone até que a ponta da agulha fica saliente cerca de 20% do caminho através do diâmetro interior do tubo (ver figura 2C e 2D). Uma vez que a agulha se encontra na posição de fita-o para baixo para a placa de Petri. </li><li> Permitir que a extremidade livre do tubo de silicone para descansar na outra placa de Petri que irá recolher o material desencapsulado. </li></ol> 2. Amostra Recolha, Fixação e Decapsulation NOTA: Todos os passos são realizados à TA, a menos que indicado de outra maneira. <ol><li> Recolher cuidadosamente cordas de ovos de as paredes de um aquário. Para fazer isso, use um pedaço de plástico flexível como uma espátula para raspar a cadeia de ovo fora do substrato, e usar um coador de chá de plástico para pescar a cadeia de ovo flutuando para fora da água. Fase e ordenar o material sob um microscópio usando o guia proporcionado na Figura1. </li><li> Coloque a cadeia de ovo em uma toalha de papel e fazer uma incisão longitudinal ao longo da massa de ovos usando a pinça pluma. Rolar as cápsulas de ovos para fora da cadeia de ovo e remover o máximo do material gelatinoso possível de cada cápsula, empurrando-os em torno da toalha de papel usando a pinça pluma. </li><li> Usando a pinça pluma, transferir as cápsulas de ovos em uma placa de Petri contendo 5 ml de água da torneira. Continuar a recolher cápsulas de ovos gelatinoso-de dos estágios de desenvolvimento desejados para este prato. Recolher cápsulas suficientes de todos os estágios de desenvolvimento para o experimento WMISH planejado seguida, avance para a próxima etapa. </li><li> Ao trabalhar com larvas mais desenvolvidas (5 dias após a primeira clivagem (CPFD) e mais velhos) anestesiar-los antes da fixação. NOTA: Isso vai evitar que os músculos se contraiam o que torna a interpretação dos em padrões de coloração in situ muito difíceis. <ol><li> Relaxe larvas (enquanto eles ainda estão em seu capsules) em uma solução a 2% w / v de MgCl2 • 6H 2 O durante 30 min antes da fixação. </li><li> Avaliar o grau de relaxamento após 30 min, submergindo várias larvas enquanto ainda em suas cápsulas de ovos na solução fixadora e monitorar a sua resposta sob um microscópio. Incompletamente larvas relaxado será recolhido em seus escudos, enquanto as larvas totalmente relaxado não vai responder. Uma vez que estas larvas foram relaxadas avançar para a próxima etapa. </li></ol></li><li> Transferir as cápsulas de ovo usando uma pipeta de orifício largo para um tubo de plástico selável que fornece 10 vezes o volume das cápsulas de ovo (por exemplo., 1 ml de cápsulas liquidados exigiria um tubo 10+ ml). </li><li> Aspirar o máximo de líquido possível do tubo e substitua com um volume de solução de fixação que é 10 vezes o volume das cápsulas de ovos liquidados. Gire gentilmente as cápsulas de ovos em fixador à TA, durante o tempo apropriado para cada estágio de desenvolvimento (veja a Figura 1). </li><li> Discontinrotação ue e permitir que as cápsulas para afundar e aspire a solução fixadora em um recipiente adequado de lixo. </li><li> Lavam-se as cápsulas de ovos, substituindo a solução fixadora com tampão fosfato com 0,1% de Tween-20 (PBTw) e rodando à TA durante 5 min. Aspirar o PBTw e repetir duas vezes. </li><li> Remover os embriões e larvas das suas cápsulas utilizando o aparelho (ver secção 1 para detalhes) mostrado na Figura 2. Desenhar as cápsulas para a seringa de 20 ml, conectar o tubo e depois dissipar as cápsulas através da tubagem e passado a agulha de vidro para fora o prato coleção. NOTA: Normalmente, a maioria (&gt; 90%) de todas as cápsulas devem precisar apenas uma passagem através do dispositivo. Em muitos casos, a membrana de cápsula é danificado mas embriões e larvas permanecem no interior da cápsula rompida. Reprocessar este material, simplesmente puxando-o para dentro da seringa e dissipando-lo novamente. </li><li> Coletar os embriões descapsulados e larvas em um tubo de 1,5 ml usando um microfoneropipette (a P20 para o 0 - 3 dias larvas de idade, e uma P200 para larvas mais velhas com a extremidade da ponta cortada). NOTA: Uma pausa (até vários meses) no protocolo podem ser feitas nesta fase. Se isso for necessário, o material decapsuled deve ser recolhido num tubo de 1,5 ml para armazenamento (continuar para o próximo passo). Caso contrário, continue imediatamente o Protocolo nº 3. </li><li> Permitir que os embriões e larvas de afundar para o fundo do tubo e aspirar o sobrenadante. Substitua com 33% de etanol (EtOH) em PBTw e deixe descansar por 5 - 10 min. Repita com 66% de EtOH em PBTw e 100% EtOH. Lavar as larvas duas vezes em 100% de EtOH à TA. Armazenar o material a -20 ° C em EtOH a 100%. </li><li> Quando estiver pronto para continuar, re-hidratar as amostras por remoção do EtOH 100% e substituindo com 66% de EtOH em PBTw, deixe descansar por 5 - 10 min. Repita com 33% EtOH em PBTw, deixe descansar por 5 - 10 min. Finalmente lava-se com 3 x 5 min lavagens de PBTw para garantir que todo o EtOH é removido. </li></ol> 3. Proteinase-K, TEA e Pós-fixation NOTA: Encontramos executando as seguintes etapas em pequenos cestos com um piso de malha o método mais eficiente e suave para a troca rápida de soluções críticas de tempo. Embora possa ser feito em casa, usamos cestas (tamanho médio) que são compatíveis com a manipulação de líquidos robô Intavis InSituPro -Vsi (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc). Tais cestos podem ser rapidamente e facilmente movido entre as cavidades de uma placa de cultura de tecidos de 12 (TCD), a fim de soluções de troca, ou a solução pode ser aspirado do poço utilizando uma pipeta. Alternativamente, todas as trocas de solução pode ser realizada sem estes cestos simplesmente por aspiração do sobrenadante a partir das larvas. Neste caso, um movimento rotativo suave irá concentrar-se todos os embriões e larvas para o centro do prato, permitindo-se o sobrenadante para ser removida a partir da borda do poço. O seguinte assume que o usuário está empregando cestas para as trocas de solução. <ol><li> Usando uma pipeta, Transferência de embriões e larvas para um cesto de sentado num TCD 12 poços com 2 ml de PBTw. NOTA:. O número de embriões e / ou larvas que podem ser adicionados depende do estágio de desenvolvimento a ser investigado, no entanto, uma regra geral é manter pelo menos 25% do espaço livre de embriões / larvas (ou seja, não sobrecarregar o cesto). </li><li> Prepara-se uma adjacente bem com 2 ml de solução de proteinase-K apropriado (ver Figura 1), e mais 2 poços com 2 ml de 0,2% de glicina cada. Mover cada cesto para o poço contendo a concentração apropriada de proteinase-K e começar imediatamente a distribuição. </li><li> Após 10 min mover cada cesto dentro de um poço que continha 0,2% de glicina e incubar durante 5 min. Em seguida, mover cada cesto para o segundo poço com 0,2% de glicina e incubar durante 5 min. Lavar a Glycine com 3x 5 mínimo de trocas de 3 ml PBTw. </li><li> Remover a