Nosso protocolo in situ é significativo porque fornece uma maneira simples de visualizar padrões de expressão genética com coloração mínima de fundo. Esta técnica torna um protocolo complicado e demorado relativamente fácil de executar. O Benchtop configurou sugestões e listas de verificação fornecidas, tornando este protocolo ainda mais fácil de executar corretamente e reproduzir.
Embora as técnicas aqui mostradas sejam específicas para o Astyanax mexicanus, ela provavelmente poderia ser adaptada a outros sistemas de indivíduos de tamanho comparativa com pequenos ajustes no protocolo. Primeiro, use fita de laboratório colorida para designar frascos e pipetas para cada gene. Usando uma pipeta Pasteur, classifique os embriões.
Geralmente não há mais de 12 embriões por frasco, uma vez classificados. Em seguida, coloque um banho de água tremendo para 70 graus Celsius. Retire cuidadosamente o metanol nos frascos de embriões ordenados, e substitua-o por 500 microliters de metanol fresco 100%.
Lave os embriões brevemente por cerca de um minuto em um agitador de plataforma. Depois disso, reidratar os embriões em uma concentração crescente de 1x PBS com Tween 20 em um shaker de plataforma como descrito no protocolo de texto. Para começar, coloque uma pequena junta com um fundo de malha no banho de água rotativo que foi pré-aquecido a 70 graus Celsius.
Coloque alíquotas de tampão de hibridização menos e tampão de hibridização mais na junta. Adicione suavemente uma solução PK preparada aos frascos de embriões garantindo que todos os tecidos estejam completamente cobertos de solução. Transfira os frascos para um agitador de plataforma e deixe-os digerir na solução de trabalho proteinase K por aproximadamente 12 minutos.
Depois disso, retire suavemente a solução PK e inunde brevemente o frasco com PBT para diluir o PK restante. Substitua a solução PBT por 500 microliters de PBT fresco e deixe a solução enxaguar no agitador da plataforma por cinco minutos. Em seguida, substitua a solução PBT por 500 microliters de 4%PFA descongelados. Deixe os embriões incubarem na plataforma agitador à temperatura ambiente por 20 minutos.
Para iniciar a pré-hibridização, adicione 500 microliters de tampão de hibridização pré-armado menos solução aos frascos contendo embriões. Coloque cuidadosamente os frascos na junta no banho de água a 70 graus Celsius sem tremer por cinco minutos. Em seguida, desenhe o buffer de hibridização menos solução e inunde os frascos com 500 microliters de buffer de hibridização pré-rebocada mais solução.
Coloque os frascos de volta na junta no banho de água e incubar com agitação por quatro horas ou durante a noite. Para começar a hibridização, desenhe o tampão de hibridização mais fora dos frascos e substitua-o por 500 microliters de buffer de hibridização pré-armado fresco plus. Adicione cuidadosamente dois microliters de sonda RNA a cada frasco e gire suavemente para garantir a distribuição uniforme da sonda.
Incubar no banho de água a 70 graus Celsius durante a noite enquanto treme a 40 RPM. Para começar, prepare os tubos de microcentrifuuge rotulados tampão de hibridização, além do gene de interesse da sonda RNA, conforme descrito no protocolo de texto. Defina dois tubos cônicos de 15 mililitros e adicione 0,2 gramas de reagente bloqueador e 10 mililitros de MABT.
Coloque ambos os tubos em uma batedeira de nozes até que o reagente esteja completamente dissolvido na solução. Usando uma pipeta pasteur de vidro, desenhe o tampão de hibridização mais e a solução da sonda e coloque-o em um tubo de microcentrifuge estéril rotulado. Armazene este tubo no congelador a menos 20 graus Celsius para uso futuro.
Adicione cuidadosamente 500 microliters do fotrato de sódio salino quente e tampão de hibridização menos diluições. Incubar em soluções sequenciais por 10 minutos cada no banho de água agitada e, em seguida, à temperatura ambiente em um agitador de plataforma, conforme descrito no protocolo de texto. Após a última incubação, substitua o 100% PBT de cada frasco por 500 microliters de MABT.
