Agradecemos MR Helmus para o voice-over, CM Popelier, S. Ypenburg e C. Levesque para assistência técnica. Esta pesquisa é financiada pela Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO), a Academia Real Holandesa de Artes e Ciências (KNAW) ea Organização Student Services Japan (JASSO). Esta publicação foi apoiada por uma bolsa de Acesso Aberto de NWO para JMK.

1. Criatório <ol><li> Obter espécimes adultos de Lymnaea stagnalis (L.) a partir de uma cultura de laboratório como o da Universidade VU. </li><li> Manter a água baixo teor de cobre a 20 ° C, tanto no criatório (molluscarium) e tanques experimentais, que têm troca de água contínuo. </li><li> Definir o ciclo claro / escuro de 12 horas: 12 horas. </li><li> Para reprodução, alimentar os caramujos adultos sem pesticidas ad libitum alface, alimentar os jovens juvenis com TetraPhyll (alimentos peixes) flocos. Manter caramujos em tanques separados de acordo com sua idade, a partir de massas de ovos que são colocados dentro de um prazo de 24 horas. </li><li> Uma vez que os caracóis são removidas dos tanques de criação não são devolvidas, para evitar os efeitos de terem sido mantidos em condições ligeiramente diferentes, bem como para prevenir pseudoreplicação. </li></ol> 2. Dissecção <ol><li> Isolar os caracóis por 1 semana, e alimentá-los à vontade, para garantir that têm esperma completo e lojas fluido seminal. </li><li> Prepare um microscópio estéreo, uma placa de dissecação com pinos, pequenas tesouras cirúrgicas, fórceps finos e grossos, uma seringa de 10 ml preenchida com uma solução de MgCl2 50 mM, agulhas de injeção (0.3 mm x 13 mm) e algumas toalhas de papel. </li><li> Eutanásia um caracol através da injeção de solução de MgCl2 (geralmente de 3 ml ou mais para caramujos adultos com um comprimento de concha de 31,6 ± 2,1 mm e peso úmido de 2,89 ± 0,55 g). Penetrar o pé com a agulha de injecção em um ângulo de 45 ° e injectar através da aplicação de uma pressão suave de forma contínua até o caracol relaxa e permanece estendida (em segundos). Retire a agulha de injeção e verifique se o caracol é sacrificado (por exemplo, verificar se o reflexo de retirada tentáculo está ausente). </li><li> Com cuidado, retire a casca após a sua curvatura, usando uma pinça grossa. No meio do caminho, retire delicadamente o músculo columela da concha, raspando com a pinça. Gire suavemente tele caracol fora de seu escudo, seguindo a direção do enrolamento da concha. </li><li> Coloque o caracol na placa de dissecação e de definir a extremidade traseira do pé. Em seguida, coloque um alfinete através da cabeça e coloque um pouco de tensão sobre o caracol para facilitar a dissecção. </li><li> Localize o gonóporo feminino, que irá, mais tarde, ser um ponto de referência para dissecção. </li><li> Usando a tesoura cirúrgica e uma pinça fina, fazer a primeira incisão, logo abaixo da borda do manto e cortou para o gonóporo feminino. Quando uma das lâminas das tesouras é empurrado para debaixo da parede do corpo, levante um pouco para garantir que apenas a parede do corpo, e nenhum dos órgãos internos, é cortado. Continue cortando acima da gonóporo para a cabeça e cortar em uma linha reta. </li><li> Localize a próstata (posterior) e vesículas seminais (anterior). Dissecar estes para fora com cuidado e mantê-los no gelo. Use-os para fazer as soluções de ensaio contendo fluido e / ou esperma seminal. Use fisiológico sal Lymnaeaina (5,83 mmol / L de CaCl 2 · 2H 2 O, 3,76 mmol / L de MgCl2 · 6H 2 O, 42,69 mmol / L de NaCl, 37,53 mmol / L de KCl) como um meio de suporte. </li><li> Recolhe-se o fluido seminal que está presente no lúmen da glândula da próstata, bem como o esperma das vesículas seminais. Subsequentemente, suspende, tanto em solução salina, em frascos separados, expressando suavemente o seu conteúdo e removendo o tecido do órgão com uma pinça. Manter em gelo e usar o mesmo dia. Mais tarde, misturar estas suspensões para criar as diferentes soluções de tratamento. </li></ol> 3. Intravaginal Injeção <ol><li> Antes de iniciar o procedimento de injeção intravaginal, prepare um silício shell-molde (feito para caber a ponta do shell), seringas de 1 mm, 10-12 cm tubos de silicone com um diâmetro de 1 mm, embotada