solução PBTw e tratar as amostras uma vez com recentemente preparada Trietanolamina (TEA) Solution por 5 min CUIDADO! Não agite. Substituir com 3 ml de solução de chã recentemente preparado, durante 5 min. Não agite. Aspirar a maioria da solução de chá a partir das amostras. Adicione o Triethanolamine preparada na hora com uma solução de anidrido acético (TEAAA) e incubar por 5 min. CUIDADO! Não agite. </li><li> OPCIONAL - Enquanto o passo acima é a incubação, preparar um outro novo lote de solução de TEAAA e repita o passo acima. NOTA: Este segundo tratamento com TEAAA é opcional, mas pode ajudar a eliminar completamente todo o fundo com sondas propensas a gerar fundo. </li><li> Remover a solução TEAAA, aspirando-o a partir do poço e substituir com 3 ml de PBTw. Não agite. Remover o PBTw e aplicar 3 ml de formaldeído a 3,7% em PBTw. Agite suavemente, ocasionalmente, durante uma incubação de 30 minutos. </li><li> Remover o fixador, aspirando-o a partir do poço e substituir com 3 ml de PBTw. Transferir o material para um tubo de 1,5 ml. REColoque PBTw o tampão de hibridação com e incubar durante 5 min à TA - CUIDADO. </li><li> Colocar os tubos em um bloco quente, à TA, e ajustar a temperatura para a temperatura de hibridização desejado. NOTA: A temperatura de hibridização é sonda específica e terá de ser empiricamente optimizadas, no entanto, achamos 55 ° C até ser uma boa temperatura para inicialmente ensaio. Permitir que o bloco de vir até à temperatura de hibridação, e permitir que as amostras de pré-hibridação durante aproximadamente 15 minutos (isto é, o tempo necessário para preparar as ribossondas, já não é necessária). Prepare os volumes adequados (geralmente 100? L) de ribossondas diluído. Nós concentrações de sonda tipicamente de teste de 100 e 500 ng / ml como uma primeira série. Nós preparamos riboprobes de acordo com a 12. </li><li> Remover o tampão de hibridação a partir das amostras e adicionar a sonda em tampão de hibridização para as amostras. Sobreposição com 100 ul (ou um volume adequado de modo a formar uma fase acima da-manhã de hibridaçãor), do óleo mineral. NOTA: O óleo mineral impede extensa condensação que formarão durante o passo de hibridização longa. Extensa condensação irá alterar de forma significativa tanto a composição química da solução de hibridação e a concentração da sonda. </li><li> Desnaturar a sonda e o alvo de ARN por aquecimento das amostras a 75 ° C durante 10 min, em seguida, reduzir o calor para a temperatura de hibridização desejado. Permitir a hibridação prosseguir durante um mínimo de 12 hr (S / N) ou mais longos (24 - 48 h). </li><li> Durante a hibridação remover um único tubo do bloco de calor, girá-lo rapidamente entre o polegar eo indicador para suspender as larvas sem perturbar a fase de óleo, e substituí-lo no bloco de calor. Repita este uma vez a cada 6-12 horas ou assim. </li></ol> 4. Hot Lava e imunodetecção NOTA: Enquanto nós usamos um robô de manipulação de líquido para as etapas seguintes, estes também podem ser facilmente feito manualmente. Neste caso, embriões e larvas should ser mantido nos tubos de 1,5 ml foram hibridizadas em. Todas as trocas de solução subsequentes são aspirado e adicionado com uma pipeta P1,000. Quando realizada manualmente cada um dos passos que se seguem devem empregar 1 ml de cada solução. <ol><li> os volumes adequados de calor (3 ml cada uma para cada amostra) do 4x, 2x e 1x soluções de lavagem à temperatura de hibridação. </li><li> Lavar todas as amostras três vezes em tampão de lavagem 4x durante 15 minutos cada à temperatura de hibridação. Lavar todas as amostras três vezes em tampão de lavagem 2x durante 15 minutos cada à temperatura de hibridação. Lavar todas as amostras três vezes em 1X tampão de lavagem durante 15 minutos cada à temperatura de hibridação. </li><li> Lavar uma vez com todas as amostras de tampão 1x Cloreto de sódio Citrato de sódio + 0,1% de Tween (SSC + 0,1% de Tween) à temperatura de hibridação. Deixar as amostras de arrefecer até à TA. </li><li> Lave todas as amostras duas vezes em 1x SSC + 0,1% Tween durante 15 min Substitua esta solução SSC 1x com tampão de ácido maleico (MAB) e deixe descansar por 10 min Repita o MAB wcinza. Substituir o MAB com solução de bloqueio e incubar durante 1,5 h. </li><li> Trocar a solução de bloqueio para solução de anticorpos (1: 10000 de anticorpo numa solução de bloqueio) e incubar durante 12 horas (O / N) à temperatura ambiente com agitação suave. </li></ol> 5. Desenvolvimento de cores e de montagem <ol><li> Aspirar a solução de anticorpos e lavagem 15 vezes com PBTw durante 10 min cada. Substituir PBTw com 1x tampão de fosfatase alcalina (AP) e incubar durante 10 min. </li><li> Enquanto o passo de incubação acima receitas, preparar a solução de coloração AP (ver Documento Suplementar 2) - CUIDADO. Transferir o material em um TCD poço e substitui a solução de AP 1x com solução de coloração de AP. Note-se a tempo de forma que o período de tempo a cor da reacção tem lugar durante pode ser gravada. Monitorar o desenvolvimento do padrão de coloração até que o sinal à relação de fundo é óptima. </li><li> Para parar o desenvolvimento da cor, remova a solução de coloração 1x AP (descarte na estavas apropriadae container), e aplicar 2 ml de PBTw e observe o tempo agora. Lavar mais duas vezes com PBTw durante 5 minutos cada. Usar um destes enxaguamentos para transferir o material para um tubo de 1,5 ml. </li><li> Remover o PBTw e aplicar 1 ml de 3,7% de formaldeído em PBTw e agita-se ou rodar em menos de 30 min à temperatura ambiente (isto pode também ser feito S / N). </li><li> Lavar o fixador com 3 lavagens de PBT (descartar o fixador de resíduos em um recipiente adequado de lixo). Lavam-se as amostras 3 vezes a 50 ° C em água desionizada. NOTA: Estas lavagens eliminar a precipitação de sais que podem tornar-se visível durante a limpeza e as etapas de visualização. </li><li> Decidir se as amostras devem ser montados em benzoato de benzilo: Álcool benzílico (BB: BA, também conhecido como clara de Murray) ou glicerol. NOTA: Nós preferimos o mais poderoso agente de compensação BB: BA como L. stagnalis embriões são um tanto opaca. As amostras a serem montados no BB: BA primeiro precisa ser desidratado através de uma série de etanol. As amostras a ser montada em 60%O glicerol pode ser montado imediatamente. </li><li> Transferir as amostras para dentro da solução de montagem (BB: BA ou 60% de glicerol) utilizando uma pipeta. NOTA: Ao montar no BB: BA isso deve ser feito em um copo bem (BB: BA vai derreter o plástico policarbonato). </li><li> Permitir que as amostras para limpar para 5 - 10 min, e depois montá-los sobre uma lâmina utilizando um número apropriado de lamelas empilhados como espaçadores (1 lamela para as amostras &lt;1 CPFD, 2 Lamelas para amostras&gt; 1 CPFD). NOTA: Whole montagens agora pode ser fotografada usando um microscópio composto com DIC óptica. </li></ol>

