Name: in vivo biosensor tracks non-apoptotic caspase activity in drosophila
Uploaded: 2016-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
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Agradecemos Polan Santos e Darren Obbard para Drosophila ilustrações Fig. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena para a utilização do insetário JHMRI. Este trabalho foi apoiado pela irmandade Fundação Life Science Research (HLT), University Grants Comissão do Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF) e NIH concede NS096677, NS037402 e NS083373 (JMH). Ho Lam Tang é um Shurl e Kay Curci Fundação Fellow da Fundação de Pesquisa Ciências da Vida.

1. Preparação de Moscas CaspaseTracker <ol><li> Para preparar CaspaseTracker (DQVD) voa para experimentos, executar esta cruz: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP; UAS-FLP; Ubi&gt; Parar&gt; GFP-NLS), através da transferência de 7-10 fêmea virgem (ou masculino) moscas que transporta o substrato da caspase-biossensor mCD8 DIAP1-Gal4 dirigido pelo promotor de ubiquitina de 35 em conjunto com o mesmo número do macho (ou fêmea) G-moscas de rastreio, que têm o segundo equilibrador cromossoma CYO para evitar letalidade da combinação homozigótica do G- TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP, e Ubi&gt; Parar&gt; GFP-NLS) 34. Lugar voa num frasco de alimentos frescos com pasta de fermento fresco como fonte de proteína. </li><li> Incubar arquivos a 18 ° C durante 5 a 7 dias (máximo de 2 semanas) e em seguida, remover o pai voa a partir do frasco para evitar a superlotação com a nova descendência, e para configurar novos frascos de melhoramento. </li><li> Continuar a incubação a 18 ° C até que a descendência voa eclose. Seleccione a não-CYO [não cURLy asa] progênie do genótipo correto de CaspaseTracker, que são transgénicos para CaspaseTracker e G-35 oligoelementos. </li><li> Ao mesmo tempo, gerar controlo parental moscas W118 não-transgênicas e caspase-insensitive (DQVA) voa em paralelo para verificar a RFP CaspaseTracker específico e fluorescência da GFP. </li><li> Realizar genotipagem por PCR para confirmar os ficheiros com CaspaseTracker utilizando os primers: 5&#39;-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3&#39;-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, produzindo um produto de 3897 pb. Para genotipagem do loci G-Trace, use os seguintes primers para GFP (474 ​​pb), 5&#39;-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G, 3&#39;-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; para RFP (258 pb), 5&#39;-GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG, 3&#39;-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; e para Flpase (655 pb), 5&#39;CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3&#39;-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TTG TCT CTG TCA C. Para genotipagem Gal4 no vector pUWR (554 pb), 5&#39;-GAA GCA CAC CTT CGC ATC GCT CAGTCA CGC, 3&#39;-TGG TGG AAT GGT ACG TCT AGA. </li></ol> 2. Preparação de tecidos, Coloração e montagem <ol><li> Para dissecções mosca, evitar tecidos dissecados de degola para pontas de plástico para pipetas e tubos de centrífuga, dicas revestimento e tubos com albumina 1% de soro bovino (BSA) dissolvidos na água. </li><li> Dissecar voa sobre uma almofada de silicone usando uma pinça. <ol><li> Para evitar danificar as pontas de pinça sobre uma superfície rígida quando se realiza a dissecção de tecidos, realizar dissecção sobre uma superfície de silício. Para fazer placas de silicone de dissecação, derreta o silício no kit comercial de acordo com as instruções do fabricante (lista de materiais). Depois de derreter o silicone, adicionar 3 a 4 ml de uma cultura de tecido de diâmetro prato de 60 mm. pratos de silício pode ser reutilizado. </li><li> Anestesiar uma mosca com CO 2, e transferi-lo para uma placa de silicone com 1 ml de PBS frio. Introduzir o CO 2 para um frasco contendo a mosca usando uma zarabatana, e depois transferir a mosca anestesiados toa Pad que tem uma fonte de CO 2. </li><li> Utilizar um par de pinças para segurar a cabeça da mosca, e um segundo par de fórceps para puxar o tórax na direcção oposta para desligar a cabeça mosca do corpo de cobertura, sem danificar a ligação entre a cabeça e o intestino anterior. </li><li> Use 2 pares de pinças para remover as asas e pernas do tórax. </li><li> Utilizar um par de pinças para segurar o tórax, e um outro par de fórceps para puxar o abdómen para separá-lo do tórax de novo sem danificar a ligação entre o intestino anterior e do intestino médio. </li><li> Dissecar órgãos internos incluindo cérebro, intestino, túbulos de Malpighi e os ovários como demonstrado anteriormente. 