agulhas de injeção (0.3 mm x 13 mm ), fórceps grosseiras e da mesma seringa de 10 ml cheio com uma solução de 50 mM de MgCl 2 equipada com uma agulha de injecção afiada. </li><li> Recolhe-se o esperma, necessário adicionar ao líquido seminal (ou proteínas de fluidos seminais individuais) em alguns tratamentos; uma dose biologicamente relevante é igual a 1/3 de uma glândula da próstata e vesícula seminal por injecção. NOTA: Na seção representante resultados (Figura 1) os resultados de um experimento com três tratamentos diferentes são mostrados: controle (meio transportador, ou seja, solução salina), Ovipostatin (uma das proteínas do líquido seminal identificados) sozinho e Ovipostatin acompanhado com esperma. Além disso, para calcular a dose biologicamente relevante em outras espécies, determinar a diferença no peso da glândula da próstata de indivíduos que foram recentemente acasaladas e indivíduos que permaneceram sexualmente isolado 16. </li><li> Prepare seringas de 1 ml para cada uma das soluções de teste preparadas. Encha cada seringa com uma solução e garantir que não há bolhas de ar no interior. </li><li> Coloque uma agulha de injeção embotada em cada seringa. </li><li> Para injecção utilizar um 1tubo de silicone mm de diâmetro, com um comprimento mínimo de 10 cm. </li><li> Deslize cuidadosamente o tubo de silicone ao longo da agulha de injecção, tendo cuidado para não furar o tubo e remover o ar a partir do tubo, aplicando suavemente a pressão no êmbolo da seringa. </li><li> Anestesiar um caracol, seguindo o mesmo protocolo que no ponto 2.3. Desta vez, certifique-se não injetar mais de 2-3 ml de 50 mM de MgCl2. </li><li> Coloque o caracol no shell-mold para mantê-lo em uma posição estável. </li><li> Localize o gonóporo feminina, que é claramente visível como uma mancha branca no lado direito do animal, anterior ao tentáculo direito e gonóporo masculino (este local também se aplica a outras espécies de caramujos de água doce). Certifique-se de ter acesso livre. </li><li> Use uma pinça de segurar a extremidade do tubo de silicone e suavemente inserir cerca de 2-4 mm do tubo de silicone para o gonóporo fêmea. </li><li> Cuidadosamente aplicar pressão para a seringa e injectar 0,03 ml da solução de teste. Espere meia minute para permitir que a pressão no tubo para se propagar no tracto fêmea antes da remoção do tubo. </li><li> Devolver o caracol tratada para o seu recipiente de isolamento, em que ele pode ser monitorizada, e permitir a recuperação a partir de sedação no tanque experimental. </li></ol> 4. Bioensaio <ol><li> Identifique cada caracol para a identificação e medir o seu comprimento de concha. Este último é um bom indicador do tamanho, o que é relevante ao quantificar a produção de descendência. </li><li> Mantenha cada caracol isolado em um recipiente de 460 ml que é perfurado para permitir a troca de água dentro do tanque experimental. É importante colocar todos os recipientes na orientação correcta, com as perfurações na direcção do fluxo de água, para permitir a troca de água eficiente. </li><li> Durante o ensaio biológico, alimentar os caracóis regularmente com uma quantidade padronizada de alface. Use uma rodada, perfurador de metal para cortar alface. Neste protocolo são usados ​​discos de alface de 19,6 cm 2, que se aproxima a umamontar eles máximo pode comer em um dia. </li><li> Coletar uma massa de ovos usando o lado liso de uma espátula e raspe a massa de ovos da parede do recipiente. Use o lado da colher para recolher a massa de ovos. NOTA: massas de ovos opacas que acabam de ser definidos não pode ser usado para a digitalização (que se tornem transparentes dentro de algumas horas após a postura). Para as espécies modelo neste protocolo, stagnalis Lymnaea, verifique se há massas de ovos todos os dias, uma vez que produzem 2-3 massas de ovos por semana. Isto pode variar em outras espécies. </li><li> Digitalize as massas de ovos coletadas digitalmente, utilizando um (laptop) computador que contém o driver do scanner, um scanner de mesa, uma escala de milímetros standard, uma espátula, transferir placas e telhas de vidro. </li><li> Coloque cada massa de ovos sobre as placas de transferência e repetir até que as placas