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Lett. 5 (1), 20-22 (2009).</li><li>Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chiral+blastomere+arrangement+dictates+zygotic+left-right+asymmetry+pathway+in+snails.">Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails.</a> Nature. 462 (7274), 790-794 (2009).</li><li>Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body+handedness+is+directed+by+genetically+determined+cytoskeletal+dynamics+in+the+early+embryo.">Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo.</a> Curr. Biol. 14 (16), 1462-1467 (2004).</li><li>Lu, T. Z., Feng, Z. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sodium+leak+current+regulates+pacemaker+activity+of+adult+central+pattern+generator+neurons+in+Lymnaea+stagnalis.">A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis.</a> PLoS One. 6 (4), e18745 (2011).</li><li>Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Splicing+of+an+Invertebrate+Beta+Subunit+(LCav-beta)+in+the+N-Terminal+and+HOOK+Domains+and+Its+Regulation+of+LCav1+and+LCav2+Calcium+Channels.">Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels.</a> PLoS ONE. 9 (4), e92941 (2014).</li><li>Smith, S. 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Os autores não têm nada a revelar.

O método descrito aqui permite a visualização eficiente de transcrições de RNA com presumivelmente diferentes níveis de expressão dentro de todos os estágios de desenvolvimento de Lymnaea stagnalis. Para remover embriões e larvas de suas cápsulas que trialed uma variedade de produtos químicos, choque osmótico e tratamentos físicos relatados para outra encapsulated- desenvolvimento de organismos-modelo. No entanto, nas nossas mãos o método aqui descrito, é a única técnica de alto rendimento que remove a membrana capsular difícil sem danificar os embriões e larvas. Após o desencapsulamento, o material pode ser armazenado, ou tratado com um regime específico fase de proteinase-K e, em seguida, hibridados com uma ribossonda. esforços de otimização empíricos adicionais (tipicamente focados em concentração de sonda e temperatura de hibridização) pode ser necessária para cada sonda / alvo. Estes parâmetros (além do regime de fixação e tratamentos de proteinase-K) são normalmente os parâmetros mais influentesde qualquer experiência in situ (assumindo que a qualidade do material fixo e a sonda de ARN são de um nível elevado). A importância de um tratamento adequado Proteinase-K para o resultado final de uma experiência in situ é fundamental para L. stagnalis. Isto reflecte-se na grande variedade de concentrações de proteinase-K requeridas pelo estágios de desenvolvimento distintos (variando de 0 ug / ml a 500 ug / ml). Por isso, é importante ser capaz de atribuir uma determinada cadeia de ovo para uma janela ontogenético. Para este fim, a orientação que nós fornecemos na Figura 1 permite a realização de material de desenvolvimento de idades desconhecidas (a versão para impressão deste valor está disponível no Documento Suplementar 3 que os usuários podem achar útil ter ao microscópio quando estadiamento do material) . Nota-se que para outras espécies de gastrópodes tratamentos proteinase-K para WMISH pode ser mantido constante para uma ampla gama de desenpmental fases 8,25,26, ou podem ser inteiramente omitidas 27. Isto está em contraste com a situação em L. stagnalis. Além disso, enquanto que outros grupos de pesquisa têm relatado anteriormente os padrões de expressão de vários genes WMISH em L. stagnalis larvas (ver 22,28,29) o método que nós descrevemos aqui produz padrões de significativamente maior resolução espacial. Finalmente, observou-se significativa variação inter-grupo na actividade da proteinase-K do nosso fornecedor. Esta variação tem que ser contabilizadas através da realização de um ciclo de calibração &#39;&#39; WMISH experiências em que a actividade da nova proteinase-K é determinada empiricamente. Todas as experiências subsequentes com alíquotas de proteinase-K de cada lote pode, então, ser realizado livremente. Nós previamente descrito um método WMISH alternativa para L. embriões stagnalis e larvas em outro lugar 12. Esse método detalhado da utilização do mucolytagente IC N-acetil-L-cisteína (NAC), um agente redutor tal como ditiotreitol (DTT) e um tratamento de pré-hibridação com sulfato de dodecil de sódio (SDS). Encontramos esses tratamentos melhorados os padrões de coloração de alguns genes para alguns estágios de desenvolvimento. A estratégia de fixação que, recentemente desenvolvido e descrever aqui (fixação larvas dentro de suas cápsulas) simplifica e agiliza as etapas necessárias para preparar o material para uma experiência in situ, e aparentemente nega a necessidade de determinar empiricamente ótimas tratamentos pré-hibridação adicionais com NAC, DTT ou SDS. Refinamentos futuras para a técnica aqui relatada poderia incluir a visualização de microRNAs (após alterações aos protocolos WMISH padrão previamente relatados 30), rotulagem dobro ou o triplo do mRNA alvo 31 e visualização fluorescente de sinais WMISH 32. Sem dúvida o maior limitação da técnica é o comprimento total de tempo que leva para ir de colectinag do material, para uma imagem digital que representa um padrão de expressão do gene determinado. Devido à natureza dos acontecimentos bioquímicos e biofísicos que devem ter lugar durante um tal processo é uma característica inerente mais em protocolos de hibridação in situ. Lymnaea ocupa uma posição dentro do Metazoa que é extremamente sub-representados em termos de organismos modelo. Como Spiralian representante, Lymnaea pode trazer insights sobre a evolução das características morfológicas distintas, tais como formação de concha 12 e do corpo lateralidade 33-35 e é também uma valiosa neuroethology 36 e neurofisiologia modelo de 9,37. Poderosas técnicas, tais como a capacidade de visualizar de forma eficiente os padrões de expressão de genes in situ aumenta a funcionalidade de Lymnaea como um organismo modelo, e alarga a gama de perguntas que podem ser utilizados para tratar. Numa altura em que a geração de grande dat sequênciaasets (transcriptomes completos e até mesmo genomas) é relativamente de rotina, tais métodos tornam-se mais relevantes para os investigadores que pretendam interpretar o fluxo de dados de sequência de tais modelos. Enquanto Lymnaea é um gastrópode relativamente derivado 38, e possui o que seria considerado um grande genoma em comparação com outros organismos-modelo (1,22 Gb 39), tem muitas características práticas e interessantes que o tornam um sistema modelo atraente. Os métodos que descrevemos aqui expandir a caixa de ferramentas disponíveis para Lymnaea e pode ser útil para outras espécies que passam por desenvolvimento encapsulados.