39-41 </li><li> Remova todas as peças do cutícula e os corpos gordos com uma pinça como estes tecidos produzir forte autofluorescência. Paciência e prática são necessários para preparar um sistema de órgão completo, como mostrado. </li></ol></li><li> Transferir tecidos dissecados para 1,5 tubos de centrífuga ml e corrigir tecidos with 0,5 ml de paraformaldeído a 4% em PBS (solução salina tamponada com fosfato), à TA, durante 20 a 30 minutos com rotação no escuro para evitar RFP e GFP de branqueamento em tecidos. Evite fixação prolongada que pode comprometer os resultados da coloração subsequentes. </li><li> Remover o paraformaldeído por pipetagem suave e lavagem 3 vezes com 0,5 ml de PBST (PBS + 0,1% de Triton X-100) à TA. </li><li> Permeabilizar as tecidos com 0,5 ml de PBST a 4 ° C durante a noite com agitação suave. incubações mais curtos pode causar incompletos permeabilização e coloração compromisso resultados. <ol><li> Se é necessário para reduzir a coloração de fundo, considere incubando tecidos em 0,5 ml de PBST com 1% de BSA, em vez de PBS. </li></ol></li><li> Lavar os tecidos por 3 vezes com 0,5 ml de PBST. </li><li> Para corar núcleos e actina filamentosa (F-actina), aplicam-se 0,5 ml de PBST com 10 ug / ml de Hoechst 33342 corante azul nuclear e 0,3 uM Alexa Fluor 633 faloidina F-actina mancha e incubar em simultâneo com os tecidos durante 1 h, à RT wom rotação suave no escuro. Evitar manchar prolongado como este vai aumentar o fundo. <ol><li> Para a imunocoloração, incubar fixadas e permeabilizadas tecidos com 0,1% de Triton X-100 em 0,5 mL de PBS durante a noite a 4 ° C, mancha com diluição 1: 100 de anticorpo anti-elav ou com diluição 1: 200 de anti-caspase-3 durante a noite a 4 ° C (300 mL). Seguir por o anticorpo secundário correspondente diluída 1: 100 e incubar durante 1 a 3 h à TA. Veja Lista de Materiais para obter informações anticorpo específico. </li></ol></li><li> Lavar os tecidos 3 vezes, cada uma durante 5 minutos em 0,5 ml de PBST com rotação suave. </li><li> Com uma pipeta, remover todos PBST, e, em seguida adicionar 200 uL de montagem agente anti-branqueador (ver materiais) para cobrir completamente os tecidos durante 1-3 h à TA ou a 4 ° C durante a noite. tecidos que têm óptimas totalmente absorvidas o agente de montagem irá afundar para o fundo do tubo. </li><li> Pré-limpar a lâmina de vidro com água ou com etanol a 70% e transferir os tecidos com agente de montagem para os Glass slide. </li><li> Com cuidado, coloque uma lamela de vidro sobre os tecidos. Aplique vaselina para a lâmina de vidro ea tampa de deslizamento para evitar a destruição do tecido por overcompression. Remover agente de montagem extra com papel de seda. </li><li> Selar a lamela, aplicando unha polonês ao longo das bordas da lamínula para evitar vazamento de agentes de montagem dos tecidos. </li></ol> 3. Microscopia Confocal <ol><li> Use um confocal epi-fluorescência microscópio invertido. No entanto, microscópios up-direito pode ser também utilizado. Para tecidos de imagem usando ladrilhos, manter a temperatura ambiente estável para evitar desvio de foco e deslocamento do plano xy devido à expansão e contração térmica dos componentes. sistemas de controle ambiental e sistemas de compensação foco deriva ajudar a evitar esse problema devido à perda de termo-equilíbrio do sistema de microscópio. </li><li> Coloque o slide no palco do microscópio. Tome algumas imagens de teste utilizando baixa resolução (125 x 125 pixels) de umd determinar o número apropriado de peças necessárias para cobrir toda a região de interesse (ROI). </li><li> Definir o sistema de digitalização microscópio para capturar imagens com resolução de digitalização, como 500 x 500 pixels. Selecione o objetivo, como um 20X NA 0.8 ou 63X NA 1.4 objetivo Plan-Apochromat para analisar tecidos através de lamelas de vidro, de modo que cada uma das imagens (telhas) sobrepõe-se em 20% de todos os lados. </li><li> Configurar a sequência de imagens de maior para o menor comprimento de onda de excitação, como a luz de comprimento de onda provoca menor de foto-branqueamento. A sequência de maior para o menor comprimento de onda de excitação é: (i) 633 nm para faloidina F-actina e para anticorpos para as caspases activadas, (ii) 561 nm para RFP, (III) a 488 nm para GFP, e (iv) a 405 nm durante mancha nuclear Hoechst. </li><li> Durante a gravação, minimizar a exposição das células à excitação laser fluorescente durante o processo de imagiologia para evitar a foto-branqueamento, reduzindo a intensidade do laser para obter imagens de alta qualidade dos tecidos. </li><li> Depois que eumagos são recolhidas, fundir as imagens usando o software microscópio. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Aqui ilustramos da construção e interiores funcionamento do CaspaseTracker que facilitam a detecção de atividade de caspase basal generalizada nos tecidos saudáveis. Os passos críticos para detectar a actividade de caspase não apoptótica in vivo são os seguintes: 1) a geração de moscas com o transgene biossensor, 2) verificar a função repórter específicos da caspase com controlos adequados, 3) praticando técnicas de dissecação para observar todos os sistemas de órgãos internos de adulto ...