estão cheios. Posteriormente, dab as massas de ovos secar em papel toalha e transferi-los para as telhas de vidro na mesma ordem como nas placas de transferência. </li><li> Vire cada telha de cabeça para baixo (omassas de ovos vai ficar com a telha de vidro) e colocá-lo cuidadosamente no scanner de mesa, logo abaixo da escala milimétrica. Aplique um pouco de pressão para achatar as massas de ovos, que irá distribuir os ovos uniformemente para todos eles são visíveis dentro do mesmo plano de foco. Coloque os azulejos com uma quantidade padronizada de fita em torno de dois gumes para assegurar que todos os ovos são achatados de forma igual. </li><li> Ajuste as configurações do scanner. É importante para ajustar a resolução para o máximo, fazer uma digitalização de visualização, corte a área de trabalho, e ajustar o brilho eo contraste. Digitalize as massas de ovos. </li><li> Coloque cada massa de ovos em seu próprio rotulado frasco de vidro de 20 ml para o desenvolvimento e eclosão. </li><li> Atualize a água em frascos de incubação todos os dias para mantê-lo devidamente oxigenado. Faça isso de acordo com números hatchling e tamanho, na seguinte ordem: decantação / escorrendo (sem filhotes), transbordando (início da incubação), e extrair a água com uma pipeta (muitos filhotes). </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Medição e Contagem Eggs <ol><li> Instale o software de análise de imagens ImageJ livremente disponível (NIH, EUA) eo contador de células plugin. </li><li> Abrir ImageJ, bem como um programa de folha de cálculo para transferir os dados. Em seguida, abra a imagem digitalizada de massas de ovos em ImageJ. </li><li> Defina a escala usando a ferramenta de zoom para navegar até a escala milimétrica. Zoom e ajustar a janela de um milímetro para encher a tela. Desenhar uma linha usando a ferramenta de linha entre as duas linhas que indicam um milímetro. Navegue para Analisar e Definir escala. No menu pop-up a opção comprimento medido torna-se visível, ajuste a distância conhecida a 1 ea unidade de comprimento para mm. Marque a caixa Global, e fechar a janela. </li><li> Defina as medidas preferenciais (comprimento, largura, circunferência), navegando para Analisar e definir medidas a seleção de Área e Diâmetro de Feret (comprimento e largura). Clique em OK para confirmar e continuar com a análise da imagem. </li><li> Para medir os ovos, zoom em em um ovo da primeira massa de ovos que precisa ser medido. Recomenda-se um zoom de 800%. Em seguida, usando a ferramenta elíptica desenhar um oval exatamente em torno do ovo, pressione Ctrl + D para desenhar a circunferência na imagem (para evitar que a medição do mesmo ovo duas vezes). Em seguida, pressione Ctrl + M para gravar a medida das propriedades do oval (comprimento, largura, circunferência); uma tela pop-up é aberto exibindo as medições. NOTA: O uso da ferramenta elíptica para medir os ovos não se aplica a todas as espécies. Para as espécies com ovos em forma de maneira não uniforme, use as seleções à mão livre em seu lugar. </li><li> Meça quantos ovos necessários e, em seguida, salvar as medidas planilha xls.. Opcionalmente, copiar os dados diretamente em uma planilha. </li><li> Posteriormente contar os ovos dentro de uma massa de ovos, usando a janela do balcão e colocou a contagem manualmente na planilha. </li><li> Alternativamente, contar os ovos individuais por massa de ovos, com a ajuda da célula contra plug-in. Para isso, vá até Plug-ins,em seguida, analisar e selecionar Contador de células. A janela de contador de células irá aparecer, marque a opção &quot;manter original&quot; caixa e pressione &#39;inicializar&#39;. Uma nova janela do contador aparece, selecione a ferramenta mira da barra de ferramentas e selecione um tipo de contador no menu contador de células. Conte os ovos individuais clicando nos ovos individuais na janela do contador de células. Observe a contagem total ao lado do tipo de contador no menu contador de células. Copie esse número manualmente para uma folha de cálculo ou obter os resultados pressionando Resultados. </li><li> Contagem múltiplas massas de ovos dentro de um evento de contagem, adicionando tipos de contador, se necessário. </li></ol>