Os moluscos são um grupo de animais que mantêm o interesse de uma ampla diversidade de disciplinas científicas. Apesar da sua diversidade morfológica 1, riqueza de espécies (perdendo apenas para os artrópodes em termos de número de espécies 2) e relevância para uma ampla gama de comerciais 3, médicos e científicos 4 questões 5-8, há relativamente poucas espécies de moluscos que podem reivindicar a ser ambos os modelos científicos bem equipados e fácil de manter em um ambiente de laboratório. Um molusco que é muito usado por disciplinas como a neurobiologia 9, ecotoxicologia 10 e, mais recentemente, a biologia evolutiva 11,12, é Lymnaea stagnalis, principalmente devido à sua ampla distribuição e extrema facilidade de manutenção. Apesar de sua popularidade como um organismo &quot;modelo&quot; e sua longa história de uso por biólogos do desenvolvimento 13-19, o alcance e poder de ferramentas moleculares disponíveis para a L. stagnalis comunidade científica encontra-se muito atrás da de modelos mais tradicionais de origem animal (Drosophila, rato, ouriço do mar, nemátodos). O nosso desejo de desenvolver Lymnaea como um modelo molecular surge do interesse nos mecanismos moleculares que orientam a formação de shell. Isso nos motivou a refinar um conjunto de técnicas que permitam a visualização eficiente, consistente e sensível da expressão de genes durante o desenvolvimento de Lymnaea. Montagem inteira de hibridização in situ (WMISH) é amplamente utilizado para uma variedade de organismos-modelo e tem sido usado por mais de 40 anos 20. Nas suas diferentes formas, ISH pode ser empregue para localizar espacialmente loci específicos nos cromossomas, ARNr, ARNm e micro-ARN. Um dos desafios que precisávamos para resolver antes da refinação um método WMISH para L. stagnalis foi a questão do cuidado e de forma eficiente extração embriões e larvas de diferentes estágios de tele cápsulas de ovos em que são depositadas. Esta extracção, ou &#39;desencapsulamento&#39;, tem de ser conseguida de forma eficiente, a fim de recolher o material adequado para uma determinada experiência in situ, enquanto, ao mesmo tempo mantendo a integridade morfológica e celular. Enquanto outros organismos modelo também submetidos a um desenvolvimento encapsulado, em nossas mãos nenhum dos métodos descritos para as espécies poderia ser empregada com sucesso em L. stagnalis. Os objetivos gerais deste método são, portanto: para extrair L. stagnalis embriões e larvas de suas cápsulas em uma forma de alto rendimento, para aplicar tratamentos pré-hibridação que optimizam o sinal WMISH, para preparar embriões e larvas com WMISHsignals satisfatórios para a imagem latente.