As caspases são proteases de cisteína que medeiam a morte celular por apoptose por clivagem de muitas proteínas intracelulares após resíduos aspartato-chave. Por exemplo, caspases iniciadoras activar as caspases efectoras, as nucleases de ADN desreprimir, componentes do citoesqueleto e clivam alterar a composição lipídica das membranas celulares para desmantelar rapidamente as células e estimular o seu reconhecimento por células e imersão que eliminam os cadáveres célula vizinha. Estima-se 4/1 que milhares de milhões de células morrem por dia no corpo humano, e a apoptose é um importante mecanismo de morte de células tumorais induzida por quimioterapia. 5 um conjunto diferente de caspases podem causar morte celular por processos não apoptóticas distintas para estimular a imunidade inata. 6 Portanto, maioria das pesquisas sobre caspases tem se concentrado em suas funções pró-extermínio. Curiosamente, os primeiros indícios no campo revelou que os mesmos caspases responsáveis ​​pela morte celular promovendo também têm não-morte funções. Estudos pioneiros demonstraram que as caspases estão envolvidas em diversas funções celulares em células saudáveis, incluindo a regulação da proliferação e migração celular durante o desenvolvimento embrionário. 7-9 As caspases são necessários para a individualização espermátide em Drosophila 10,11, para o bloqueio de uma via de morte celular alternativa necroptotic em ratinhos 12,13, e para o processamento de microARN em C. elegans. 14,15 Em talvez o mais longevo células, neurônios, caspases e outra maquinaria apoptótica estão implicados na regulação da actividade neuronal pela poda terminações sinápticas, um processo que se acredita ser essencial reforçar outras sinapses de aprendizagem e memória. 16- 18 é possível que as caspases facilitar poda sináptica por um tipo de mini-apoptose de pequenas projecções neuronais sem morte de células inteiras. 19 No entanto, as caspases podem ter funções alternativas não relacionados com acontecimentos de apoptose semelhante. 20,21 papel duplos na vida e morte não são exclusivos para caspases; BCL-2 proteínas da família e citocromo c têm papéis em energetics celulares em células saudáveis, mas também são parte da via apoptótica núcleo que é ativado por muitos tipos de stress celular. 22-25 Embora não esteja provado, parece lógico que a evolução tem ligado dia -jobs to death-empregos dentro das mesmas moléculas para assegurar a eliminação atempada das células impróprias ou indesejáveis. Actualmente, os mecanismos moleculares da actividade de caspase não apoptóticas não são compreendidas, e o grau de actividade de caspase não apoptótica, durante o desenvolvimento embrionário e em tecidos adultos, também não é conhecido. Um grande desafio é a dificuldade em distinguir dia-empregos da morte-empregos de caspases. Em contraste com a apoptose e pyroptosis, quando a actividade de caspase é amplificada por uma cascata proteolítica, é esperado que os trabalhos de dia-caspases para ocorrer a níveis muito mais baixos de actividade enzimática, provavelmente abaixo de detecção disponível por muitos Technologies. Antes do trabalho aqui apresentado, outros desenvolveram uma variedade de biossensores de caspase para fins diferentes. Os biossensores SCAT (por exemplo, ECFP-DEVD-Vénus) detectar rapidamente a actividade da caspase em tempo real e em células em cultura de tecidos animais usando FRET 26,27. Após a clivagem de caspase, a porção da GFP dirigido ao núcleo de Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) sofre relocalização subcelular em poucos minutos quando o seu plasma membrana de tirante é clivada por caspases. 