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+accessory+gland+protein+reduces+egg+laying+in+a+simultaneous+hermaphrodite.">Male accessory gland protein reduces egg laying in a simultaneous hermaphrodite.</a> PLoS ONE. (5), (2010).</li><li>Nakadera, Y., Swart, E. M., Hoffer, J. N. A., Den Boon, O., Ellers, J., Koene, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receipt+of+seminal+fluid+proteins+causes+reduction+of+male+investment+in+a+simultaneous+hermaphrodite.">Receipt of seminal fluid proteins causes reduction of male investment in a simultaneous hermaphrodite.</a> Current Biology. 24, 1-4 (2014).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo apresentado mostra como coletar fluido seminal e como testar isso de uma forma biologicamente significativa. Embora este procedimento aqui é mostrada utilizando o extracto da glândula da próstata, o efeito de uma única proteína do fluido seminal purificado também podem ser testados seguindo o mesmo procedimento. Obviamente, em tais testes é sempre crucial incluir controlos adequados (tratamentos simulados) para assegurar que o processo e / ou o material de suporte não afecta os parâmetros de perguntas 14,16. Usando este método, que já foi demonstrado que existe uma única proteína de fluido seminal, nomeadamente Ovipostatin, que medeia uma redução na postura dos ovos, 14,16. Esta proteína, produzida na glândula da próstata e transferida durante o acasalamento, juntamente com os espermatozóides, representa o primeiro componente de fluido seminal totalmente caracterizados em hermafrodita simultânea e que, até agora, não mostra qualquer semelhança com as proteínas conhecidas. A constatação de que Ovipostalata reduz a produção de massa de ovos no recipiente corrobora trabalhos anteriores, indicando que as substâncias no sêmen pode influenciar oviposição 13-15. Ao transferir quantidades biologicamente relevantes (ver 3.2 16), pode-se convincentemente demonstrar que é uma proteína de fluido seminal, e não a presença de espermatozóides si, que medeia a redução observada na postura de ovos (Figura 1). Tendo em conta que o recebimento repetido de fluido seminal através de cruzamentos naturais aumenta o investimento por ovo 15, torna-se altamente relevante para quantificar outros parâmetros de postura de ovos. O protocolo apresentado agora fornece os métodos necessários para fazê-lo. Embora nenhum efeito foi encontrado de Ovipostatin sobre o sucesso de eclosão dos ovos postos por o recipiente 16, pode haver outras proteínas do líquido seminal que agem em conjunto com essa proteína. Por isso, os parâmetros que precisam ser quantificados neste contexto - ao lado, que os números de freqüência e de ovos - incluem o tamanho do ovo, hatctempo hing, desenvolvimento e tamanho hatchling hatchling. Além disso, é possível olhar para efeitos sobre outros processos sexo feminino do que a postura de ovos, como o armazenamento de esperma eo uso, bem como a alocação de recursos para a função reprodutiva feminina e masculina 14,17. Claramente, o método apresentado é fundamental para abordar estas questões de seguimento, tanto em Lymnaea stagnalis e em outros caramujos de água doce. Em suma, os experimentos que utilizam este protocolo mostram que transferidos proteínas do líquido seminal afetam o desempenho reprodutivo feminino do destinatário nestes hermafroditas simultâneos. Dado que poucos estudos têm abordado este, é provável que seja muito mais comum em fertilizar internamente hermafroditas que se reflete atualmente na literatura científica. Especialmente quando se percebe que a escolha do companheiro de pré-cópula e competição do esperma foram mostrados a desempenhar um papel importante nestes hermafroditas 14, que highlights o potencial de tais proteínas da glândula acessória masculina de ser sexualmente seleccionado neste sistema. Finalmente, a pesquisa ajuda a apoiar a noção de desenvolvimento que as proteínas do líquido seminal são de igual importância para hermafroditas simultâneos como eles são para espécies separadas-sexuado.