<table><tbody><tr><td>Featherweight forceps</td><td>Ehlert &amp;amp; Partner</td><td>#4181119</td><td></td></tr><tr><td>Silicon tubing</td><td>Glasger&amp;auml;tebau OCHS GmbH</td><td>760070</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillaries</td><td>Hilgenberg</td><td>1403547</td><td></td></tr><tr><td>12 well tissue culture dishes</td><td>Carl Roth</td><td>CE55.1</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyde</td><td>Carl Roth</td><td>P733.1</td><td>CAUTION - May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed.</td></tr><tr><td>Ethylenediamine tetraacetic acid</td><td>Carl Roth</td><td>CN06.3</td><td>CAUTION - CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.1</td><td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll type 400</td><td>Carl Roth</td><td>CN90.1</td><td></td></tr><tr><td>polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40)</td><td>Carl Roth</td><td>4607.1</td><td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.</td></tr><tr><td>Nuclease freeBovine Serum Albumin</td><td>Carl Roth</td><td>8895.1</td><td></td></tr><tr><td>Salmon sperm</td><td>Carl Roth</td><td>5434.2</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Carl Roth</td><td>7692.1</td><td>CAUTION - ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH</td></tr><tr><td>Proteinase-K</td><td>Carl Roth</td><td>7528.1</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl Roth</td><td>3790.2</td><td></td></tr><tr><td>Deionised formamide</td><td>Carl Roth</td><td>P040.1</td><td>CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.</td></tr><tr><td>Standard formamide</td><td>Carl Roth</td><td>6749.3</td><td>CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.</td></tr><tr><td>Triethanolamine</td><td>Carl Roth</td><td>6300.1</td><td>CAUTION - Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling.</td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Carl Roth</td><td>4483.1</td><td>CAUTION - CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT</td></tr><tr><td>Maleic acid</td><td>Carl Roth</td><td>K304.2</td><td>CAUTION - Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin.</td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Sigma</td><td>B6630-250ML</td><td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed.</td></tr><tr><td>Benzyl alcohol</td><td>Sigma</td><td>10,800-6</td><td>CAUTION - Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Carl Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>Blocking powder</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Anti DIG Fab fragments AP conjugated</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Carl Roth</td><td>9090.3</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>4421.3</td><td>CAUTION - May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes.</td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate</td><td>Carl Roth</td><td>A155.3</td><td>CAUTION - Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>N-acetyl cysteine</td><td>Carl Roth</td><td>4126.1</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Carl Roth</td><td>6908.1</td><td>CAUTION - May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.</td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma</td><td>NP40S</td><td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulphate</td><td>Carl Roth</td><td>CN30.3</td><td>CAUTION - Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation.</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Carl Roth</td><td>4984.1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Tri sodium citrate dihydrate (C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Carl Roth</td><td>3580.1</td><td>CAUTION - May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.</td></tr><tr><td>Mineral oil&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>HP50.2</td><td></td></tr><tr><td>InSituPro-Vsi&amp;nbsp;</td><td>Intavis</td><td></td><td>www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc</td></tr></tbody></table>

a whole mount in situ hybridization method for the gastropod mollusc lymnaea stagnalis

Montagem inteira de hibridização in situ (WMISH) é uma técnica que permite a resolução espacial das moléculas de ácidos nucleicos (ARNs mensageiros) muitas vezes dentro de uma preparação de tecido &#39;todo de montagem &quot;, ou fase de desenvolvimento (tais como um embrião ou larva) de interesse. WMISH é extremamente poderoso, pois pode contribuir significativamente para a caracterização funcional de genomas metazoários complexos, um desafio que está se tornando mais um gargalo com o dilúvio de dados de sequências de próxima geração. Apesar da simplicidade conceptual da técnica muito tempo é muitas vezes necessária para optimizar os vários parâmetros inerentes às experiências WMISH para novos sistemas de modelo; diferenças subtis nas propriedades celulares e bioquímicas entre tipos de tecidos e estágios de desenvolvimento significa que um único método WMISH pode não ser apropriada para todas as situações. Temos desenvolvido um conjunto de métodos WMISH para o modelo de gastrópode Lymnaea stagnalis reemergentes que geram consistente esinais WMISH claras para uma variedade de genes, e em todos os estágios de desenvolvimento. Estes métodos incluem a atribuição de larvas de idade cronológica desconhecido para uma janela ontogênica, a remoção eficaz dos embriões e larvas das suas cápsulas de ovos, a aplicação de um tratamento de proteinase-K apropriado para cada janela ontogênica, e hibridação, de pós-hibridação e imunodetecção passos. Estes métodos proporcionam uma base a partir da qual o sinal resultante para um dado transcrito de ARN pode ser adicionalmente refinado com ajustes específicos de sonda (sonda principalmente a concentração e a temperatura de hibridação).