28 do mesmo modo, ApoAlert-pCaspase3-sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) relocalizes a partir do citosol para o núcleo por clivagem de caspase. 29,30 Mais recentemente, o cromóforo em iCasper foi habilmente manipulada para fluorescência quando clivada por caspases, que permite a detecção da actividade de biossensor em tempo real, nos neurónios de embriões de Drosophila, mas principalmente em associação com o desenvolvimento da morte celular. morte 31 de caspase-dependente de neurónios olfactivos durante o envelhecimento estava demonstavaliado por imuno-detecção da forma clivada da caspase-biossensores de CPV (por exemplo, mCD8-PARP-Vénus). 32,33 modo importante, a forma activada da caspase-3 foi detectada na ausência de morte celular por imunocoloração sensível nas espinhas de neurónios em cultura, e no soma utilizar a fluorescência dependente da caspase do corante repórter CellEvent nuclear, mas foram encontradas dificuldades devido a foto-toxicidade, embora a morte celular foi atrasada até depois da eliminação da coluna. 19 Assim, novos biossensores caspases são necessários para detectar e rastrear células com atividade caspase basal in vivo. Para superar essas dificuldades, geramos um romance dupla biossensor cor caspase, designado CaspaseTracker. Esta estratégia combina uma versão modificada da Drosophila sensível caspase-Apoliner biossensor 28 de Drosophila com o G-rastreio do sistema de recombinase FRT 34 para etiquetar de forma permanente e acompanhar as células in vivo. &lt;sup&gt; 35 O sistema G-TRACE Gal4-activado permite níveis muito baixos de caspases para ativar CaspaseTracker, resultando na expressão RFP no citoplasma e permanente expressão GFP nuclear-alvo em qualquer célula que já experimentou a atividade da caspase 35 Este sistema pode rotular. células ao longo da vida em animais inteiros utilizando Drosophila melanogaster, um sistema modelo tratável e amplamente usados para o estudo de caspases e morte celular 36-38.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Consumables and Reagents&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Products</td><td>H-1000</td><td>Mounting medium</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Ted Pella</td><td>#505 (110mm, #5)</td><td>Dumont tweezer biology grade, stainless steel</td></tr><tr><td>Hanging Drop Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565B</td><td>Glass slides</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Molecular Probes</td><td>H1399</td><td>DNA stain</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 Phalloidin</td><td>Molecular Probes</td><td>A22284</td><td>Actin stain</td></tr><tr><td>Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>Antibody Registry ID:&amp;nbsp; AB_528218&amp;nbsp;</td><td>Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV</td></tr><tr><td>Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#9661</td><td>Stain for active fragment of caspase-3</td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade reagent</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td>to preserve fluorophores&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36961</td><td>to preserve fluorophores&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SylGard 182 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning&amp;nbsp;</td><td>Product code: 0001023934</td><td>for dissection plates</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>LSM780 confocal microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; dissection</td></tr><tr><td>AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150&amp;nbsp;W</td><td>AmScope</td><td>WBM99316</td><td>Light source</td></tr></tbody></table>