Após a transferência, os espermatozóides são geralmente acompanhadas de líquido seminal produzido por glândulas acessórias masculinas. Enquanto alguns componentes ejaculação desempenham papéis em nutrir e ativar um esperma, outros influenciam a fisiologia feminina, a fim de aumentar o sucesso de fertilização do doador de esperma 2-4. Tais efeitos são especialmente selecionados para, através da seleção sexual, quando uma espécie é altamente promíscuo e tem capacidade de armazenamento de espermatozóides e eficiente digestão de esperma. Sob tais condições, os dadores de esperma competem fortemente para a fertilização de ovos 5. Embora não haja evidência correlacional abundante para a importância de substâncias do líquido seminal para o sucesso de fertilização masculino, prova direta é mais rara e poucos estudos investigou os detalhes da mudança fisiológica e / ou substâncias envolvidas 6. Nas espécies com sexos separados (ou seja, machos e fêmeas; gonochorists) há um modelo de poucos especi bem investigadoes quando se trata de composição de fluido seminal e os seus efeitos. Exemplos incluem a mosca da fruta, Drosophila melanogaster 6, o mosquito da malária, o Anopheles gambiae 7, eo besouro de farinha vermelho, Tribolium castaneum 8. Tais estudos fluidos seminais são muito mais raros quando se trata de espécies que são, simultaneamente, hermafrodita (ou seja, os indivíduos são funcionalmente macho e fêmea ao mesmo tempo), mesmo que este modo de reprodução é comum em todo o reino animal 9. O exemplo mais notável hermafrodita da transferência de uma substância glândula acessória é, provavelmente, o tiroteio dos chamados dardos de amor em caracóis terrestres 2,10, onde a substância é transferido pelo doador de esperma através de injeção hipodérmica 11,12, ou seja, não juntamente com os espermatozóides. Mas há muitos hermafroditas simultâneos que transferem produtos glândula acessória masculina junto com seu esperma,como as espécies modelo usados ​​aqui, a grande lagoa caracol Lymnaea stagnalis. Pesquisa anterior já demonstrado que a recepção do fluido seminal influencia a produção de descendência feminina desta espécie 13-15, e várias das proteínas dos fluidos seminais envolvidos foram identificados 16,17. O objetivo geral deste protocolo, que é uma extensão dos métodos relatados em Koene et al 16, é testar os efeitos das proteínas do líquido seminal em vários parâmetros de postura de ovos em moluscos gastrópodes. Isto é conseguido por meio de dissecção da glândula da próstata (isto é, a glândula acessória masculina que produz o fluido seminal) de caracóis doadores sexualmente isolados a partir de uma cultura de laboratório padronizado. Em segundo lugar, o esperma do doador é coletado a partir das vesículas seminais e soluções de tratamento diferentes são feitas. Subsequentemente, os caracóis do teste são anestesiados e injectados por via intravaginal com uma solução de teste (por exemplo,extrato de próstata glândula sozinho, extrato de glândula da próstata com o esperma, esperma sozinho, meio transportador sozinho). Estes moluscos de teste são então monitorizados durante os dias seguintes, a semanas, sob condições padrão, para gravar a postura de ovos. Massas de ovos são coletados, digitalizados para a contagem e medição de vários parâmetros, e em seguida, colocar em frascos individuais para incubação. Após cerca de duas semanas, os filhotes são contados e digitalizados. Todos os exames, de ambos massas de ovos e filhotes, são então analisados ​​por meio de um pacote de software de análise de imagem livremente disponível. Para este protocolo a cepa de laboratório do grande caracol lagoa, stagnalis Lymnaea, é usado, que é produzido na Universidade VU de Amsterdã. Esta espécie serve como um sistema modelo para investigar perguntas sobre seleção sexual e reprodução em hermafroditas. Relativamente grande tamanho do animal faz com que seja muito acessível experimentalmente. Além disso, uma vez que é usado como uma espécie de modelo em muitos bdisciplinas iological já sabemos muito sobre a biologia básica destes animais. Este método vai ajudar a estudar questões sobre processos de seleção sexual que são mediadas através de proteínas do líquido seminal em geral. Além disso, porque estes são hermafroditas simultâneos, é possível tratar se estas proteínas actuam em formas semelhantes e / ou diferentes, como o fazem na espécie em que os sexos são separados 16,17.