Os padrões de coloração WMISH representante mostrados na Figura 3 foram geradas utilizando a técnica acima descrita, e refletem uma variedade de padrões de expressão espacial para genes envolvidos em uma variedade de processos moleculares que variam de formação de concha (novo gene 1, 2, 3 e 4), à sinalização célula-célula (DPP) para regulação da transcrição (Brachyury) através de uma série de estágios de desenvolvimento. Embora não tenham quantificado os níveis destes genes espera-se que eles também faria expressão variar significativamente, indicando que o método pode ser aplicado de encontro a uma ampla variedade de produtos de genes expressos em todas as fases de desenvolvimento em vários níveis. Apenas um dos genes aqui apresentados (DPP), foi anteriormente descrito em L. stagnalis 21,22. Os resultados que apresentamos aqui são em grande parte de acordo com os relatórios anteriores, mas com significativamente maior reso espacial<html> lução. O padrão de expressão espacial de Brachyury foi descrito no olmo 23 e 24 de lapa e em ambos os casos também foi detectado em células do manto como encontramos para L. stagnalis (Figura 3F). Nós isolado genes Novel 1-4 (de um ecrã proteômica projetado para identificar produtos de genes diretamente envolvidos na formação da casca, e assim por seus padrões de expressão espaciais associadas com a glândula shell (Figura 3A e B) ou o campo shell (Figura 3C e D) são totalmente congruentes com as funções de formação de casca. Estes resultados indicam que a técnica de transferência de alta temos desenvolvido para a remoção de embriões e larvas da cápsula de ovo, e os subsequentes tratamentos de permeabilização específico de fase, gerar amostras inteiras de montagem que vai produção de alta qualidade de coloração in situ padrões para uma vasta variedade de genes para todas as fases do desenvolvimento embrionário e larval. ove_content &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53968/53968fig1.jpg" /> Figura 1. Um Resumida ontogenia de Lymnaea stagnalis e fixação correspondente e proteinase-K tratamentos. Imagens representativas de embriões e larvas de os primeiros 7 dias de desenvolvimento ilustram um aumento significativo no tamanho (linha 1) e da complexidade morfológica (linhas 2 e 3) . Estas mudanças de desenvolvimento se traduzem em grandes diferenças no tempo de fixação apropriado e as concentrações de proteinase-K, que geram sinais WMISH óptimas. Para WMISH todas as etapas devem ser fixados em 3,7% de formaldeído em PBS à temperatura ambiente com agitação suave dentro de suas cápsulas de ovos. Todas as fases devem ser, em seguida, tratado com a concentração apropriada de proteinase-K durante 10 minutos. Note que observamos significativa variação inter-lote na atividade de proteinase-K do nosso fornecedor. Esta variação deve ser explicada por performing um ciclo de calibração &#39;&#39; WMISH experiências em que a actividade da nova proteinase-K é determinada empiricamente. As concentrações Proteinase-K indicados na figura deve, portanto, ser tratado como um guia inicial, no entanto, as concentrações relativas entre os estágios de desenvolvimento (por exemplo, 2 dias embriões velhos exigem uma concentração proteinase-K 3 vezes mais elevados do que o dia 1 embriões) são definidas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53968/53968fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53968/53968fig2.jpg" /> Figura 2. Os aparelhos utilizados para Decapsule L. stagnalis embriões. (A) Uma visão geral do aparelho que pode eficientemente remover L. embriões stagnalis e larvas de suas cápsulas. (B) A ampliada vistaa área de box amarelo em (A). Uma agulha afiada vidro é colocada sobre a lâmina do microscópio e inserido no tubo de silicone (diâmetro interno de 1 mm, 3 mm de diâmetro exterior) de tal modo que a ponta se projecta aproximadamente 20% do caminho para dentro da cavidade do tubo. A agulha de vidro é então também gravadas na lâmina de microscópio e a placa de Petri. (C) A opinião de um «plano» esquemática da seção em caixa amarela em cápsulas de ovos A. contendo embriões fixos e larvas são primeiramente recolhidos utilizando a seringa de 20 ml. A seringa é, então, ligado ao tubo de silicone e as cápsulas expelido através do tubo e após a agulha. Membranas cápsula de ovo são rasgadas pela agulha eo material embrionário e larval libertada pode ser recolhida a partir do prato de coleção usando uma micropipeta. (D) Uma visão esquemática &quot;seção transversal&quot; da seção em caixa amarela no A. A lâmina de microscópio garante que o agulha entra no tubo de silicone na altura correta. <strong&gt; (E) A visão representativa de larvas antes de serem processadas pelo aparelho decapsuling. (F) A visão representativa de larvas que fizeram uma única passagem através do aparelho. Mais de 90% do material foi removido de forma eficaz e suavemente de suas cápsulas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53968/53968fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53968/53968fig3.jpg" /> Figura 3. Imagens representativas dos padrões de expressão WMISH contra uma variedade de genes de uma série de L. . Fases stagnalis Developmental produzidas pelo método aqui descrito Todos os estágios de desenvolvimento foram processados ​​tal como descrito no método acima, tendo sido montada e fotografada em APA: BA (Murray claro). idades aproximadas são indicados no ap direito de cada painel e a orientação é indicado no canto inferior direito. ortologia Gene (quando conhecido) é indicado no canto inferior esquerdo de cada painel. Abreviaturas: glândula shell (sg); campo de shell (sf); manto (mt); pé (pé); Decapentaplégico (DPP); CPFD (dias após a primeira clivagem). Todas as barras de escala são 20 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53968/53968fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