in vivo biosensor tracks non-apoptotic caspase activity in drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

Existem dois componentes principais que permitem CaspaseTracker para detectar a actividade da caspase em células saudáveis normais (Figura 1A). O primeiro deles é um polipéptido de caspase-clivável 146 aminoácidos modelada após a caspase biossensor Apoliner (Figura 1b) 28 Este polipéptido é derivado de DIAP1 (inibidor de Drosophila de apoptose), contendo um único local de caspase de ocorrência natural que é clivado durante...

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In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Para detectar células saudáveis em animais inteiros que contêm baixos níveis de actividade de caspase, o biossensor altamente sensível designado CaspaseTracker foi gerado para Drosophila. biossensor actividade dependente de caspase é detectado em células saudáveis ​​de vida longa ao longo dos órgãos internos dos animais adultos criados em condições optimizadas na ausência de estímulos de morte.

In Vivo Biosensor Tracks apoptótica não-Caspase Atividade em Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

9.0K visualizações.  Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health.  Para detectar células saudáveis em animais inteiros que contêm baixos níveis de actividade de caspase, o biossensor altamente sensível designado CaspaseTracker foi gerado para Drosophila. biossensor actividade dependente de caspase é detectado em células saudáveis ​​de vida longa ao longo dos órgãos internos dos animais adultos criados em condições optimizadas na ausência de estímulos de morte. 

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Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first to be activated in these pathways. This group includes caspase-2, -8, and -9, as well as the inflammatory caspases, caspase-1, -4, and -5. The initiator caspases are all activated by dimerization following recruitment to specific multiprotein complexes called activation platforms. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is an imaging-based approach where split fluorescent proteins fused to initiator caspases are used to visualize the recruitment of initiator caspases to their activation platforms and the resulting induced proximity. This fluorescence provides a readout of one of the earliest steps required for initiator caspase activation. Using a number of different microscopy-based approaches, this technique can provide quantitative data on the efficiency of caspase activation on a population level as well as the kinetics of caspase activation and the size and number of caspase activating complexes on a per cell basis.

This protocol describes caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC); an imaging-based method that can be used to visualize induced proximity of initiator caspases, which is the first step in their activation.

Iluminando os caminhos para a ativação de Caspase usando fluorescência Bimolecular complementação

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

Bioquímica

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators and executioners of apoptosis, the most studied form of programmed cell death. Apoptosis occurs during developmental processes and is a necessary event in tissue homeostasis. Pyroptosis is another form of cell death that utilizes caspases and is a critical process in activating the immune system through the activation of the inflammasome, which results in the release of members of the interleukin-1 (IL-1) family. To assess caspase activity, target substrates can be assessed. However, sensitivity can be an issue when examining single cells or low-level activity. We demonstrate how a fluorogenic substrate can be used with a population-based assay or single-cell assay by flow cytometry. With proper controls, different amino acid sequences can be used to identify which caspases are active. Using these assays, the simultaneous loss of the inhibitors of apoptosis proteins upon tumor necrosis factor (TNF) stimulation has been identified, which primarily induces apoptosis in macrophages rather than other forms of cell death.

The present protocol describes two methods to measure caspase activity through a fluorogenic substrate using flow cytometry or a spectrofluorometer.

Medindo a atividade da caspase usando um ensaio fluorométrico ou citometria de fluxo

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and inflammatory intractable diseases. We herein developed an experimental method to investigate phagocytosis quantitatively using the fruit fly Drosophila, in which the gene network controlling engulfment reactions is evolutionally conserved from mammals. In order to accurately detect and count engulfing and un-engulfing phagocytes using whole animals, Drosophila embryos were homogenized to obtain dispersed cells including phagocytes and apoptotic cells. The use of dispersed embryonic cells enables us to measure in vivo phagocytosis levels as if we performed an in vitro phagocytosis assay in which it is possible to observe all phagocytes and apoptotic cells in whole embryos and precisely quantify the level of phagocytosis. We confirmed that this method reproduces those of previous studies that identified the genes required for the phagocytosis of apoptotic cells. This method allows the engulfment of dead cells to be analyzed, and when combined with the powerful genetics of Drosophila, will reveal the complex phagocytic reactions comprised of the migration, recognition, engulfment, and degradation of apoptotic cells by phagocytes.

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

We herein describe a phagocytosis assay using the dispersed embryonic cells of Drosophila. It enables us to easily and precisely quantify in vivo phagocytosis levels, and to identify new molecules required for the phagocytosis of apoptotic cells.

Ensaio de fagocitose para células apoptóticas em Drosophila Embriões

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

Imunologia e Infecção

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death processes that are generally assumed to be intrinsically irreversible. Promoting anastasis could in principle rescue or preserve injured cells that are difficult to replace such as cardiomyocytes or neurons, thereby facilitating tissue recovery. Conversely, suppressing anastasis in cancer cells, undergoing apoptosis after anti-cancer therapies, may ensure cancer cell death and reduce the chances of recurrence. However, these studies have been hampered by the lack of tools for tracking the fate of cells that undergo anastasis in live animals. The challenge is to identify the cells that have reversed the cell death process despite their morphologically normal appearance after recovery. To overcome this difficulty, we have developed Drosophila and mammalian CaspaseTracker biosensor systems that can identify and permanently track the anastatic cells in vitro or in vivo. Here, we present in vivo protocols for the generation and use of the CaspaseTracker dual biosensor system to detect and track anastasis in Drosophila melanogaster after transient exposure to cell death stimuli. While conventional biosensors and protocols can label cells actively undergoing apoptotic cell death, the CaspaseTracker biosensor can permanently label cells that have recovered after caspase activation - a hallmark of late-stage apoptosis, and simultaneously identify active apoptotic processes. This biosensor can also track the recovery of the cells that attempted other forms of cell death that directly or indirectly involved caspase activity. Therefore, this protocol enables us to continuously track the fate of these cells and their progeny, facilitating future studies of the biological functions, molecular mechanisms, physiological and pathological consequences, and therapeutic implications of anastasis. We also discuss the appropriate controls to distinguish cells that undergo anastasis from those that display non-apoptotic caspase activity in vivo.

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis is technically challenging to detect in vivo because the cells that have reversed the cell death process can be morphologically indistinguishable from normal healthy cells. Here we describe protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis in live animals by using our newly developed in vivo CaspaseTracker biosensor system.

Detecção de Anastasis na Vivo por CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

Medicina

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

A longo prazo no Vivo controle da dinâmica celular inflamatória dentro drosófila pupas

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

Na Vivo Único-molécula de rastreamento no Terminal do nervo Motor pré-sináptica da drosófila

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Neurociência

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imagens ao vivo de Apuramento celular por apoptose durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogênese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Biologia

In Vitro Cleavage Assays using Purified Recombinant Drosophila Caspases for Substrate Screening

Caspases are very specific cell death proteases that are involved in apoptotic and non-apoptotic processes. While the role of caspases during apoptosis has been very well defined and many apoptotic proteolytic substrates of caspases have been identified and characterized, the role of caspases for non-apoptotic processes is not well understood. In particular, few non-apoptotic substrates of caspases have been identified thus far. Here, in order to facilitate the identification and characterization of potential caspase substrates, a protocol that allows the testing of candidate substrates in caspase cleavage assays in vitro is described. This protocol includes the production and purification of recombinant caspase proteins, the production of the candidate substrates either recombinantly or in a cell-free expression system, and the actual in vitro cleavage reaction followed by SDS-PAGE and immunoblotting. This protocol is tailored for the Drosophila caspases Dronc and Drice but can easily be adapted for caspases from other organisms, including mammals.

In Vitro Cleavage Assays using Purified Recombinant Drosophila Caspases for Substrate Screening

Here we present a protocol to express and purify recombinant Drosophila caspases Dronc and Drice, and their use in in vitro cleavage assays.

In vitro Ensaios de Clivagem usando Caspases de Drosophila Recombinante Purificada para Triagem de Substrato

Caspases are very specific cell death proteases that are involved in apoptotic and non-apoptotic processes. While the role of caspases during apoptosis ...

Bioengenharia

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

Visualização de Caspases Inflamatórias Induzidas proximidade em macrófagos derivados de monócitos humanos

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important checkpoints of apoptosis, including mitochondrial fragmentation, release of mitochondrial cytochrome c into the cytosol, activation of caspases, chromatin condensation, DNA damage, nuclear fragmentation, plasma membrane blebbing, cell shrinkage, cell surface exposure of phosphatidylserine, and formation of apoptotic bodies. Anastasis can occur when apoptotic stimuli are removed prior to death, thereby allowing dying cells to reverse apoptosis and potentially other death mechanisms. Therefore, anastasis appears to involve physiological healing processes that could also sustain damaged cells inappropriately. The functions and mechanisms of anastasis are still unclear, hampered in part by the limited tools for detecting past events after the recovery of apparently healthy cells. Strategies to detect anastasis will enable studies of the physiological mechanisms, the hazards of undead cells in disease pathology, and potential therapeutics to modulate anastasis. Here, we describe effective strategies using live cell microscopy and a mammalian caspase biosensor&#160;for identifying and tracking anastasis in mammalian cells.

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

Estratégias para Rastreamento Anastasis, uma célula de sobrevivência Fenômeno que reverte apoptose

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...