<table><tbody><tr><td>Fish food flakes</td><td>TetraPhyll</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small surgical scissors</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coarse and fine forceps</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml syringe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injection needles (0.3 mm x 13 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5.83 mmol/L CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.76 mmol/L MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>42.69 mmol/L NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37.53 mmol/L KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Two component Silicon</td><td>Sylgard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mm syringes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon tubing (diameter 1 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blunted injection needles (0.3 mm x 13 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes</td><td>Eppendorff</td><td></td><td></td></tr><tr><td>460 ml perforated containers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal leaf puncher (19.6 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spatula/spoon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Laptop) computer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flatbed scanner</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millimeter scale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transferring plates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass tiles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ml glass vials</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

effect of male accessory gland products on egg laying in gastropod molluscs

Na adubação internamente animais, o fluido seminal é geralmente adicionado para os espermatozóides, que formam o sêmen ou ejaculação. Além esperma nutritivo e activação, os componentes no fluido seminal, também pode influenciar a fisiologia feminina para aumentar o sucesso de fertilização do esperma de um doador. Enquanto muitos estudos têm relatado tais efeitos em espécies com sexos separados, poucos estudos têm abordado este em animais simultaneamente hermafroditas. Este protocolo de vídeo apresenta um método para estudar os efeitos do fluido seminal em gastrópodes, usando um caramujo de água doce, simultaneamente, hermafrodita, o grande caracol lagoa stagnalis Lymnaea, como organismo modelo. Enquanto que o procedimento é mostrado utilizando extractos completos de glândula da próstata, os componentes individuais (isto é, proteínas, peptídeos e outros compostos) do fluido seminal pode ser testada do mesmo modo. Efeitos do recebimento dos componentes do ejaculado sobre a postura de ovos pode ser quantificado em termos de frequência de postura de ovos eestimativas mais sutis de desempenho reprodutivo feminino, tais como números de ovos dentro de cada ovo massas. Os resultados mostram que as proteínas do líquido seminal afetar reprodutivo das fêmeas neste hermafrodita simultâneo, destacando sua importância para a seleção sexual.

A Figura 1 mostra a percentagem de animais poedeiras de ovos depois da injecção intra-vaginal de qualquer substância de controlo (solução salina), Ovipostatin, ou Ovipostatin acompanhada com o esperma. N = 15 para cada tratamento; ver Koene et al 16 para obter mais detalhes e estatísticas (Fonte: Figura 3 a partir de 2010 Koene et al, PLoS ONE.).. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51698/51698fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Efeito de Ovipostatin na produção em massa de ovo de Lymnaea stagnalis. O gráfico mostra a percentagem de animais poedeiras de ovos depois da injecção intra-vaginal de qualquer substância de controlo (solução salina), Ovipostatin, ou Ovipostatin acompanhada com o esperma. N = 15 para cada tratamento; ver Koene et al. 2,010 detalhes e estatísticas. Reimpressão com permissão de Koene et al 2010 PLoS ONE 5:. E10117.

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Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Efeito do Masculino Acessório Gland produtos em postura de ovos em gastrópode

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.6K visualizações.  VU University. This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Vídeo: Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American lobsters. Recent work in exploited crustacean populations (crabs and lobsters) suggests that there are circumstances where mature females are unable to achieve their full reproductive potential due to sperm limitation. To examine this possibility in different regions of the American lobster fishery, a reliable and noninvasive method was developed for sampling large numbers of female lobsters at sea. This method involves inserting a blunt-tipped needle into the female&#39;s seminal receptacle to determine the presence or absence of a sperm plug and to withdraw a sample that can be examined for the presence of sperm. A series of control studies were conducted at the dock and in the laboratory to test the reliability of this technique. These efforts entailed sampling 294 female lobsters to confirm that the presence of a sperm plug was a reliable indicator of sperm within the receptacle and thus, mating. This paper details the methodology and the results obtained from a subset of the total females sampled. Of the 230 female lobsters sampled from George&#39;s Bank and Cape Ann, MA (size range = 71-145 mm in carapace length), 90.3% were positive for sperm. Potential explanations for the absence of sperm in some females include: immaturity (lack of physiological maturity), breakdown of the sperm plug after being used to fertilize a clutch of eggs, and lack of mating activity. The surveys indicate that this technique for examining the mating success of female lobsters is a reliable proxy that can be used in the field to document reproductive activity in natural populations.

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters Homarus americanus

Fishery-induced changes to exploited crustacean fisheries, such as the American lobster fishery, could potentially influence their reproductive dynamics, leading to a reduction in mating success. This study&#39;s goal was to develop a noninvasive method for ascertaining the mating success of female lobsters that may be physiologically or functionally mature.

Um método não invasivo para<em&gt; Em situ</em&gt; Determinação do sucesso de acasalamento em fêmeas lagostas americanas (<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American ...

Ambiente

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Obtenção de ovos de Xenopus laevis fêmeas

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Biologia

Mechanical Separation and Protein Solubilization of the Outer and Inner Perivitelline Sublayers from Hen's Eggs

The perivitelline layer that surrounds the egg yolk plays a fundamental role in fertilization, in egg defense, and in the development of the avian embryo. It is formed by two proteinaceous sublayers that are tightly associated and formed by distinct female reproductive organs. Both structures are assumed to have their own functional specificities, which remain to be defined. To characterize the function of proteins composing each sublayer, the first challenge is to establish the conditions that would allow for the mechanical separation of these two intricate layers, while limiting any structural damage. The second step is to optimize the experimental conditions to facilitate protein solubilization from these two sublayers, for subsequent biochemical analyses. The efficiency of this approach is assessed by analyzing the protein profile of each sublayer by Sodium Dodecyl Sulfate-Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), which is expected to be distinct between the two structures. This two-step procedure remains simple; it requires classical biochemical equipment and reagents; and is compatible with further in-depth proteomics. It may also be transposed to other avian eggs for comparative biology, knowing that the structure and the composition of the perivitelline layer has been shown to have species-specific features. In addition, the non-denaturing conditions developed for sublayers separation (step 1) allow their structural analyses by scanning and transmission electron microscopy. It may also constitute the initial step for subsequent protein purification to analyze their respective biological activities and 3D structure, or to perform further immunohistochemical or functional analyses. Such studies would help to decipher the physiological function of these two sublayers, whose structural and functional integrities are determinant criteria of the reproductive success.