A Monte Whole<em&gt; In Situ</em&gt; Método de hibridação para o molusco gastrópode<em&gt; stagnalis Lymnaea</em

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

8.8K visualizações.  Georg-August University of Göttingen. The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

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A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American lobsters. Recent work in exploited crustacean populations (crabs and lobsters) suggests that there are circumstances where mature females are unable to achieve their full reproductive potential due to sperm limitation. To examine this possibility in different regions of the American lobster fishery, a reliable and noninvasive method was developed for sampling large numbers of female lobsters at sea. This method involves inserting a blunt-tipped needle into the female&#39;s seminal receptacle to determine the presence or absence of a sperm plug and to withdraw a sample that can be examined for the presence of sperm. A series of control studies were conducted at the dock and in the laboratory to test the reliability of this technique. These efforts entailed sampling 294 female lobsters to confirm that the presence of a sperm plug was a reliable indicator of sperm within the receptacle and thus, mating. This paper details the methodology and the results obtained from a subset of the total females sampled. Of the 230 female lobsters sampled from George&#39;s Bank and Cape Ann, MA (size range = 71-145 mm in carapace length), 90.3% were positive for sperm. Potential explanations for the absence of sperm in some females include: immaturity (lack of physiological maturity), breakdown of the sperm plug after being used to fertilize a clutch of eggs, and lack of mating activity. The surveys indicate that this technique for examining the mating success of female lobsters is a reliable proxy that can be used in the field to document reproductive activity in natural populations.

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters Homarus americanus

Fishery-induced changes to exploited crustacean fisheries, such as the American lobster fishery, could potentially influence their reproductive dynamics, leading to a reduction in mating success. This study&#39;s goal was to develop a noninvasive method for ascertaining the mating success of female lobsters that may be physiologically or functionally mature.

Um método não invasivo para<em&gt; Em situ</em&gt; Determinação do sucesso de acasalamento em fêmeas lagostas americanas (<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American ...

Ambiente

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ocean temperatures and ocean acidification, corals are increasingly under threat. To tackle these challenges, advances in cell and molecular biology have proven to be crucial for diagnosing the health of corals. Modifying some of the techniques commonly used in human medicine could greatly improve researchers&#39; ability to treat and save corals. To address this, a protocol for in situ hybridization used primarily in human medicine and evolutionary developmental biology has been adapted for use in adult corals under stress.
The purpose of this method is to visualize the spatial expression of an RNA probe in adult coral tissue that has been embedded in paraffin and sectioned onto glass slides. This method focuses on removal of the paraffin and rehydration of the sample, pretreatment of the sample to ensure permeability of the sample, pre-hybridization incubation, hybridization of the RNA probe, and visualization of the RNA probe. This is a powerful method when using non-model organisms to discover where specific genes are expressed, and the protocol can be easily adapted for other non-model organisms. However, the method is limited in that it is primarily qualitative, because expression intensity can vary depending on the amount of time used during the visualization step and the concentration of the probe. Furthermore, patience is required, as this protocol can take up to 5 days (and in many cases, longer) depending on the probe being used. Finally, non-specific background staining is common, but this limitation can be overcome.

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

The goal of this protocol is to perform in situ hybridization on adult coral samples that have been embedded in paraffin and sectioned onto glass slides. This is a qualitative method used to visualize the spatial expression of an RNA anti-sense probe in paraffin-embedded tissues.

In Situ Técnicas de hibridização para amostras de Coral adultas parafina

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of genes. Prior research into this emerging model system capitalized on comprehensive genome-wide investigations that have identified numerous quantitative trait loci (QTL) associated with various cave-associated phenotypes. However, the ability to connect genes of interest to the heritable basis for phenotypic change remains a significant challenge. One technique that can facilitate deeper understanding of the role of development in troglomorphic evolution is whole-mount in situ hybridization. This technique can be implemented to directly compare gene expression between cave- and surface-dwelling forms, nominate candidate genes underlying established QTL, identify genes of interest from next-generation sequencing studies, or develop other discovery-based approaches. In this report, we present a simple protocol, supported by a flexible checklist, that can be widely adapted for use well beyond the presented study system. It is hoped that this protocol can serve as a broad resource for the Astyanax community and beyond.

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

This protocol enables visualization of gene expression in embryonic Astyanax cavefish. This approach has been developed with the goal of maximizing gene expression signal, while minimizing non-specific background staining.

Hibridização In Situ de Embriões Inteiros de Astyanax

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Biologia do Desenvolvimento

Spatial High-resolution Analysis of Gene Expression Levels in Tendons

In recent years, many protocols have been developed for high-resolution transcriptomics in many different medical and biology fields. However, matrix-rich tissues, and specifically, tendons were left behind due to their low cell number, low RNA amount per cell, and high matrix content, which made them complicated to analyze. One of the recent and most important single-cell tools is the spatial analysis of gene expression levels in tendons. These RNA spatial tools have specifically high importance in tendons to locate specific cells of new and unknown populations, validate single-cell RNA-seq results, and add histological context to the single-cell RNA-seq data. These new methods will enable the analysis of RNA in cells with exceptional sensitivity and the detection of single-molecule RNA targets at the single-cell level, which will help to molecularly characterize tendons and promote tendon research. 
In this method paper, we will focus on the available methods to analyze spatial gene expression levels on histological sections by using novel in situ hybridization assays to detect target RNA within intact cells at single-cell levels. First, we will focus on how to prepare the tendon tissue for the different available assays and how to amplify target-specific signals without background noise but with high sensitivity and high specificity. Then, the paper will describe specific permeabilization methods, the different probe designs, and the signal amplification strategies currently available. These unique methods of analyzing transcription levels of different genes in single-cell resolution will enable the identification and characterization of the tendon tissue cells in young and aged populations of various animal models and human tendon tissues. This method will also help analyze gene expression levels in other matrix-rich tissues such as bones, cartilage, and ligaments.