Repita este processo duas vezes por cinco minutos cada. Primeiro, remova o MABT de cada frasco e dilua-o com a solução de bloqueio pré-x de um dos tubos cônicos de 15 mililitros. Coloque os dois frascos na batedeira por quatro horas em temperatura ambiente.
Adicione dois microliters dos fragmentos de anticorpos ao segundo tubo de solução de bloqueio preparada e brevemente vórtice. Em seguida, encha cada frasco quase completamente com solução de bloqueio e coloque-os em uma batedeira de nozes durante a noite em uma geladeira a quatro graus Celsius. Para começar, prepare um frasco de estoque de 10% de NGS no MABT.
Substitua a solução de bloqueio em cada frasco por 500 microliters desta solução NGS. Incubar à temperatura ambiente no agitador da plataforma por 25 minutos. Depois disso, substitua a mistura NGS por 500 microliters de 100% MABT.
Incubar na plataforma shaker à temperatura ambiente por 30 minutos. Repita esta lavagem mais 11 vezes ao longo do dia, a cada 30 minutos. Em seguida, encha cada frasco com 100% MABT e coloque-os em uma batedeira durante a noite em uma geladeira a quatro graus Celsius.
Primeiro, substitua o MABT em cada frasco por um mililitro de tampão AP e deixe-o lavar por cinco minutos. Repita esta lavagem duas vezes para remover completamente o MABT. Em seguida, substitua o buffer AP por um mililitro de tampão AP fresco contendo 3,5 microliters de BCIP e 4,5 microliters de MBT.
Substitua-o por uma mistura fresca de tampão AP contendo o BCIP e o MBT a cada hora até que a reação esteja completa, certificando-se de monitorar a reação de perto e verificar a cada 15 minutos até que o nível desejado de coloração seja alcançado. Pare a reação de coloração enxaguando os embriões em uma concentração crescente de 1X PBT no buffer AP, conforme descrito no protocolo. Enxágüe os embriões em aproximadamente cinco mililitros de 100% PBT em uma batedeira de nozes até que a coloração mínima desejada seja atingida.
Quando a lavagem estiver completa, lave os embriões em 500 microliters de PBS estéreis em um agitador de plataforma e poste as amostras conforme descrito no protocolo de texto. Depois de enxaguar os embriões, coloque-os em quatro mililitros de PBS 100% estéreis e, se necessário, armazene-os a longo prazo a quatro graus Celsius. Neste estudo, as amostras embrionárias de Astyanax são rotuladas para análise de expressão genética de alta qualidade.
Este processo foi implementado com sucesso tanto em embriões de peixes-caverna pachon quanto embriões de peixes superficiais. Embriões de peixe-caverna rotulados para expressão Sox9 demonstram rotulagem clara nos arcos ramificais em desenvolvimento e na barbatana peitoral. Observe que a coloração está praticamente ausente no saco de gema ou nos somites em desenvolvimento no flanco.
Da mesma forma, a expressão Tfap2a é evidente nas porções da cabeça em desenvolvimento como células de crista neural de migração precoce ao longo da região do flanco dorsal do embrião. O terceiro gene apresentado para embriões de peixe-caverna, Phf20a, é visto nas porções do mesoderm somático e da cabeça posterior que estão destinados a dar origem ao tecido ósseo. Embriões de peixes superficiais rotulados para CXCR mostram rotulagem positiva em regiões isoladas da cabeça e flanco, bem como algumas células individuais sobreocendo o saco de gema.
O gene Adcyap1a é expresso em regiões do sistema nervoso central, incluindo células pituitárias. Observe a expressão altamente específica em agrupamentos bilaterais emparelhados de células no aspecto dorsal do embrião, bem como uma região maior de expressão midline. O último gene examinado para embriões de peixes-caverna, Sox10, é evidente como um marcador inicial de crista neural nos lados esquerdo e direito do embrião dorsal.
Depois de completar in situ, normalmente imagem nossos resultados usando microscopia leve. É melhor fazer isso dentro de duas semanas após a conclusão, a fim de evitar a degradação da coloração.