This article reports a simple method to isolate the outer and inner perivitelline sublayers of chicken eggs while minimizing structural alteration and to optimize protein solubilization of each sublayer for proteomic analyses.

Separação Mecânica e Solubilização de Proteínas das Subcamadas Perivitelline Externas e Internas dos Ovos de Galinha

The perivitelline layer that surrounds the egg yolk plays a fundamental role in fertilization, in egg defense, and in the development of the avian embryo. ...

Bioquímica

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, respectively, play essential roles in embryonic development and adult homeostasis. Members of the Tgf&#223; family are made as inactive precursors that dimerize and fold within the endoplasmic reticulum. The precursor is subsequently cleaved into ligand and prodomain fragments. Although only the dimeric ligand can engage Tgf&#223; receptors and activate downstream signaling, there is growing recognition that the prodomain moiety contributes to ligand activity. This article describes a protocol that can be used to identify cleavage products generated during activation of Tgf&#223; precursor proteins. RNA encoding Tgf&#223; precursors are first microinjected into X. laevis embryos. The following day, cleavage products are collected from the blastocoele of&#160;gastrula stage embryos and analyzed on Western blots. This protocol can be completed relatively quickly, does not require expensive reagents and provides a source of concentrated Tgf&#223; cleavage products under physiologic conditions.

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

When Transforming Growth Factor &#223; family precursor proteins are ectopically expressed in Xenopus laevis embryos, they dimerize, get cleaved and are secreted into the blastocoele, which begins at the late blastula to early gastrula stage. We describe a method for aspirating cleavage products from the blastocoele cavity for immunoblot analysis.

Análise do Fator de Crescimento Transformador ß Produtos de Decote Familiar Secretados Na Blastocoele de Embriões Xenopus laevis

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

Biologia do Desenvolvimento

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

High Throughput Ensaio para examinar Preferências de postura de Pessoa<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Neurociência

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension and microscopically visualize sperm accumulation around the pipette1. Sperm chemoattraction in vertebrates such as frogs, rodents and humans is more difficult to detect and requires quantitative assays. Such assays are of two major types - assays that quantitate sperm movement to a source of chemoattractant, so-called sperm accumulation assays, and assays that actually track the swimming trajectories of individual sperm.
Sperm accumulation assays are relatively rapid allowing tens or hundreds of assays to be done in a single day, thereby allowing dose response curves and time courses to be carried out relatively rapidly. These types of assays have been used extensively to characterize many well established chemoattraction systems - for example, neutrophil chemotaxis to bacterial peptides and sperm chemotaxis to follicular fluid. Sperm tracking assays can be more labor intensive but offer additional data on how chemoattractancts actually alter the swimming paths that sperm take. This type of assay is needed to demonstrate the orientation of sperm movement relative to the chemoattrractant gradient axis and to visualize characteristic turns or changes in orientation that bring the sperm closer to the egg.
Here we describe methods used for each of these two types of assays. The sperm accumulation assay utilized is called a "two-chamber" assay. Amphibian sperm are placed in a tissue culture plate insert with a polycarbonate filter floor having 12 &mu;m diameter pores. Inserts with sperm are placed into tissue culture plate wells containing buffer and a chemoatttractant carefully pipetted into the bottom well where the floor meets the wall (see Fig. 1). After incubation, the top insert containing the sperm reservoir is carefully removed, and sperm in the bottom chamber that have passed through the membrane are removed, pelleted and then counted by hemocytometer or flow cytometer.
The sperm tracking assay utilizes a Zigmond chamber originally developed for observing neutrophil chemotaxis and modified for observation of sperm by Giojalas and coworkers2,3. The chamber consists of a thick glass slide into which two vertical troughs have been machined. These are separated by a 1 mm wide observation platform. After application of a cover glass, sperm are loaded into one trough, the chemoattractant agent into the other and movement of individual sperm visualized by video microscopy. Video footage is then analyzed using software to identify two-dimensional cell movements in the x-y plane as a function of time (xyt data sets) that form the trajectory of each sperm.

Eggs and the extracellular coatings around eggs frequently release peptides, proteins and small molecules that communicate with sperm to guide them to the egg thereby promoting fertilization. Using frog sperm we describe and compare two classes of assays used to detect sperm chemoattraction &#x2013; sperm accumulation assays and sperm tracking assays.

Dois tipos de ensaios para detecção de quimiotaxia Sapo Sperm

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

A Monte Whole<em&gt; In Situ</em&gt; Método de hibridação para o molusco gastrópode<em&gt; stagnalis Lymnaea</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

Standardizing a Non-Lethal Method for Characterizing the Reproductive Status and Larval Development of Freshwater Mussels (Bivalvia: Unionida)

Actively monitoring the timing, development, and reproductive patterns of endangered species is critical when managing for population recovery. Freshwater mussels are among the most imperiled organisms in the world, but information about early larval (glochidial) development and brooding periods is still lacking for many species. Previous studies have focused on the complex life history stage when female mussels are ready to parasitize host fish, but few studies have focused on the brooding period and timing of larval development. The protocol described here allows researchers to non-lethally evaluate the state of gravidity for female mussels. The results of this study show that this method does not affect a female mussel&rsquo;s ability to stay gravid or become gravid again after sampling has been performed. The advantage of this method may permit its use on federally threatened or endangered species or other populations of high conservation concern. This protocol can be adapted for use on both preserved or live individuals and was tested on a variety of mussel species. The database provided is a repository for a breadth of information on timing of reproductive habits and will facilitate future freshwater mussel research, conservation, and recovery efforts.

Standardizing a Non-Lethal Method for Characterizing the Reproductive Status and Larval Development of Freshwater Mussels Bivalvia: Unionida

Freshwater mussel conservation is dependent on monitoring reproductive patterns and processes of species. This study standardizes a non-lethal protocol for sampling gill contents, characterizing larval development, and providing a digital repository for data collected. This protocol-database package will be an important tool for mussel researchers in recovery of imperiled species.

Padronizar um método não letal para caracterizar o estado reprodutivo e o desenvolvimento larval de mexilhões de água doce (Bivalvia: Unionida)

Actively monitoring the timing, development, and reproductive patterns of endangered species is critical when managing for population recovery. Freshwater ...

Eyestalk Ablation to Increase Ovarian Maturation in Mud Crabs

Mud crabs (Scylla spp.) are commercially important crustacean species that can be found throughout the Indo-West Pacific region. During culture, the induction of ovarian maturation is important to meet the consumer demand for mature mud crabs and hasten seed production. Eyestalk ablation is an effective tool to enhance ovarian maturation in mud crabs. However, there is no standard protocol for the eyestalk ablation of mud crabs. In this study, two eyestalk ablation techniques are described: cauterization (the use of hot metal to ablate the eyestalk of an anesthetized crab) and surgery (the removal of the eyestalk using surgical scissors). Before eyestalk ablation, sexually mature females (CW &#62; 86 mm) were anesthetized using an ice bag (&#8722;20 &#176;C) with seawater. When the water temperature reached 4 &#176;C, the ice bag was removed from the water. Flowing seawater (ambient temperature: 28 &#176;C) was used for recovery from the anesthesia immediately after eyestalk ablation. Mortality did not occur during or after the process of eyestalk ablation. The eyestalk ablation protocol presented here accelerated the ovarian maturation of the mud crabs.

Two eyestalk ablation protocols (i.e., cauterization and surgery&#160;approaches) were performed on anesthetized female crabs. The eyestalk ablation of mud crabs hastened the ripening of ovaries without decreasing the survival rate.

Ablação do Pedúnculo Ocular para Aumentar a Maturação Ovariana em Caranguejos da Lama

Mud crabs (Scylla spp.) are commercially important crustacean species that can be found throughout the Indo-West Pacific region. During culture, the ...

Drosophila Male Accessory Gland Dissection: A Method to Isolate Secondary Cells

Source: Immarigeon, C., et al. <a href="https://www.jove.com/video/60218/" target="_blank">A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the dissection of the accessory glands from male flies and shows an example in which the isolated gland will be dissociated into a single cell suspension.

drosófila Dissecção da glândula acessória masculina: um método para isolar células secundárias

Source: Immarigeon, C., et al. A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands. J. Vis. Exp. (2019).
...

Efeito do Masculino Acessório Gland produtos em postura de ovos em gastrópode

Resumo

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