<meta charset="utf8"></head><body>Análise espacial de alta resolução dos níveis de expressão gênica em tendões

This article describes how to perform an optimized in situ protocol for tendons. This method discusses tissue preparation, section permeabilization, probe design, and signal amplification methods.

Análise espacial de alta resolução dos níveis de expressão gênica em tendões

In recent years, many protocols have been developed for high-resolution transcriptomics in many different medical and biology fields. However, matrix-rich ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Monte todo In Situ Hibridação de E8.5 de Embriões E11.5 rato

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Biologia

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male urethra, which relies on androgenic signals and epithelial-mesenchymal interactions1,2. Understanding the molecular mechanisms responsible for prostate development may reveal growth mechanisms that are inappropriately reawakened later in life to give rise to prostate diseases such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer.
The developing LUT is anatomically complex. By the time prostatic budding begins on 16.5 days post conception (dpc), numerous cell types are present. Vasculature, nerves and smooth muscle reside within the mesenchymal stroma3. This stroma surrounds a multilayered epithelium and gives rise to the fetal prostate through androgen receptor-dependent paracrine signals4. The identity of the stromal androgen receptor-responsive genes required for prostate development and the mechanism by which prostate ductal epithelium forms in response to these genes is not fully understood. The ability to precisely identify cell types and localize expression of specific factors within them is imperative to further understand prostate development. In situ hybridization (ISH) allows for localization of mRNAs within a tissue. Thus, this method can be used to identify pattern and timing of expression of signaling molecules and their receptors, thereby elucidating potential prostate developmental regulators.
Here, we describe a high throughput ISH technique to identify mRNA expression patterns in the fetal mouse LUT using vibrating microtome-cut sections. This method offers several advantages over other ISH protocols. Performing ISH on thin sections adhered to a slide is technically difficult; cryosections frequently have poor structural quality while both cryosections and paraffin sections often result in weak signal resolution. Performing ISH on whole mount tissues can result in probe trapping. In contrast, our high throughput technique utilizes thick-cut sections that reveal detailed tissue architecture. Modified microfuge tubes allow easy handling of sections during the ISH procedure. A maximum of 4 mRNA transcripts can be screened from a single 17.5dpc LUT with up to 24 mRNA transcripts detected in a single run, thereby reducing cost and maximizing efficiency. This method allows multiple treatment groups to be processed identically and as a single unit, thereby removing any bias for interpreting data. Most pertinently for prostate researchers, this method provides a spatial and temporal location of low and high abundance mRNA transcripts in the fetal mouse urethra that gives rise to the prostate ductal network.

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Here, we describe an efficient high throughput in situ hybridization (ISH) method for visualizing patterns of mRNA expression in developing fetal mouse prostate tissue sections. The method can be easily adapted to visualize mRNA expression patterns in other mouse tissues or in tissues from other species.

A High Throughput In situ Método de hibridização para caracterizar padrões de expressão de mRNA no Rato Fetal Trato urogenital inferior

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridação em embriões de Mount inteiros e histologia de células Adaptado para Elasmobrânquios Marinhos

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and activating sperm, the components in the seminal fluid can also influence female physiology to augment fertilization success of the sperm donor. While many studies have reported such effects in species with separate sexes, few studies have addressed this in simultaneously hermaphroditic animals. This video protocol presents a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using a simultaneously hermaphroditic freshwater snail, the great pond snail Lymnaea stagnalis, as model organism. While the procedure is shown using complete prostate gland extracts, individual components (i.e., proteins, peptides, and other compounds) of the seminal fluid can be tested in the same way. Effects of the receipt of ejaculate components on egg laying can be quantified in terms of frequency of egg laying and more subtle estimates of female reproductive performance such as egg numbers within each egg masses. Results show that seminal fluid proteins affect female reproductive output in this simultaneous hermaphrodite, highlighting their importance for sexual selection.

This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Efeito do Masculino Acessório Gland produtos em postura de ovos em gastrópode

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. The sipunculid worm Sipunculus nudus is a crucial fishery resource as it has high nutritional and medicinal values. Currently, the research on the molecular biology of Sipunculus nudus is still in its infancy. The purpose of this article is to develop a sensitive method for localizing specific mRNA in Sipunculus nudus coelomic fluid. The protocol includes detailed steps of ISH, including digoxigenin-labeled antisense and sense riboprobe preparation, coelomic fluid collection and section preparation, specific riboprobe hybridization, antibody incubation, coloration and post-coloration treatments. The representative results obtained from a successful experiment using this method are demonstrated. The protocol should be applicable to other Sipuncula species as well.

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

This protocol describes an effective in situ hybridization approach to detect the mRNA expression levels and spatial patterns of target genes in Sipunculus nudus coelomic fluid.

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...

A Monte Whole

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Um método não invasivo para

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Hibridização In Situ de Embriões Inteiros de Astyanax

Análise espacial de alta resolução dos níveis de expressão gênica em tendões

Análise espacial de alta resolução dos níveis de expressão gênica em tendões

Monte todo In Situ Hibridação de E8.5 de Embriões E11.5 rato

A High Throughput In situ Método de hibridização para caracterizar padrões de expressão de mRNA no Rato Fetal Trato urogenital inferior

RNA

Efeito do Masculino Acessório Gland produtos em postura de ovos em gastrópode

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid